چاپ صفحه |  صفحه نخست سامانه |  مجری و همکاران |  اطلاعات تفضیلی |  دانلود | علوم پزشکی زاهدان |
| کد طرح | 5422 |
| عنوان فارسی طرح | بررسی ژنوتیپ آلل های K1 و 3D7 ناحیه N-terminal پروتئین سطحی مروزوئیت 3 انگل پلاسمودیوم فالسیپاروم مالاریا (PfMSP-3) به روش Nested-PCR در منطقه جنوب شرقی ایران |
| عنوان لاتین طرح | Genotyping of K1 and 3D7 alleles in N-terminal Region of Merozoit Surface Protein (MSP)-3 of Plasmodium falciparum- malaria using Nested-PCR in South-East of Iran |
| نوع طرح | |
| محل اجرای طرح | مرکز تحقیقات بیماریهای عفونی و گرمسیری |
| رسته مطالعاتی | مقطعی- توصیفی |
| دانشکده/مرکز | دانشکده پزشکی زاهدان |
| زمان اجرا -روز |
| نام و نامخانوادگی | سمت در طرح | نوع همکاری | درجهتحصیلی | پست الکترونیک |
|---|---|---|---|---|
| سعید محمدی | همکار | کارشناس ارشد | saeed.mohammadi6578@yahoo.com | |
| عادل ابراهیم زاده | مجری اول | دکترا(p.h.d) | ||
| منصور دبیرزاده | مجری دوم | |||
| علیرضا انصاری مقدم | مشاور | دکترای تخصصی | ansariaLireza@yahoo.com |
| عنوان | متن |
|---|---|
| خلاصه طرح به فارسی | بررسی ژنوتیپ آلل های K1 و 3D7 ناحیه N-terminal پروتئین سطحی مروزوئیت 3 انگل پلاسمودیوم فالسیپاروم مالاریا (PfMSP-3) به روش Nested-PCR در منطقه جنوب شرقی ایران |
| خلاصه طرح به لاتین | Genotyping of K1 and 3D7 alleles in N-terminal Region of Merozoit Surface Protein (MSP)-3 of Plasmodium falciparum- malaria using Nested-PCR in South-East of Iran |
| بيان مسئله تحقيق/اهمیت پژوهش | مالاریا ، یکی از عمده ترین بیماری های انگلی شایع در مناطق گرمسیری دنیا است.با بیش از 300 تا 500 میلیون مورد جدید در هر سال،مالاریا مسئول مرگ بین 1-3 میلیون نفر در سرتاسر جهان می باشد که بیش از 90% این موارد مربوط به کودکان است(1و2). این بیماری منتقله از حشره توسط چهار گونه از انگلهای مالاریا به نام پلاسمودیوم فالسیپاروم، پلاسمودیوم ویواکس، پلاسمودیوم مالاریه و پلاسمودیوم اووال ایجاد می شود، که از بین چهار گونه ای که در انسان ایجاد عفونت می کنند،خطرناک ترین گونه پلاسمودیوم فالسی پاروم می باشد که عامل اصلی مرگ و میر است. پلاسمودیوم فالسی پاروم مسئول مرگ و میر بیش از 0.9 میلیون نفر در هر سال است ، که 89 درصد این موارد در کودکان زیر 5 سال و زنان بارداری اتفاق می افتد که در مناطق اندمیک مالاریا زندگی می کنند.(3و4) حدود 10 تا 30 درصد از کودکانی که به مالاریای سخت فالسیپاروم مبتلا می گردند، تلف می شوند و عده ای هم اختلالات عصبی دائمی پیدا می کنند.(5) تلفات و زیان های اجتماعی –اقتصادی ناشی از مالاریا در مناطق مالاریا خیز سبب عدم توسعه، فقر و عقب ماندگی در تعدادی از کشورها شده است. در بعضی از کشورها که بر اثر عملیات مبارزه با مالاریا انتقال این بیماری قطع شده و یا کاهش یافته بود، مالاریا دوباره ظاهر شده و بیماری در حال گسترش به مناطق جغرافیایی جدید است. (5و6) علی رغم تلاشهای گسترده برای کنترل و پیشگیری مالاریا،عوامل متعددی شامل مقاومت پشه های ناقل به حشره کش ها،عدم تولید واکسنهای کار آمد وگسترش سریع سویه های مقاوم به درمان ، وضعیت مالاریا در جهان را وخیم نموده است.(7) تنوع ژنتیکی موجود در ایزوله های پلاسمودیوم فالسی پاروم (وجود انواع مختلف انگل در نواحی جغرافیایی متفاوت)و وجود ژنوتیپ های متعدد در یک نوع پشه خاص ازمهم ترین مشکلات پیش رو در زمینه طراحی واکسن مالاریا می باشند،( چنین پلی مورفیسم گسترده آنتی ژنی ، توانایی انگل ها را برای مخفی شدن از سیستم ایمنی بدن افزایش می دهد و سیستم ایمنی بدن توانایی ایجاد پاسخ مناسب در مقابل این دامنه گسترده از آنتی ژنهای متنوع در حال گردش از جمعیت انگل ها را ندارد.(8و9) مقاومت به پلاسمودیوم به دلیل وجود آنتی بادی های محافظت کننده ی طبیعی در ساکنین مناطق هایپراندمیک نشان دهنده ی وجود آنتی ژن های ایمونوژنیک در مرحله ی خونی پلاسمودیوم فالسیپاروم است.(10) به عنوان مهم ترین عامل ارتباط بین میزبان و عامل بیماریزا سطح مروزوئیت را می توان به عنوان یک هدف مشخص برای تولید واکسن مالاریا در نظر گرفت.تعداد زیادی از آنتی ژن های بالقوه داوطلب برای تولید واکسن که تاکنون مورد شناسایی قرار گرفته اندیا بر روی سطح مروزوئیت ها و یا ارگانلهای اپیکال قرار دارند و یا در ارتباط با آنها هستند.(11) از بین چند آنتی ژنی که در مراحل مختلف زندگی پلاسمودیوم فالسی پاروم مورد بررسی قرار گرفته است ، MSP-3(Merozoite Surface Protein-3) به دلیل تلقیح آنتی بادی های سیتوفیل که عوامل کلیدی وابسته به آنتی بادی در ارتباط با مونوسیت در ممانعت از رشد انگل هستند، به عنوان یکی از مهم ترین کاندیداهای تولید واکسن انتخاب شده است.(12) پروتئین سطحی مروزوئیت 3 پلاسمودیوم فالسیپاروم(PfMSP-3)که به وسیله یک لکوس واحد بر روی کروموزوم شماره 10 انگل کد می شود، یک پروتئین غیر ساختاری وابسته به غشاء سطحی است که باعث تحریک پاسخ ایمنی چه در هنگام بروز عفونت طبیعی و چه ایمونیزاسیون تجربی می گردد.(19-13) MSP-3یکی ازاعضای مجموعه پروتئینهای موجود در غشای خارجی مروزوئیت ها می باشد که در بر هم کنشهای تکراری اسیدی-بازی آنتی ژنی یا ABRA(Acidic Basic Repeat Antigen)نقش دارد که با نام MSP-9 نیز شناخته می شوند. از نظر ساختاری پروتئین MSP-3 شامل سه بلوک از هپتادهای تکراری که نواحی مارپیچ آلفا را ایجاد می نمایند ، یک ناحیه هیدروفوبیک غنی از گلوتامین و یک ناحیه پوشیده شده با لوسین در انتهای C-terminal می باشد. توالی های تکراری هپتادها به صورت AXXAXXXهستند. (20و21) بررسی های انجام گرفته بر روی ژن MSP-3 از ایزوله های پلاسمودیوم فالسی پاروم نشان داده است که پلی مورفیسم در این ژن غالبا محدود به توالی انتهایی N-ترمینال جانبی داخلی و هپتادهای تکراری است که به عنوان یک ناحیه دارای تنوع آنتی ژنی در بین پلی پپتیدهای MSP-3 مطرح می باشد.ناحیه N-terminal در ارتباط با اسید آمینه های 195-52 می باشدو تنوعی که در بین بلوک های حاوی هپتاد های تکراری رخ می دهد اغلب از نوع SNP(Single Nucleotide Polymorphism) میباشند. ناحیه C-ترمینال که مربوط به اسید آمینه های 379-196 در توالی اللی K1 می باشد،در بین ایزوله های انگلهای مختلف به شدت حفاظت شده است.توالی این ناحیه غنی از لوسین units from a merozoite surface antigen of Plasmodium falciparum. Biochemistry 1995;34:3479–3491. [PubMed: 7893643] 21. Burgess BR, Schuck P, Garboczi DN. Dissection of merozoite surface protein 3, a representative of a family of Plasmodium falciparum surface proteins, reveals an oligomeric and highly elongated molecule. J Biol Chem 2005;280:37236–37245. [PubMed: 16135515] 22. Huber W, Felger I, Matile H, Lipps HJ, Steiger S, Beck HP. Limited sequence polymorphism in the Plasmodium falciparum merozoite surface protein 3. Mol Biochem Parasitol 1997;87:231–234. [PubMed: 9247935] 23. Okenu DMN, Thomas AW, Conway DJ. Allelic lineages of the merozoite surface protein 3 gene in Plasmodium reichenowi and Plasmodium falciparum. Mol Biochem Parasitol 2000; 109:185–8. 24. Khalili MB, Anvari Tafti MH, Sadeh M. Epidemiological pattern of malarial disease in the province of Yazd, Iran (Since 1986-2006). World Journal of Medical Sciences(World J. Med. Sci.) 2009; 4(1): 41-45. 25. WHO. Iran (Islamic Republic of). 2009. Available from: http://www.who.int/malaria/publications/country-profiles/profile_irn_en.pdf 26. رئیس اداره ی مالاریا. کاهش 40 درصدی مالاریا در سیستان و بلوچستان. وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشکی-اخبار و گزارش [20596]. 4 آبان، 1389: ص60. http://www.behdasht.gov.ir 27. Stephen J.Jordan,Oralee H.branch,Jean Carlos Castro,Robert A.Oster,and Julian C.Rayner. Genetic Diversity of the Malaria Vaccine Candidate Plasmodium falciparum Merozoite Surface Protein-3 in a Hypoendemic Transmission Environment. Am J Trop Med Hyg. 2009 March ; 80(3): 479–486. 28. Issiaka Soulama , Jude D. Bigoga , Magatte Ndiaye , Edith C. Bougouma , Josephine Quagraine ,Prisca N. Casimiro , Timothy T. Stedman , and Sodiomon B. Sirima. Genetic Diversity of Polymorphic Vaccine Candidate Antigens (Apical Membrane Antigen-1, Merozoite Surface Protein-3, and Erythrocyte Binding Antigen-175) in Plasmodium falciparum Isolates from Western and Central Africa. Am. J. Trop. Med. Hyg., 84(2), 2011, pp. 276–284 29. Spencer D. Polley, Kevin K. A. Tetteh, Jennie M. Lloyd, Onome J. Akpogheneta, Brian M. Greenwood, Kalifa A. Bojang, and David J. Conway. Plasmodium falciparum Merozoite Surface Protein 3 Is a Target of Allele-Specific Immunity and Alleles Are Maintained by Natural Selection. JID 2007:195 (15 January) 30. Andreas Baumann, Magda M Magris, Marie-Luz Urbaez, Sarai Vivas-Martinez, Rommy Durán,Tahidid Nieves, Meral Esen, Benjamin G Mordmüller, Michael Theisen, Luisana Avilan and Wolfram G Metzger. Naturally acquired immune responses to malaria vaccine candidate antigens MSP3 and GLURP in Guahibo and Piaroa indigenous communities of the Venezuelan Amazon. Malaria Journal 2012, می باشد،که در بین این دو ناحیه یک دامین غنی از گلوتامیک اسید قرار گرفته است.تفاوت های زیادی در بین توالی های اللی MSP-3 وجود دارد،ولی پلی مورفیسم توالی ها محدود به دو کلاس اللی K1 و 3D7 می شود که قابلیت بازترکیبی محدودی از خود نشان میدهند.(22و23) کشور ایران در منطقه مدیترانه شرقی واقع شده است.(24) 16 درصد از جمعیت این کشور در معرض خطر ابتلا به مالاریا قرار دارند.90 درصد موارد ابتلا از سه استان سیستان و بلوچستان،هرمزگان و کرمان منشا می گیرد، که در این میان60 درصد موارد مربوط به سیستان و بلوچستان می باشد.(25و26) بیشترین میزان بروز پلاسمودیوم فالسی پاروم در برخی از شهرهای مرزی سیستان و بلوچستان(چابهار،نیکشهر،سرباز،ایرانشهر) ،گزارش شده است.(24) Stephen J Jordan و همکاران در یک بررسی کوهورت بین سالهای 2003 تا 2006 تنوع اللهای ناحیه N-terminal را به روش PCR در بین 630 نمونه به دست آمده در آمازون پرو مورد شناسایی قرار دادند.فراوانی اللها نوسان شاخصی را در طول دوره زمانی 4 ساله نشان می داد ولی تنوع این توالی بسیار محدود و تنها 10 جهش در بین 630 مورد عفونت مورد شناسایی قرار گرفت.(27)Issiaka Soulama و همکاران در بررسی ملکولی انجام گرفته بر روی 600 نمونه پلاسمودیوم فالسیپاروم از ایزوله های افریقای مرکزی و غربی به منظور بررسی تنوع اللی PfMSP-3 ، هیچ گونه تفاوتی در پراکندگی اللهای MSP-3 در بین کشورهای این منطقه مشاهده نکردند.(28)Spencer D.Polley و همکاران 101 نمونه حاوی توالی های اللی MSP-3 را از دو جمعیت ساکن مناطق اندمیک مالاریا جمع آوری کردند و از نظر وجود شواهد مبنی بر بروز انتخاب طبیعی مورد بررسی قرار دادند.آنتی ژنهای نوترکیب شامل توالی های بلند رشته از اللهای متفاوت و یک ناحیه C-terminal ثابت است.ایمونیزاسیون موشها به وسیله این آنتی ژنهای بلند رشته ، سبب تولید آنتی بادی های اختصاصی در انسان می گردد.(29)Andreas Bauman و همکاران در نوعی مطالعه cross-sectional دو گروه از ساکنین آمازون ونزوئلا را مورد بررسی قرار دادند تا حضور آنتی بادی های طبیعی علیه آنتی ژنهای اختصاصی پلاسمودیوم فالسیپاروم را شناسایی نما یند.در این مطالعه از 475 مورد فرد مبتلا به پلاسمودیوم فالسی پاروم 53مورد (11.2%)تیتر آنتی بادی مثبت علیه PfMSP-3 را نشان می دادند.(30)در یک مطالعه انجام گرفته به وسیله Rodriguez LE و همکارانش ، در سال 2005 ، تعاملات بین گیرنده ها و لیگاندهای پپتیدهای سنتتیک و گلبولهای قرمز انسانی مورد شناسایی قرار گرفت تا نواحی مربوط به استرین های FC-27 مروزوئیت سطحی 3 پلاسمودیوم فالسی پاروم که به طور اختصاصی به گلبولهای قرمز متصل می شوند مشخص گردند.نتایج این مطالعه ، نقش پروتئین MSP-3 رادر تهاجم به گلبولهای قرمز تإیید می کند و مکانیسم این تهاجم مشابه مکانیسمی است که در دیگر MSP های شناخته شده رخ می دهد.(12)Hisaeda و همکارانش در سال 2002،نوعی واکسن را بر تمرکز بر روی مرحله خونی انگل پلاسمودیوم فالسیپاروم طراحی کردند که از نظر کارامدی بر روی میمون های Aotus nancymai به مراتب بهتر عمل می کرد.(14) Singh S در سال 2004 با تمرکز بر روی ناحیه حفاطت شده MSP-3 در قسمت C-terminal یک ناحیه فوق حفاطت شده را مطرح نمود که شامل 70 اسید آمینه در این ناحیه است و می تواند به عنوان واکسن در ایجاد ایمنی فعال مورد استفاده قرار بگیرد.(17)با توجه به جستجوهای انجام گرفته در منابع مختلف انگلیسی و فارسی مطلب یا مقاله یا پایان نامه تحقیقاتی مشابه های دال بر اجرای چنین طرحی در کشور ایران مشاهده نگردید و احتمالا به نظر می رسد این طرح برای اولین بار در این ناحیه (جنوب شرق ایران) در حال انجام شدن می باشد، لذا در بررسی متون قادر به ذکر کار های مشابه انجام شده در این منطقه بر روی زن MSP-3 نبوده ایم. با توجه به اهمیت پلاسمودیوم فالسیپاروم در ناحیه جنوب شرقی ایران و کاندید واکسن بودن ژن MSP-3، در این مطالعه قصد بر این است که پس از نمونه برداری در این منطقه اندمیک، با بررسی ناحیه N-terminal ژن MSP-3، ژنوتیپ های بین آللی و بین ژنی را به وسیله ی روش های مولکولی NESTED-PCR مشخص می نماییم. با توجه به وجود PCR-Product، محاسبه تعیین توالی DNA تمام ژن و آلل های مربوطه قابل اجرا می باشد. نتایج حاصل از این مطالعه در طراحی واکسن مالاریا، درمان بیماری و استراتژی کنترل و حذف پلاسمودیوم فالسیپاروم کمک شایانی خواهد میزان DNA بسته به میزان سلول های لکوسیتی متفاوت است. *DNA های ویروسی بدست آمده از از نمو نه های سرمی در ژل اگارز قابل مشاهده نمی باشد * Lµ 1-5 از محلول DNA برای Lµ 50 PCR کفایت می کند. پس از استخراج DNA ، پرایمر های اختصاصی ژن MSP-3 جهت انجام Nested-PCR سفارش داده می شود که این پرایمر ها ذیلا ذکر گردیده اند. External Primers for Nested-PCR of MSP-3 Gene: Forward: 5′-ATAATGTTGCTAGTAAAGAAATTG-3′ Reverse: 5′-AATACATCATCATTTTCCTTAG-3′ Internal Primers for Nested-PCR of MSP-3 Gene: Forward: 5′-ATAATCTTAACTTAAGAAATGC-3′ Reverse:5′-CGCGATAAGCATTTTTTGCC-3′ جهت انجام Nested-PCRاز DNA استخراج شده(1.5 میکرولیتر) و Premix-PCR استفاده می گردد. بدین صورت که ابتدا از DNA استخراج شده پلاسمودیوم فالسیپاروم بیماران در 35 سیکل در دمای 95 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه ،50 در جه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه و 65 درجه سانتی گراد به مدت 1 دقیقه به همراه یک مرحله نهایی در 65 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه با استفاده از پرایمر های External ،PCR اولیه انجام می گیرد. واکنش Nested –PCR تحت شرایط ذکر شده قبلی صورت خواهد گرفت با این تفاوت که به جای DNA-template بیماران مبتلا به پلاسمودیوم فالسیپاروم از محصول واکنش PCR (1 میکرولیتر) اولیه استفاده می گردد. طبقه بندی آلل های MSP-3 به وسیله تفاوت در اندازه (size variation) ایجاد شده به وسیله الکتروفورز بر روی ژل آگارز 2 درصد و رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید و مقایسه با lader marker 50bp تعیین خواهد گردید. پس از انجام الکتروفورز و انجام رنگ امیزی، ژل آگارز به transduct منتقل شده و عکس برداری و آنالیز PCR بر روی آن انجام می گیرد . اطلاعات بدست آمده از مقایسه آلل های بررسی شده ژن MSP-3 در جمعیت با سوش استاندارد پلاسمودیوم فالسیپاروم حاوی این آللها به وسیله نرم افزار های انالیز اماری (( SPSS18 به استفاده از آزمون کای- اسکوئر انجام می دهیم . پس از انجام انالیز ها اطلاعات مذبور جهت نشرگزارش نهایی پایان نامه قرار خواهند گرفت. کرد. 11:46 |
| سوالات و / یا فرضیات پژوهش | 1-توزیع فراوانی پلی مورفیسم در ژن کد کنندهMSP-3 در بین ایزوله های جدا شده از افراد مبتلا به مالاریا چگونه است؟ 2- توزیع فراوانی همولوژی در الگوی ژنو تیپی بین ایزوله های جدا شده از افراد مبتلا به مالاریا فالسی پاروم چگونه است؟ 3-توزیع فراوانی جمعیت های ژنتیکی ایزوله های جدا شده از افراد مبتلا به مالاریای فالسی پاروم به روش Nested- PCR چگونه است؟ |
| هدف کلی طرح | تعیین ژنوتیپ آلل های K1 و D73ناحیهN-terminal پروتئین سطحی مروزوئیت 3 انگل پلاسمودیوم فالسیپاروم مالاریا (PfMSP-3) به روش Nested-PCR در منطقه جنوب شرقی ایران(چابهار،نیکشهر،سرباز،ایرانشهر) |
| اهداف اختصاصی | 1-تعیین توزیع فراوانی پلی مورفیسم در ژن کد کننده آنتی ژن MSP-3 در بین ایزوله های جدا شده از افراد مبتلا به مالاریا 2-تعیین توزیع فراوانی همولوژی در الگوی ژنوتیپی بین ایزوله های جدا شده از افراد مبتلا به مالاریای فالسیپاروم 3-تعیین توزیع فراوانی جمعیت های ژنتیکی ایزوله های جدا شده از افراد مبتلا به مالاریای فالسیپاروم به روش Nested_PCR |
| سازمانها، مراکز و موسسات و سایر بهره برداران بالقوه دستاوردهای طرح | مراکز خدمات بهداشتی- درمانی |
| تعریف واژه های تخصصی | Nested-PCR:تکنیکی دومرحله ای است که جفت پرایمر دوم در محدوده محصول آمپلی فیکاسیون مرحله اول قرار می گیرد.از این روش جهت تعیین گونه،سوش،کلون و مقاومت دارویی استفاده می شود. عفونت مولتی کلونال:به آلودگی فرد با بیش از یک کلون انگلی گفته می شود. |
| نوع مطالعه | مقطعی(توصیفی) |
| جامعه مورد مطالعه(معرفی مشارکت کنندگان)/ محیط پژوهش(معیارهای ورود و خروج ذکر شوند) | کلیه افراد مبتلا به مالاریای فالسیپاروم در ناحیه جنوب شرق ایران(چابهار،نیکشهر،سرباز،ایرانشهر) در سال 1391 که دارای معیارهای زیر باشند: معیار ورود: افرادی که آزمایش میکروسکوپی گسترش خون آنان از لحاظ پلاسمودیوم فالسیپاروم مثبت بوده و طی ماه گذشته تحت درمان قرار نگرفته باشندو مثبت بودن لام آنها به کمک نوار های Rapid Sterip test مرکز بهداشت تایید شده باشند. معیار خروج: افرادی که رضایت به همکاری ندارند، از مطالعه خارج می شوند |
| حجم نمونه و روش محاسبه آن | با توجه به مقالات مشابه انجام شده در منطقه بر روی دیگر ژنها و اللها حجم نمونه معادل 70 محاسبه گردید که با توجه به امکان نمونه گیری بیشتر حجم نمونه را به 100 نمونه افزایش می دهیم. |
| روش نمونه گیری(نحوه تخصیص تصادفی و همسانسازی در صورت لزوم ذکر شود) | از آنجا که چارچوب نمونه گیری ما مشخص نیست، به روش نمونه گیری در دسترس نمونه ها را از منطقه جنوب شرقی ایران(چابهار،نیکشهر،سرباز،ایرانشهر) جمع آوری می نماییم؛ بدین صورت که دو روز در هفته به مرکز بهداشت شهرستانهای مذکور(چابهار،نیکشهر،سرباز،ایرانشهر) مراجعه و از بین بیمارانی که از نظر میکروسکوپی به پلاسمودیوم فالسیپاروم مبتلا بودند وRapid Test آنها مثبت تشخیص داده شد، نمونه گیری کرده و با حفظ زنجیره سرد، جهت انجام آزمایش به دانشکده بهداشت زاهدان منتقل می نماییم.نمونه گیری از تاریخ تصویب طرح تا تاریخ رسیدن به حجم نمونه ادامه خواهد یافت. |
| روش و ابزار جمع آوري داده ها / صحت و استحکام داده ها (پرسشنامه یا فرم اطلاعاتی ضمیمه شود) | 1- فرم اطلاعاتی ساده 2- میکروسکوپ نوری جهت تشخیص لامهای مثبت پلاسمودیوم فالسیپاروم 3- نوارهای تشخیص سریع پلاسمودیوم فالسی پاروم مرکز بهداشت 4- روشهای ملکولی Nested-PCR |
| روش اجرای طرح(با جزئیات بطور کامل شرح داده شود) | پیش از انجام نمونه گیری مواد و تجهیزات لازم تا مرحله استخراج DNA (به جز تهیه پرایمر ها ) از شرکت های معتبر آزمایشگاهی خریداری شده و در محل مرکز تحقیقات بیماری های گرمسیری شهرستان زاهدان نگهداری می گردد. فرم های پرسشنامه و فرم های اطلاعاتی مربوط به نمونه های اخذ شده توسط نمونه گیر(شخص دانشجو ) به طور کامل پر شده و به همراه نمونه در محفظه Cold Box قرار گرفته تا انتقال زنجیره سرد رعایت گردد. پس از انجام نمونه گیری از مناطق چهار گانه مالاریا خیز جنوب شرقی ایران شامل : چابهار،ایرانشهر،نیکشهر و سرباز، نمونه های خون تام به صورت تازه در ویال های EDTA به مرکز تحقیقات عفونی و بیماریهای گرمسیری زاهدان منتقل وجهت بررسی میکروسکوپی ، رنگ آمیزی گیمسا و جداسازی DNA نگهداری می گردند. DNA نمونه ها با استفاده از کیت استخراج DNA ، Qiagene به سرعت انجام می گیرد که پروتکل انجام روش استخراج دقیقا بر اساس کیت دنبال شده و متعاقبا در روش انجام طرح ذکر گردیده است : استخراج DNA آماده سازی نمونه: خون تام بایستی در لوله های آغشته به سیترات و یا EDTA جمع آوری گردد تا از ایجاد لخته جلوگیری و DNA تجزیه نگردد. DNA جدا شده از خون های حاوی هپارین را نمی توان جهت PCR مورد استفاده قرار داد. به طور عادی Lµ200 از خون تازه برای DNA به اندازه ی gµ2- 10 مورد استفاده قرار می گیرد. اگر مقدار بیشتری DNA مورد نیاز باشد ، Lµ500 از خون تام بایستی در یک میلی لیتر آب مقطر لیز گردد، لکوسیت ها از محیط خارج شوند (سانتریفوژ در 2 دقیقه با دور rpm5000 ) و Lµ 200 از بافر TE در داخل پلت قرار می گیرد . خون را به مدت 2 ماه می توان در دمای 2-4 درجه سانتی گراد نگهداری نمود . برای نگهداری های بیش از 2 ماه باید نمونه ها را به حجم های Lµ 200 تقسیم کرده و در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری کرد. پروتکل استخراج DNA با استفاده از کیت(برگردان کامل پروتکل استخراج DNAکیت به فارسی) 1. Lµ 200 از نمونه را با Lµ 400 از محلول لایز به خوبی مخلوط نمائید و به مدت 5 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی گراد انکوبه کنید. *اگر از نمونه های فریز شده استفاده می کنید، محلول لایز را بایستی قبل از باز شدن فریز به نمونه های اضافه نمائید. سپس نمونه ها را در دمای65 درجه سانتی راد به مدت 10 دقیقه انکوبه نموده و لوله را به طور متناوب به آرامی معکوس(INVERT) کنید. 2. بلافاصله Lµ 600 کلروفرم به پلت اضافه کرده و 3-5 بار معکوس کنید تا به حالت امولسیون در آید و به مدت 2 دقیقه با دور rpm10000 سانتریفوژ نمایید. 3. محلول رسوب دهنده را با مخلوط کردن Lµ 720 از آب دیونیزه ی استریل با Lµ 80 از محلول رسوب دهنده ی غلیظ x10 موجود در کیت تهیه نمایید . 4. فاز آبی فوقانی را که حاوی ماده DNA می باشد را به یک لوله جدید منتقل نموده و Lµ 800 از محلول رسوب دهنده ی تازه تهیه شده را به آن اضافه کنید و به آرامی مخلوط نموده ( با چند بار اینورت کردن) و دمای اتاق به مدت 1-2 دقیقه قرار می دهیم و سپس با دور rpm10000 به مدت 2 دقیقه سانتریفوژ می نماییم. 5. سوپرتانت (بخشی رویی تشکیل شده ) را به طور کامل خارج نموده و پلت حاوی DNA را با Lµ 100 از محلول NaCL مخلوط نموده و به آرامی ورتکس می کنیم. *مطمئن شوید که پلت به طور کامل حاوی مواد محلول شده است . 6. Lµ 300 از اتانول سرد را به پلت اضافه نموده و اجازه می دهیم رسوب DNA تشکیل شود (10 دقیقه در دمای 20- سانتی گراد) و سپس به مدت 3-4 دقیقه با دور rpm10000 سانتریفوژ می نمائیم. اتانول را خارج می کنیم ، پلت را یکبار با اتانول 70% سرد شستشو داده و DNA را با Lµ 100 از آب دیونیزه استریل به حالت محلول درآورده و به آرامی ورتکس می نماییم . نکته: *به علت مقادیر کم DNA در نمونه های سرمی رسوب دهی DNA را به مدت یک تا 2 ساعت در دمای 20- درجه سانتی گراد ادامه می دهیم و حجم آب اضافه شده را به Lµ 20 تقلیل می دهیم . *برای کاربرد PCR شستشوی DNA با اتانول 70% ضروری نیست. *اگر نیاز به DNA ژنومیک حاوی RNA آزاد باشد ،RNAaseA(#ENO531) با غلظت 2/. Mg/ml بعد از مرحله ی 5 به محصول نهایی اضافه شده ، ورتکس گردیده و به مدت 10 دقیقه در دمای 37درجه سانتی گراد انکوبه می گردد. 7. غلظت DNA را با استفاده از روشهای اسپکتروفتومتری و یا به صورت چشمی بعد از الکتروفورز بر روی ژل آگارز می سنجیم ، عدم حضور RNA و مقدار تخمینی طول DNA را چک می نماییم . اغلبg µ 2-10 DNA از Lµ 200 خون تازه دارای طول متوسط تقریبی 50kb می باشد. نکته : *در نمونه های خونی |
| روش تجزیه، تحليل و توصیف دادهها (نمونهاي از جدول توخالي ضميمه شود و روش هاي آماري مورد استفاده به طور كامل توضيح داده شود)(کیفی و کمی) | با استناد به روشهای آمار توصیفی (جدول توزیع فراوانی،رسم نمودار)و روشهای آمار استنباطی(آزمون مقایسه نسبت با یک عدد ثابت)داده ها تجزیه و تحلیل می شوند. درصد تعداد پلی مورفیسم MSP-3 K1 3D7 درصد تعداد همولوژی دارد ندارد |
| ملاحظات اخلاقی | نمونه گیری و مصاحبه با رضایت کامل افراد مبتلا به مالاریا انجام خواهد شد،هم چنین تعهد می شود نام و مشخصات بیماران در هیچ گزارشی قید نشود.(کدهای اخلاقی 1،2،17،20 لحاظ شده است) |
| محدودیتهای اجرائی طرح و پیش بینی جهت حل آنها | - مشکل تهیه مواد وامکان طولانی شدن زمان دریافت آنها راه حل: تصویب سریع تر طرح و دریافت بودجه آن - عدم نمونه گیری مناسب راه حل: آموزش به فرد نمونه گیر - عدم همکاری بیمار راه حل: توضیح دادن در مورد منافع این طرح و این که هیچ ضرری متوجه آنان نخواهد شد و اطلاعات آنها به طور محرمانه باقی خواهد ماند و نامشان فاش نخواهد شد. |
| کلمات کلیدی | پلاسمودیوم فالسی پاروم Plasmodium falciparum تعیین ژنوتیپGenotyping پروتئین سطحی مروزوئیت-3 Merozoite Surface Protein-3 |
| فهرست منابع و مراجع | 1. Breman JG. The ears of the hippopotamus: manifestations, determinants, and estimates of the malaria burden. Am J Trop Med Hyg 2001;64:1–11. [PubMed: 11425172] 2. Marsh K. Malaria—a neglected disease? Parasitology 1992;104(Suppl):S53–S69. [PubMed: 1589300] 3. Miller, H. L., M. F. Good, and G. Milon. 1994. Malaria pathogenesis ,Science 264:1878–1883. 4. White, N. J., and M. Ho. 1992. The pathophysiology of malaria. Adv. Parasitol. 31:83–173. 5. ادریسیان غ ح. انگل های مالاریا. ادریسیان غ، رضائیان م، قربانی م و همکاران. تک یاخته شناسی پزشکی. اول. تهران: دانشگاه علوم پزشکی تهران؛ 1386: ص228-180. 6. Branch OH, Sutton P, Barnes C, et al. Plasmodium falciparum Genetic Diversity Maintained and Amplified Over 5 Years of a Low Transmission Endemic in the Peruvian Amazon. Mol Biol Evol(MBE) 2011; 28(7): 1973-1986. 7. Kang JM, Moon SU, Kim JY, et al. Genetic polymorphism of merozoite surface protein-1 and merozoite surface protein-2 in Plasmodium falciparum field isolates from Myanmar. Malaria Journal 2010; 9(131). 8. Heidari A, Keshavarz H, Rokni MB, Jelinek T. Genetic diversity in merozoite surface protein (MSP)-1 and MSP-2 genes of Plasmodium falciparum in a major endemic region of Iran. Korean Journal of Parasitology 2007; 45(1): 59-63. 9. Kiwanuka GN. Genetic diversity in Plasmodium falciparum merozoite surface protein 1 and 2 coding genes and its implications in malaria epidemiology: a review of published studies from 1997-2007. J Vector Born Dis 2009; 46: 1-12. 10. Zamani Z, Razavi MR, Sadeghi S, et al. Sequence diversity of the C-terminal region of Plasmodium falciparum merozoite surface protein 1 in Southern Iran. Southeast Asian J Trop Med Public Health(SAJTMPH) 2009; 40(1). 11. Mills KE, Pearce JA, Crabb BS, Cowman AF. Truncation of merozoite surface protein 3 disrupts its trafficking and that of acidic-basic repeat protein to the surface of Plasmodium falciparum merozoites. Mol Microbiol 2002;43:1401–1411. [PubMed: 11952894] 12. Rodriguez LE, Curtidor H, Ocampo M, Garcia J, Puentes A, Valbuena J, Vera R, Lopez R, Patarroyo ME. Identifying Plasmodium falciparum merozoite surface antigen 3 (MSP3) protein peptides that bind specifically to erythrocytes and inhibit merozoite invasion. Protein Sci 2005;14:1778–1786. [PubMed: 15987906] 13. Druilhe P, Spertini F, Soesoe D, et al. A malaria vaccine that elicits in humans antibodies able to kill Plasmodium falciparum. PLoS Med 2005; 2:e344. 14. Hisaeda H, Saul A, Reece JJ, et al. Merozoite surface protein 3 and protection against malaria in Aotus nancymai monkeys. J Infect Dis 2002; 185:657–64. 15. Oeuvray C, Bouharoun-Tayoun H, Gras-Masse H, et al. Merozoite surface protein-3: a malaria protein inducing antibodies that promote Plasmodium falciparum killing by cooperation with blood monocytes. Blood 1994; 84:1594–1602. 16. Soe S, Thiesen M, Roussilhon C, Aye KS, Druilhe P. Association between protection against clinical malaria and antibodies to merozoite surface antigens in an area of hyperendemicity in Myanmar: complementarity between responses to merozoite surface protein 3 and the 220-kilodalton glutamate-rich protein. Infect Immun 2004; 72:247–52. 17. Singh S, Soe S, Mejia JP, et al. Identification of a conserved region of Plasmodium falciparum MSP3 targeted by biologically active antibodies to improve vaccine design. J Infect Dis 2004; 190:1010–8. 18. Audran R, Cachat M, Lurati F, et al. Phase I malaria vaccine trial with a long synthetic peptide derived from the merozoite surface protein 3 antigen. Infect Immun 2005; 73:8017–26. 19. Carvalho LJ, Oliveira SG, Theisen M, et al. Immunization of Saimiri sciureus monkeys with Plasmodium falciparum merozoite surface protein-3 and glutamate-rich protein suggests that protection is related to antibody levels. Scand J Immunol 2004; 59:363–72. 20. Mulhern TD, Howlett GJ, Reid GE, Simpson RJ, McColl DJ, Anders RF, Norton RS. Solution structure of a polypep-tide containing four heptad repeat |
| نام فایل | تاریخ درج فایل | اندازه فایل | دانلود |
|---|---|---|---|
| Picture 001.jpg | 1391/02/11 | 194846 | دانلود |
| Picture 002.jpg | 1391/02/11 | 112806 | دانلود |
| Picture.jpg | 1391/02/11 | 131567 | دانلود |
| پرسشنامه.docx | 1391/02/11 | 18475 | دانلود |
| rezayatname akhlaghi.doc | 1391/02/11 | 89088 | دانلود |
| 91.4.21.doc | 1391/04/22 | 81920 | دانلود |
| nahaeeeeeeeee.doc | 1391/04/27 | 327168 | دانلود |
