چاپ صفحه |  صفحه نخست سامانه |  مجری و همکاران |  اطلاعات تفضیلی |  دانلود | علوم پزشکی زاهدان |
| کد طرح | 5423 |
| عنوان فارسی طرح | بررسی ژنوتیپ آلل های (C loop(CAMP و (F loop (FCR-3 آنتی ژن 175 کیلو دالتون متصل شونده به گلبول قرمزانگل پلاسمودیوم فالسیپاروم مالاریا (EBA-175) به روش Nested-PCR در منطقه جنوب شرقی ایران |
| عنوان لاتین طرح | Genotyping of C loop(CAMP) and F loop(FCR-3) alleles of Erythrocyte Binding Antigen 175 kd(EBA-175) of Plasmodium falciparum- malaria using Nested-PCR in South-East of Iran |
| نوع طرح | |
| محل اجرای طرح | مرکز تحقیقات بیماریهای عفونی و گرمسیری |
| رسته مطالعاتی | توصیفی- مقطعی |
| دانشکده/مرکز | دانشکده پزشکی زاهدان |
| زمان اجرا -روز |
| نام و نامخانوادگی | سمت در طرح | نوع همکاری | درجهتحصیلی | پست الکترونیک |
|---|---|---|---|---|
| علی جمشیدی | همکار | کارشناس ارشد | a.jamshidi@zaums.ac.ir | |
| عادل ابراهیم زاده | مجری اول | دکترا(p.h.d) | ||
| محمد جعفری مدرک | مجری دوم | دکترای تخصصی | mjafari547547@yahoo.com | |
| علیرضا انصاری مقدم | مشاور | دکترای تخصصی | ansariaLireza@yahoo.com |
| عنوان | متن |
|---|---|
| خلاصه طرح به فارسی | بررسی ژنوتیپ آلل های (C loop(CAMP و (F loop (FCR-3 آنتی ژن 175 کیلو دالتون متصل شونده به گلبول قرمزانگل پلاسمودیوم فالسیپاروم مالاریا (EBA-175) به روش Nested-PCR در منطقه جنوب شرقی ایران |
| خلاصه طرح به لاتین | Genotyping of C loop(CAMP) and F loop(FCR-3) alleles of Erythrocyte Binding Antigen 175 kd(EBA-175) of Plasmodium falciparum- malaria using Nested-PCR in South-East of Iran |
| بيان مسئله تحقيق/اهمیت پژوهش | مالاریا یک بیماری عفونی است که توسط تک یاخته انگلی از جنس پلاسمودیوم ایجاد و به وسیله ی گونه های بخصوصی از پشه های آنوفل ماده منتقل می شود. این بیماری از دیر باز به عنوان مهمترین بیماری عفونی مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری به شمار می رود (1) .مرگ و میر ناشی از مالاریا هزینه های بسیار زیادی را متوجه کشورهای در حال توسعه می کند. سازمان بهداشت جهانی تخمین می زند که حدود 3/3 میلیارد نفر از جمعیت جهان در مناطق با شیوع اندمیک مالاریا زندگی می کنند . مالاریا مسئول مرگ ومیر بیش از یک میلیون نفر در هرسال می باشد (2). کشور ما نیز از این بیماری در امان نبوده و سه استان سیستان و بلوچستان ، هرمزگان و کرمان با 85 درصد از کل موارد همچنان به عنوان استان های مالاریا خیز کشور به حساب می آیند(3). از این میان 50 درصد مالاریای کشور مربوط به استان سیستان و بلوچستان می باشد و بیشتر از 80 درصد موارد گزارش شده ازاین استان نیز متعلق به سه شهر جنوبی یعنی ایرانشهر ،نیک شهر و چابهار می باشد(4). از بین 5 گونه پلاسمودیوم که در انسان ایجاد عفونت می کنند ،گونه (Plasmodium falciparum) پلاسمودیوم فالسیپاروم آلوده کننده ترین گونه موجود می باشد که مهم ترین تظاهرات بالینی را ایجاد می نماید (2). مالاریای ناشی از پلاسمودیوم فالسیپاروم یکی از مشکلات مهم اجتماعی- اقتصادی جوامع امروزی را شامل می شود . اغلب مرگ و میر های ناشی از مالاریای پلاسمودیوم فالسیپاروم در کودکان کمتر از 5 سال و در زنان بار دار موجود در مناطق اندمیک مالاریا رخ می دهد. تلاش های صورت گرفته برای مقابله با این مشکل به وسیله دارو های ضد مالاریا ، حشره کش ها، و استفاده از پشه بند های آغشته به سموم مختلف موفقیت های محدودی را در پی داشته است . به منظور رسیدن به نتایج بهتر در زمینه مقابله با مالاریای فالسیپاروم باید از روش های چندگانه ای چون واکسناسیون و کنترل پشه های ناقل در کنار هم استفاده نمود. شیوع مالاریا در سالهای اخیر به دلیل مقاومت پشه های ناقل در مقابل داروهای ضد مالاریا سیری فزاینده را دنبال نموده است به ویژه درمورد دارو هایی که بر روی چرخه غیر جنسی مالاریا تاثیر می گذارند . این مرحله از چرخه زندگی انگل همچنین مسئول تظاهرات بالینی انگل و عفونت های ناشی از انگل می باشد . بنابر این نیاز برای ایجاد را هی جایگزین مقابله با این مرحله از سیکل زندگی انگل به وسیله تولید یک واکسن مناسب به شدت احساس می گردد(5). تنوع ژنتیکی آنتی ژن های انگل پلاسمودیوم فالسیپاروم مشکلات گسترده ای در زمینه ایجاد یک واکسن موفق علیه مالاریا ،ایجاد نموده است . چنین پلی مورفیسم تنوع آنتی ژنی توانایی انگل را برای گریز از سیستم ایمنی و در نتیجه تهاجم بیشتر ، افزایش می دهد و ایجاد پاسخ ایمنی مناسب در مقابل انگل را توسط سلولهای در گردش ایمنی با انتقال مواجه می سازد . تغییرات ایجاد شده در تنوع ژنتیکی انگل در فصول انتقال می تواند روشهای کنترلی را با مشکل مواجه نماید. مطالعات گذشته با استفاده از روشهای میکرو ستلایت ،تنوع جغرافیایی وسیعی را در تنوع ژنتیکی داخل و خارج گونه های مختلف انگل پلاسمودیوم نشان داده است . داشتن یک فهم عمیق در مورد پراکندگی و جابه جایی تنوع آنتی ژنی در آنتی ژن های داوطلب تولید واکسن در جمعیت های طبیعی انگلی برای طراحی یک واکسن کارآمد که قابلیت تعمیم داشته باشد ضروریت دارد(2و5). چندین آنتی ژن متفاوت از مراحل مختلف چرخه زندگی انگل پلاسمودیوم فالسیپاروم از طریق اپیدمیولوژی مولکولی به عنوان داوطلبین تولید واکسن مطرح شده اند . شناسایی پراکندگی ژنوتیپ در گردش آنتی ژن های انگل مالاریا در یک منطفه جغرافیایی گسترده می تواند اطلاعات ژنتیکی سودمندی برای طراحی واکسن مناسب در اختیار ما قرار دهد . از جمله این آنتی ژن ها می توان به آنتی ژن های سطحی مروزوئیت (MSP1،MSP2،MSP3) و آنتی ژن های خارج شده از گرانول های آپیکال (AMA1) و EBA-175 اشاره کرد که به عنوان اهداف اختصاصی تولید واکسن مطرح بوده اند(5). آنتی ژن متصل شونده به اریتروسیت (Erythrocyte Binding Antigen 175 kd)یا EBA-175kd اولین آنتی ژنی بود که از محیط کشت شناور پلاسمودیوم فالسیپاروم جدا شد و نقش اساسی در تهاجم به گلبول های قرمز توسط انگل پلاسمودیوم ایجاد می کند ، بدین صورت که اسید سیالیک سطحی غشایی به گلیکو فورین A گلبول قرمز متصل می گردد. هم چنین مشخص گردیده است که آنتی بادی های تولید شده علیه EBA-175 از اتصال اسید سیالیک به گلیکو فورین A ممانعت ایجاد کرده و درنتیجه مانع تهاجم مروزوئیت های موجود در اریتروسیت می گردند(2و5و6). ژن کد کننده آنتی ژن EBA-175 بر روی کروموزوم شماره 7 انگل پلاسمودیوم قرار گرفته است . این ژن پروتئین هایی را کد می کند که در محل اندامک های میکرونم انتهایی مروزوئیت قرار می گیرند و به گیرنده های اختصاصی خود بر روی گلبول قرمز متصل می شوند . ناحیه غنی از سیستئین شماره 2 آن می تواند به اسید سیالیک موجود روی گلیکو فورین A گلبول های قرمز متصل می گردد و روند تهاجم انگل را تسهیل نماید. در نتیجه به عنوان یک پل بین انگل و گلبول های قرمز میزبان عمل می کند . پلی مورفیسم بسیار کمی در این ناحیه بین آلل های پلاسمودیوم وجود دارد(2و5و6و7). ناحیه 2 EBA-175 در قسمت مرکزی ژن قرار گرفته است که به شدت دارای حالت دو شکلی بین قطعات F موجود در زنجیره FCR3 (F loop) و قطعات C در زنجیره ی CAMP (C loop) می باشد . قطعات C , F به ترتیب 114 و 141 اسید آمینه را کد می کند . مروزوئیت های پلاسمودیوم فالسیپاروم که هاپلوئید هستند، یکی از قطعات C یا F را به طور حتم دارا خواهند بود و نه هر دو یا هیچکدام را(7). با توجه به جستجوهای انجام گرفته در منابع مختلف انگلیسی و فارسی، مطلب یا مقاله یا پایان نامه تحقیقاتی فقط یک مورد مطالعه مشابه در کشور ایران مشاهده گردید که توسط حیدری و همکاران در یک بررسی انجام گرفته در سال (2009 )1388در شهرستان سرباز استان سیستان و بلوچستان دیمورفیسم اللی آنتی ژن متصل شونده به اریتروسیت 175 کیلو دالتونی را مورد بررسی قرار دادند.در این بررسی که به روش Nested-PCR و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی انجام گرفت، دو قطعه ژنی از EBA-175 در 68 بیمار مبتلا به پلاسمودیوم فالسیپاروم مورد شناسایی قرار گرفتند.در این بررسی استرینهای CAMP(714bp)واسترینهای FCR-3(795bp) به ترتیب در 14(37.8%)و 23(62.2%) از نمونه های ایرانی و 10 (32.3%)و 19(61.3%) از مهاجرین پاکستانی یافت شد.(7 )Diana S Perce-da-Silva و همکاران در یک بررسی مشابه در مورد اشکال مختلف اللی EBA-175 که در سال 2011 در روستاهای اندمیک مالاریای برزیل به روش Nested-PCR انجام شد ، دیمورفیسم اللی EBA-175 را مورد شناسایی قرار داد.نتایج به دست آمده از این مطالعه نشان می دهد که فراوانی قطعه C در این مناطق به مراتب بالاتر از قطعه F می باشد.( 2)Issiaka Soulama و همکارانش در سال 2011 ، 418 بیمار مبتلا به پلاسمودیوم فالسیپاروم را در مناطق غربی و مرکزی افریقا مورد بررسی قرار دادند.در این بررسی ها که به روش Nested-PCR انجام پذیرفته است، در بیش از 50 درصد موارد مبتلا دیمورفیسم اللی ، مربوط به F-loop می باشد که از نطر شیوع به میزان 2 برابر C-loop است.(5 )در یک مطالعه مشابه به وسیله همین محقق و همکارانش،در بورکینافاسو در سال 2011، نتایج مشابهی با آنچه در سلسله مطالعات قبلی به دست آمده بود حاصل شد.(8 ) El Sahby و همکارانش با توجه به مطالعات صورت گرفته در سال 2010 بر روی جوانان سالمی که درایالات متحده زندگی می کردند، نوعی واکسن جدید مالاریای فالسیپاروم بر اساس ناحیه 2 EBA-175 را که ناحیه ای به شدت حفاظت شده است ، طراحی و پیشنهاد کردند.(9 )B.Kim Lee Sin و همکارانش در زمینه طراحی واکسن مالاریای فالسیپاروم بر اساس این ناحیه حفاظت شده به نتایج مشابهی با آنچه El Sahby و همکارانش رسیدند دست یافتند.( 6). ایران که در ناحیه شرقی مدیترانه واقع شده است اغلب به عنوان یک ناحیه ی اندمیک متوسط رو به پائین در زمینه مالاریا شناخته می شود . اگر چه میزان انتقال مالاریا در ایران در طی سال های اخیر به شدت کاهش پیدا کرده است ولی انتقال منطقه ای مالاریا هم چنان به علل تکنیکی و وجود مشکلات عملکردی ادامه پیدا کرده است .امروزه ، استان سیستان و بلوچستان به عنوان ناحیه اندمیک پلاسمودیوم فالسیپاروم شناخته می شود چرا که این استان با واقع شدن در مرز افغانستان و پاکستان و مهاجرت مردم این کشورها به این استان باعث شده تا بیشترین موارد مثبت را دارا باشد و طی 5 سال اخیر،سالیانه بین 1000تا4600 مورد گزارش شده که ازاین تعداد حدود 36% آنها افغانی بوده است(10و11). در این بررسی به شناسایی فراوانی آلل های EBA-175 در استان سیستان و بلوچستان(چابهار،نیکشهر،سرباز،ایرانشهر) ایران مورد نظر خواهد بود و کاربرد ایمنی زایی این قطعات خاص EBA175 مورد استفاده خواهد گرفت . با توجه به اهمیت پلاسمودیوم فالسیپاروم در ناحیه جنوب شرقی ایران و کاندید واکسن بودن ژن EBA-175، در این مطالعه قصد بر این است که پس از نمونه برداری در این منطقه اندمیک، با بررسی ناحیه حفاظت شده ژن EBA-175، ژنوتیپ های بین آللی و بین ژنی را به وسیله ی روش های مولکولی NESTED-PCR مشخص می نماییم. با توجه به وجود PCR-Product، محاسبه تعیین توالی DNA تمام ژن و آلل های مربوطه قابل اجرا می باشد. نتایج حاصل از این مطالعه در طراحی واکسن مالاریا، درمان بیماری و استراتژی کنترل و حذف پلاسمودیوم میزان DNA بسته به میزان سلول های لکوسیتی متفاوت است. *DNA های ویروسی بدست آمده از از نمو نه های سرمی در ژل اگارز قابل مشاهده نمی باشد * Lµ 1-5 از محلول DNA برای Lµ 50 PCR کفایت می کند. پس از استخراج DNA ، پرایمر های اختصاصی ژن EBA-175 جهت انجام Nested-PCR سفارش داده می شود که این پرایمر ها ذیلا ذکر گردیده اند. External Primers for Nested-PCR of EBA-175 Gene: Forward: 5-CAAGAAGCAGTTCCTGAGGAA-3′ Reverse: 5- TCTCAACATTCATATTAACAATTC -3′ Internal Primers for Nested-PCR of EBA-175 Gene: Forward: 5-GAGGAAAACACTGAAATAGCACAC-3′ Reverse: 5-CAATTCCTCCAGACTGTTGAACAT--3′ جهت انجام Nested-PCRاز DNA استخراج شده(1.5 میکرولیتر) و Premix-PCR استفاده می گردد. بدین صورت که ابتدا از DNA استخراج شده پلاسمودیوم فالسیپاروم بیماران در 35 سیکل در دمای 95 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه ،50 در جه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه و 65 درجه سانتی گراد به مدت 1 دقیقه به همراه یک مرحله نهایی در 65 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه با استفاده از پرایمر های External ،PCR اولیه انجام می گیرد. واکنش Nested –PCR تحت شرایط ذکر شده قبلی صورت خواهد گرفت با این تفاوت که به جای DNA-template بیماران مبتلا به پلاسمودیوم فالسیپاروم از محصول واکنش PCR (1 میکرولیتر) اولیه استفاده می گردد. طبقه بندی آلل های EBA-175 به وسیله تفاوت در اندازه (size variation) ایجاد شده به وسیله الکتروفورز بر روی ژل آگارز 2 درصد و رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید و مقایسه با lader marker 50bp تعیین خواهد گردید. پس از انجام الکتروفورز و انجام رنگ امیزی، ژل آگارز به transduct منتقل شده و عکس برداری و آنالیز PCR بر روی آن انجام می گیرد . اطلاعات بدست آمده از مقایسه آلل های بررسی شده ژن EBA-175 در جمعیت با سوش استاندارد پلاسمودیوم فالسیپاروم حاوی این آللها به وسیله نرم افزار های انالیز اماری (( SPSS18 به استفاده از آزمون کای- اسکوئر انجام می دهیم . پس از انجام انالیز ها اطلاعات مذبور جهت نشرگزارش نهایی پایان نامه قرار خواهند گرفت. فالسیپاروم کمک شایانی خواهد کرد. |
| سوالات و / یا فرضیات پژوهش | 1-توزیع فراوانی پلی مورفیسم در ژن کد کنندهEBA-175 در بین ایزوله های جدا شده از افراد مبتلا به مالاریا چگونه است؟ 2- توزیع فراوانی همولوژی در الگوی ژنو تیپی بین ایزوله های جدا شده از افراد مبتلا به مالاریا فالسی پاروم چگونه است؟ 3-توزیع فراوانی جمعیت های ژنتیکی ایزوله های جدا شده از افراد مبتلا به مالاریای فالسی پاروم به روش Nested- PCR چگونه است؟ |
| هدف کلی طرح | تعیین ژنوتیپ آلل های C loop(CAMP) و F loop (FCR-3) آنتی ژن 175 کیلو دالتون متصل شونده به گلبول قرمزانگل پلاسمودیوم فالسیپاروم مالاریا (EBA-175) به روش Nested-PCR در منطقه جنوب شرقی ایران(چابهار،نیکشهر،سرباز،ایرانشهر) |
| اهداف اختصاصی | 1-تعیین توزیع فراوانی پلی مورفیسم در ژن کد کننده آنتی ژن EBA-175 در بین ایزوله های جدا شده از افراد مبتلا به مالاریا 2-تعیین توزیع فراوانی همولوژی در الگوی ژنوتیپی بین ایزوله های جدا شده از افراد مبتلا به مالاریای فالسیپاروم 3-تعیین توزیع فراوانی جمعیت های ژنتیکی ایزوله های جدا شده از افراد مبتلا به مالاریای فالسیپاروم به روش Nested_PCR 4- مقایسه بین آلل های ژن EBA-175هر فرد با فرد دیگر |
| سازمانها، مراکز و موسسات و سایر بهره برداران بالقوه دستاوردهای طرح | مراکز خدمات بهداشتی- درمانی |
| تعریف واژه های تخصصی | Nested-PCR: تکنیکی دومرحله ای است که جفت پرایمر دوم در محدوده محصول آمپلی فیکاسیون مرحله اول قرار می گیرد.از این روش جهت تعیین گونه،سوش،کلون و مقاومت دارویی استفاده می شود. عفونت مولتی کلونال: به آلودگی فرد با بیش از یک کلون انگلی گفته می شود. |
| نوع مطالعه | توصیفی-مقطعی |
| جامعه مورد مطالعه(معرفی مشارکت کنندگان)/ محیط پژوهش(معیارهای ورود و خروج ذکر شوند) | کلیه افراد مبتلا به مالاریای فالسیپاروم در ناحیه جنوب شرق ایران(چابهار،نیکشهر،سرباز،ایرانشهر) در سال 1391 که دارای معیارهای زیر باشند: معیار ورود: افرادی که آزمایش میکروسکوپی گسترش خون آنان از لحاظ پلاسمودیوم فالسیپاروم مثبت بوده و طی ماه گذشته تحت درمان قرار نگرفته باشندو مثبت بودن لام آنها به کمک نوار های Rapid test مرکز بهداشت تایید شده باشند. معیار خروج: افرادی که رضایت به همکاری ندارند، از مطالعه خارج می شوند. |
| حجم نمونه و روش محاسبه آن | با توجه به مقالات مشابه انجام شده در منطقه بر روی دیگر ژنها و اللها حجم نمونه معادل 70 محاسبه گردید که با توجه به امکان نمونه گیری بیشتر حجم نمونه را به 100 نمونه افزایش می دهیم. |
| روش نمونه گیری(نحوه تخصیص تصادفی و همسانسازی در صورت لزوم ذکر شود) | از آنجا که چارچوب نمونه گیری ما مشخص نیست، به روش نمونه گیری در دسترس نمونه ها را از منطقه جنوب شرقی ایران(چابهار،نیکشهر،سرباز،ایرانشهر) جمع آوری می نماییم؛ بدین صورت که دو روز در هفته به مرکز بهداشت شهرستانهای مذکور(چابهار،نیکشهر،سرباز،ایرانشهر) مراجعه و از بین بیمارانی که از نظر میکروسکوپی به پلاسمودیوم فالسیپاروم مبتلا بودند وRapid Test آنها مثبت تشخیص داده شد، نمونه گیری کرده و با حفظ زنجیره سرد، جهت انجام آزمایش به دانشکده بهداشت زاهدان منتقل می نماییم.نمونه گیری از تاریخ تصویب طرح تا تاریخ رسیدن به حجم نمونه ادامه خواهد یافت. |
| روش و ابزار جمع آوري داده ها / صحت و استحکام داده ها (پرسشنامه یا فرم اطلاعاتی ضمیمه شود) | 1- فرم اطلاعاتی ساده 2- میکروسکوپ نوری جهت تشخیص لام های مثبت پلاسمودیوم فالسیپاروم 3- نوارهای تشخیص سریع پلاسمودیوم فالسی پاروم مرکز بهداشت 4- روش های ملکولی Nested-PCR |
| روش اجرای طرح(با جزئیات بطور کامل شرح داده شود) | پیش از انجام نمونه گیری مواد و تجهیزات لازم تا مرحله استخراج DNA (به جز تهیه پرایمر ها ) از شرکت های معتبر آزمایشگاهی خریداری شده و در محل مرکز تحقیقات بیماری های گرمسیری شهرستان زاهدان نگهداری می گردد. فرم های پرسشنامه و فرم های اطلاعاتی مربوط به نمونه های اخذ شده توسط نمونه گیر(شخص دانشجو ) به طور کامل پر شده و به همراه نمونه در محفظه Cold Box قرار گرفته تا انتقال زنجیره سرد رعایت گردد. پس از انجام نمونه گیری از مناطق چهار گانه مالاریا خیز جنوب شرقی ایران شامل : چابهار،ایرانشهر،نیکشهر و سرباز، نمونه های خون تام به صورت تازه در ویال های EDTA به مرکز تحقیقات عفونی و بیماریهای گرمسیری زاهدان منتقل وجهت بررسی میکروسکوپی ، رنگ آمیزی گیمسا و جداسازی DNA نگهداری می گردند. DNA نمونه ها با استفاده از کیت استخراج DNA ، Qiagene به سرعت انجام می گیرد که پروتکل انجام روش استخراج دقیقا بر اساس کیت دنبال شده و متعاقبا در روش انجام طرح ذکر گردیده است : استخراج DNA آماده سازی نمونه: خون تام بایستی در لوله های آغشته به سیترات و یا EDTA جمع آوری گردد تا از ایجاد لخته جلوگیری و DNA تجزیه نگردد. DNA جدا شده از خون های حاوی هپارین را نمی توان جهت PCR مورد استفاده قرار داد. به طور عادی Lµ200 از خون تازه برای DNA به اندازه ی gµ2- 10 مورد استفاده قرار می گیرد. اگر مقدار بیشتری DNA مورد نیاز باشد ، Lµ500 از خون تام بایستی در یک میلی لیتر آب مقطر لیز گردد، لکوسیت ها از محیط خارج شوند (سانتریفوژ در 2 دقیقه با دور rpm5000 ) و Lµ 200 از بافر TE در داخل پلت قرار می گیرد . خون را به مدت 2 ماه می توان در دمای 2-4 درجه سانتی گراد نگهداری نمود . برای نگهداری های بیش از 2 ماه باید نمونه ها را به حجم های Lµ 200 تقسیم کرده و در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری کرد. پروتکل استخراج DNA با استفاده از کیت(برگردان کامل پروتکل استخراج DNAکیت به فارسی) 1. Lµ 200 از نمونه را با Lµ 400 از محلول لایز به خوبی مخلوط نمائید و به مدت 5 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی گراد انکوبه کنید. *اگر از نمونه های فریز شده استفاده می کنید، محلول لایز را بایستی قبل از باز شدن فریز به نمونه های اضافه نمائید. سپس نمونه ها را در دمای65 درجه سانتی راد به مدت 10 دقیقه انکوبه نموده و لوله را به طور متناوب به آرامی معکوس(INVERT) کنید. 2. بلافاصله Lµ 600 کلروفرم به پلت اضافه کرده و 3-5 بار معکوس کنید تا به حالت امولسیون در آید و به مدت 2 دقیقه با دور rpm10000 سانتریفوژ نمایید. 3. محلول رسوب دهنده را با مخلوط کردن Lµ 720 از آب دیونیزه ی استریل با Lµ 80 از محلول رسوب دهنده ی غلیظ x10 موجود در کیت تهیه نمایید . 4. فاز آبی فوقانی را که حاوی ماده DNA می باشد را به یک لوله جدید منتقل نموده و Lµ 800 از محلول رسوب دهنده ی تازه تهیه شده را به آن اضافه کنید و به آرامی مخلوط نموده ( با چند بار اینورت کردن) و دمای اتاق به مدت 1-2 دقیقه قرار می دهیم و سپس با دور rpm10000 به مدت 2 دقیقه سانتریفوژ می نماییم. 5. سوپرتانت (بخشی رویی تشکیل شده ) را به طور کامل خارج نموده و پلت حاوی DNA را با Lµ 100 از محلول NaCL مخلوط نموده و به آرامی ورتکس می کنیم. *مطمئن شوید که پلت به طور کامل حاوی مواد محلول شده است . 6. Lµ 300 از اتانول سرد را به پلت اضافه نموده و اجازه می دهیم رسوب DNA تشکیل شود (10 دقیقه در دمای 20- سانتی گراد) و سپس به مدت 3-4 دقیقه با دور rpm10000 سانتریفوژ می نمائیم. اتانول را خارج می کنیم ، پلت را یکبار با اتانول 70% سرد شستشو داده و DNA را با Lµ 100 از آب دیونیزه استریل به حالت محلول درآورده و به آرامی ورتکس می نماییم . نکته: *به علت مقادیر کم DNA در نمونه های سرمی رسوب دهی DNA را به مدت یک تا 2 ساعت در دمای 20- درجه سانتی گراد ادامه می دهیم و حجم آب اضافه شده را به Lµ 20 تقلیل می دهیم . *برای کاربرد PCR شستشوی DNA با اتانول 70% ضروری نیست. *اگر نیاز به DNA ژنومیک حاوی RNA آزاد باشد ،RNAaseA(#ENO531) با غلظت 2/. Mg/ml بعد از مرحله ی 5 به محصول نهایی اضافه شده ، ورتکس گردیده و به مدت 10 دقیقه در دمای 37درجه سانتی گراد انکوبه می گردد. 7. غلظت DNA را با استفاده از روشهای اسپکتروفتومتری و یا به صورت چشمی بعد از الکتروفورز بر روی ژل آگارز می سنجیم ، عدم حضور RNA و مقدار تخمینی طول DNA را چک می نماییم . اغلبg µ 2-10 DNA از Lµ 200 خون تازه دارای طول متوسط تقریبی 50kb می باشد. نکته : *در نمونه های خونی |
| روش تجزیه، تحليل و توصیف دادهها (نمونهاي از جدول توخالي ضميمه شود و روش هاي آماري مورد استفاده به طور كامل توضيح داده شود)(کیفی و کمی) | با استناد به روشهای آمار توصیفی (جدول توزیع فراوانی،رسم نمودار) و روشهای آمار استنباطی(آزمون مقایسه نسبت با یک عدد ثابت) و استفاده از آزمون کای -اسکوئرداده ها تجزیه و تحلیل می شوند. |
| ملاحظات اخلاقی | نمونه گیری و مصاحبه با رضایت کامل افراد مبتلا به مالاریا انجام خواهد شد،هم چنین تعهد می شود نام و مشخصات بیماران در هیچ گزارشی قید نشود.(کدهای اخلاقی 1،2،17،20 لحاظ شده است |
| محدودیتهای اجرائی طرح و پیش بینی جهت حل آنها | - مشکل تهیه مواد وامکان طولانی شدن زمان دریافت آنها راه حل: تصویب سریع تر طرح و دریافت بودجه آن - عدم نمونه گیری مناسب راه حل: آموزش به فرد نمونه گیر - عدم همکاری بیمار راه حل: توضیح دادن در مورد منافع این طرح و این که هیچ ضرری متوجه آنان نخواهد شد و اطلاعات آنها به طور محرمانه باقی خواهد ماند و نامشان فاش نخواهد شد |
| کلمات کلیدی | پلاسمودیوم فالسی پاروم Plasmodium falciparum -تعیین ژنوتیپ Genotyping -آنتی ژن175کیلودالتون متصل شونده به گلبول قرمز Erythrocyte Binding Antigen175kd(EBA)-175 |
| فهرست منابع و مراجع | 1. عشاقی محمد علی ، مرادی محمد تقی، تقی لو بهروز، تشخیص گونه های انگل مالاریا به روش Nested-PCR در پشه های ناقل و خون های آلوده منطقه چابهار و ایرانشهر ایران. مجله پژوهشی حکیم، پاییز 83، دوره هفتم ، شماره سوم ،ص 24-31 2. Perce-da-silva et al. Evaluation of allelic forms of the erythrocyte binding antigen175(EBA-175) in Plasmodium falciparum field isolates from Brazilian endemic area. Bio Med Central malaria journal 2011,10:146 3. رئیسی احمد ، شهبازی عباس، رنجبر منصور، ناطق پور مهدی، رینگوالد پاسکال، فرجی لیلا، پایش تاثیر درمانی داروی کلروکین بر روی مالاریای فالسیپاروم بدون عارضه در استان های سیستان و بلوچستان ،هرمزگان و کرمان ، سال های 1381-1382. مجله پژوهشی حکیم ،زمستان84، دوره هشتم، شماره چهارم ،ص 21-25 4. رخشانی فاطمه ،انصاری مقدم علیرضا، عالمی رضا.آگاهی، ادراک و عملکرد زنان منطقه بلوچستان در مورد مالاریا. مجله طبیب شرق،بهار 1380 ، سال سوم،شماره 1،ص 9تا 15 5. Soulama Issiaka et al. Genetic Diversity of Polymorphic Vaccine Candidate Antigen (Apical Membrane Antigen -1,Merozoite Surface Protein-3, and Erythrocyte Binding antigen -175) in Plasmodium falciparum Isolates from Western and Central Africa . Am.j.trop.med.hyg,84(2),2011,pp,276-284 6. B. Kim Lee Sim et al. Delineation of Stage Specific Expression of Plasmodium falciparum EBA-175 by Biology Functional Region 2 Monoclonal Antibodies. PLoS one ,Aprill 2011,volume 6,issue 4,e18393 7. Heidari A, Keshavarz H, Dittrich S,Jelinek T. Allelic dimorphism of the Plasmodium falciparum Erythrocyte Binding antigen -175(EBA-175) Gene in the South east of Iran . Iranian j parasitol:vol 4,no.2,2009,pp.17-22 8. Soulama Issiaka et al.low-high season variation in Plasmodium falciparum Erythrocyte Binding antigen -175(EBA-175) allelic forms in malaria endemic area of Burkina Faso .Trop Med Int Health.2010 January:15(1):51-59 9. H.M.EL Sahly et al.safety and immunogenicity of a recombinant nonglycosylated Erythrocyte Binding antigen -175 Region 2 malaria vaccine in healthy adults living in an area where malaria is not endemic.clinical andvaccine immunology ,oct.2010,p.1552-1559 10. باصری حمیدرضا،هلاکویی نائینی کوروش،رئیسی احمد ، شاهنده خندان، اکبر زاده کامران ،رنجبر منصور ، پروین عبدالمحسن. مقایسه آگاهی ، نگرش وعملکرد مهاجرین افغانی با ایرانیان نسبت به انتقال و پیشگیری از مالاری در شهرستان ایرانشهر، 1384-1385.مجله تخصصی اپیدمیولوژی ایران؛1386،دوره 3،شماره 3و4:صفحات 7-13 11. جهانی محمد رضا، مهرابی توانا علی، خزائی ایرج،بررسی بروز بیماری مالاریا در یگانهای ناجا در سال 1378 در استان سیستان و بلوچستان. مجله طب نظامی ،بهار و نابستان 1379 شماره2،صفحات 7-10 |
| نام فایل | تاریخ درج فایل | اندازه فایل | دانلود |
|---|---|---|---|
| rezayatname akhlaghi - Copy.doc | 1391/02/12 | 90624 | دانلود |
| پرسشنامه.docx | 1391/02/12 | 18612 | دانلود |
| d.PNG | 1391/02/12 | 283364 | دانلود |
| s.PNG | 1391/02/12 | 79853 | دانلود |
| 91.4.21.doc | 1391/04/22 | 81920 | دانلود |
| nahaeeeeeeeeeeeeeeee1.doc | 1391/04/27 | 306688 | دانلود |
