چاپ صفحه |  صفحه نخست سامانه |  مجری و همکاران |  اطلاعات تفضیلی |  دانلود | علوم پزشکی زاهدان |
| کد طرح | 5470 |
| عنوان فارسی طرح | بررسی میزان شیوع پلی مورفیسم در آلل های 3D7 –K1-HB3 آنتی ژن غشا راسی(AMA1) در بیماران مبتلا به مالاریای فالسی پاروم وارده از خارج از کشور و انتقال محلی در جنوب شرقی ایران |
| عنوان لاتین طرح | A Survey of Polymorphism at the allels 3D7 –K1-HB3 of Apical Membrane Antigen-1( AMA1) of Plasmodioum Falciparum Between Imported and Indigenous Malaria cases in isolated from south-east of Iran |
| نوع طرح | |
| محل اجرای طرح | مرکز تحقیقات بیماریهای عفونی و گرمسیری |
| رسته مطالعاتی | توصیفی- تحلیلی |
| دانشکده/مرکز | دانشکده پزشکی زاهدان |
| زمان اجرا -روز |
| نام و نامخانوادگی | سمت در طرح | نوع همکاری | درجهتحصیلی | پست الکترونیک |
|---|---|---|---|---|
| عادل ابراهیم زاده | مجری | استاد راهنما | دکترا(p.h.d) | |
| محمد جعفری مدرک | مجری دوم | مشاور طرح | دکترای تخصصی | mjafari547547@yahoo.com |
| عبدالعزیز قرائی | همکار |
| عنوان | متن |
|---|---|
| خلاصه طرح به فارسی | بررسی میزان شیوع پلی مورفیسم در آلل های 3D7 –K1-HB3 آنتی ژن غشا راسی(AMA1) در بیماران مبتلا به مالاریای فالسی پاروم وارده از خارج از کشور و انتقال محلی در جنوب شرقی ایران |
| خلاصه طرح به لاتین | A Survey of Polymorphism at the allels 3D7 –K1-HB3 of Apical Membrane Antigen-1( AMA1) of Plasmodioum Falciparum Between Imported and Indigenous Malaria cases in isolated from south-east of Iran |
| بيان مسئله تحقيق/اهمیت پژوهش | مالاریا یک مشکل بهداشتی جهانی است که حدودآ225 میلیون نفر در سال 2009به مالاریا مبتلا شدند که 781000 نفر مرگ به همراه داشته است .(1 )موارد شدید بیماری که به مرگ منجر می شود بوسیله پلاسمودوم فالسی پاروم ایجاد می شود(2 )پلاسمودیوم فالسی پاروم مسئول مرگ و میر بیش از 0.9 میلیون نفر در هر سال است ، که 89 درصد این موارد در کودکان زیر 5 سال و زنان بارداری اتفاق می افتد که در مناطق اندمیک مالاریا زندگی می کنند.(3و4) حدود 10 تا 30 درصد از کودکانی که به مالاریای سخت فالسیپاروم مبتلا می گردند، تلف می شوند و عده ای هم اختلالات عصبی دائمی پیدا می کنند.(5) تلفات و زیان های اجتماعی –اقتصادی ناشی از مالاریا در مناطق مالاریا خیز سبب عدم توسعه، فقر و عقب ماندگی در تعدادی از کشورها شده است. در بعضی از کشورها که بر اثر عملیات مبارزه با مالاریا انتقال این بیماری قطع شده و یا کاهش یافته بود، مالاریا دوباره ظاهر شده و بیماری در حال گسترش به مناطق جغرافیایی جدید است. (5و6) علی رغم تلاشهای گسترده برای کنترل و پیشگیری مالاریا،عوامل متعددی شامل مقاومت پشه های ناقل به حشره کش ها،عدم تولید واکسنهای کار آمد وگسترش سریع سویه های مقاوم به درمان ، وضعیت مالاریا در جهان را وخیم نموده است.(7) تنوع ژنتیکی موجود در ایزوله های پلاسمودیوم فالسی پاروم (وجود انواع مختلف انگل در نواحی جغرافیایی متفاوت)و وجود ژنوتیپ های متعدد در یک نوع پشه خاص ازمهم ترین مشکلات پیش رو در زمینه طراحی واکسن مالاریا می باشند،( چنین پلی مورفیسم گسترده آنتی ژنی ، توانایی انگل ها را برای مخفی شدن از سیستم ایمنی بدن افزایش می دهد و سیستم ایمنی بدن توانایی ایجاد پاسخ مناسب در مقابل این دامنه گسترده از آنتی ژنهای متنوع در حال گردش از جمعیت انگل ها را ندارد.(8و9) مقاومت به پلاسمودیوم به دلیل وجود آنتی بادی های محافظت کننده ی طبیعی در ساکنین مناطق هایپراندمیک نشان دهنده ی وجود آنتی ژن های ایمونوژنیک در مرحله ی خونی پلاسمودیوم فالسیپاروم است.(10) به عنوان مهم ترین عامل ارتباط بین میزبان و عامل بیماریزا سطح مروزوئیت را می توان به عنوان یک هدف مشخص برای تولید واکسن مالاریا در نظر گرفت.تعداد زیادی از آنتی ژنهای بالقوه داوطلب برای تولید واکسن که تاکنون مورد شناسایی قرار گرفته اندیا بر روی سطح مروزوئیت ها و یا ارگانلهای اپیکال قرار دارند و یا در ارتباط با آنها هستند.(11 ) مطالعات نشان داده است که تفاوت های جغرافیایی در بیولوژی انگل تاثیر میگذارند و باعث تغییر و تنوع در ژن های بخصوص ، و در نهایت با پدیده انتخاب طبیعی منجر به ظهور سویه های جدید میگرددکه در یک منطقه اندمیک توسط ناقلین منتقل می شود و این تنوع و تفاوت در حقیقت ،ساختار جمعیتی انگل را دریک منطقه نشان می دهند .که آگاهی از آنها در شناسایی چهره بالینی و اپیدمیولوژی بیماری ،ساخت داروهای جدید و طراحی واکسن موثر، ضرورت ویژه ای دارد لذااطلاعات بنیادی از این تغییرات ضروری است. (12) امروزه روش های مولکولی به عنوان ابزار های سریع و کارامد و قابل اطمینان جهت تعیین پلیمورفیسم ژنهای مرتبط با این تغییرات به کار میرود. (12) یکی از ژن های مهم که برای این منظور به کار میروند ژن کد کننده آنتی ژن غشاء راسی -(AMA1) میباشد (13) عملکرد واقعی (AMA1) به خوبی مشخص نشده است ولی نقش ضروری در تهاجم مروزوئیت به گلبول قرمز را دارد. علاوه براین ، انتی بادی های علیه PFAMA1 ازارائه انتی ژن و تهاجم مروزوئیت ممانعت می کند. (14) گرچه به خاطر اهمیت نیاز آن در چرخه زندگی پلاسمودیوم ها ، در گونه های مختلف این جنس محافظتCONSERVED شده است ولی نقاطی ازآن پلی مورفیک بوده که میتوان از تغییر ایجاد شده در آن نقاط به منظور شناسایی پلی مورفیسم انگل استفاده کرد .(12) AMA1یک پروتئین غشایی اینتگرال با وزن مولکولی 83 کیلودالتون و 55آمبنواسیدسیتوپلاسمی و 550آمینواسیدخارج سلولی است که شامل سه قطعه (DOMAIN)1-2-3 در داخل باند های دی سولفیدی اش می باشد .اگرچه عملکرد دقیق آن شناسایی نشده است ولی بیان آن در مراحل نهایی ایجاد شیزونت در انگل است و(بیان ) نیاز به تهاجم مروزوئیت به گلبول قرمز و تهاجم اسپروزوئیت به هپاتوسیت ها دارد .آنتی بادی های ایجاد شده علیه AMA1 باعث جلوگیری از این تهاجم انگل به RBC می شود.(15) مناطق اکستراسلولار PFAMA1 از سه دومین تشکیل شده که دومین 1 دارای بیشترین تنوع آنتی ژنیکی می باشد.(16) پاسخ های ایمنی حفاظتی تحریک شده به وسیله این آنتی ژن اختصاصی بوده و نشان دهنده آن است که این پلی مورفیسم ها ناشی از انتخاب تنوع برانگیز هستند.(15) 13 لوکوس پلی مورفیک که در قطعه 1 AMA1شناسایی شده است AMA1 یکی از مهم ترین کاندیدهای واکسن می باشد ایمیونیزاسیون Membrane Antigen-1, Merozoite Surface Protein-3, and Erythrocyte Binding Antigen-175) in Plasmodium falciparum Isolates from Western and Central Africa. Am. J. Trop. Med. Hyg., 84(2), 2011, pp. 276–284 16- Hodder, A.N., Crewther, P.E., Matthew, M.L.S.M., Reid, G.E., Moritz, R.L., Simpson, R.J., Anders, R.F., 1996. The disulfide bond structure of Plasmodium apical membrane antigen -1. J. Biol. Chem. 271, 29446–29452. 17- Sheetij Dutta,Seung Yeon Lee,AdrianH.Batchelor,and David E.lanar.Structural basis of antigenic escape of malaria vaccine candidate.National Academy of science of the USA,2007 18- Kennedy, M.C., Wang, J., Zhang, Y., Miles, A.P., Chitsaz, F., Saul, A., Long, C.A., Miller, L.H., Stowers, A.W., 2002. In vitro studies with recombinant Plasmodium falciparum apical membrane antigen 1 (AMA1): production and activity of an AMA1 vaccine and generation of a multiallelic response. Infect. Immun. 70, 6948–6960 . Polley, S.D., Mwangi, T., Kocken, C.H., Thomas, A.W., Dutta, S., Lanar, D.E., Remarque, E., Ross, A., Williams, T.N., Mwambingu, G., Lowe, B., Conway, D.J., Marsh, K., 2004. Human antibodies to recombinant protein constructs of Plasmodium falciparum Apical Membrane Antigen 1 (AMA1) and their associations with protection from malaria. Vaccine 23, 718–728. 19-Cortes, A., Mellombo, M., Mueller, I., Benet, A., Reeder, J.C., Anders, R.F., 2003. Geographical structure of diversity and differences between symptomatic and asymptomatic infections for Plasmodium falciparum vaccine candidate AMA1. Infect. Immun. 71, 1416–1426. Escalante, A.A., Grebert, H.M., Chaiyaroj, S.C., Magris, M., Biswas, S., Nahlen, B.L., Lal, A.A., 2001. Polymorphism in the gene encoding the apical membrane antigen-1 (AMA-1) of Plasmodium falciparum. X. Asembo Bay Cohort Project. Mol. Biochem. Parasitol. 113, 279–287 Quang, N.D., Hoa, P.T., Tuan, M.S., Viet, N.X., Jalloh, A., Matsuoka, H., 2009. Polymorphism at the apical membrane antigen 1 gene (AMA1) of the malaria parasite Plasmodium falciparum in a Vietnamese population. Biochem. Genet. 47, 370–383. 20- Garg, S., Alam, M.T., Das, M.K., Dev, V., Kumar, A., Dash, A.P., Sharma, Y.D., 2007. Sequence diversity and natural selection at domain I of the apical membran antigen 1 among Indian Plasmodium falciparum populations. Malaria Journal 6, 154. 21- Umar Farooq, N. Malla & M.L. Dubey , Genetic polymorphism in msp-2, ama-1 and csp genes in Plasmodium falciparum field isolates from north and north-western India, J Vector Borne Dis 46, June 2009, pp. 109–116 22- Ahmad Mardani, Hossein Keshavarz, Aliehsan Heidari, Homa Hajjaran, Ahmad Raeisi, Mohammad Reza Khorramizadeh:2012: Genetic diversity and natural selection at the domain I of apical membrane antigen-1 (AMA-1) of Plasmodium falciparum in isolates from Iran: Experimental Parasitology 130 (2012) 456–462 23- Khalili MB, Anvari Tafti MH, Sadeh M. Epidemiological pattern of malarial disease in the province of Yazd, Iran (Since 1986-2006). World Journal of Medical Sciences(World J. Med. Sci.) 2009; 4(1): 41-45. 24-- WHO. Iran (Islamic Republic of). 2009. Available from: http://www.who.int/malaria/publications/country-profiles/profile_irn_en.pdf 25- دکتر گویا،دکتر رئیسی احمد وهمکاران -وزارت بهداشت ایران –کتاب حذف مالاریا-1389 صفحه 5-حذف انتقال محلی مالاریای میزان DNA بسته به میزان سلول های لکوسیتی متفاوت است. *DNA های ویروسی بدست آمده از از نمو نه های سرمی در ژل اگارز قابل مشاهده نمی باشد * Lµ 1-5 از محلول DNA برای Lµ 50 PCR کفایت می کند. پس از استخراج DNA ، پرایمر های اختصاصی ژن ama1 جهت انجام Nested-PCR سفارش داده می شود که این پرایمر ها ذیلا ذکر گردیده اند. External Primers for Nested-PCR of ama1 gene: Forward: 5- CCGGATCCCCTTTGAGTTTACATATATG--3 Reverse: 5- AAATTCTTTCTAGGGCAAAC- -3′ Internal Primers for Nested-PCR of ama1 Gene: Forward: 5-GGAACTCAATATAGACTTCC-3′ Reverse: 5- AAATTCTTTCTAGGGCAAAC- -3′ جهت انجام Nested-PCRاز DNA استخراج شده(1.5 میکرولیتر) و Premix-PCR استفاده می گردد. بدین صورت که ابتدا از DNA استخراج شده پلاسمودیوم فالسیپاروم بیماران در 35 سیکل در دمای 95 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه ،50 در جه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه و 65 درجه سانتی گراد به مدت 1 دقیقه به همراه یک مرحله نهایی در 65 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه با استفاده از پرایمر های External ،PCR اولیه انجام می گیرد. واکنش Nested –PCR تحت شرایط ذکر شده قبلی صورت خواهد گرفت با این تفاوت که به جای DNA-template بیماران مبتلا به پلاسمودیوم فالسیپاروم از محصول واکنش PCR (1 میکرولیتر) اولیه استفاده می گردد. طبقه بندی آلل های ama1ـ(3D7-K1-HB3) به وسیله تفاوت در اندازه (size variation) ایجاد شده به وسیله الکتروفورز بر روی ژل آگارز 2 درصد و رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید و مقایسه با lader marker 50bp و سکانس محصولPCR تعیین خواهد گردید. پس از انجام الکتروفورز و انجام رنگ امیزی، ژل آگارز به transduct منتقل شده و عکس برداری و آنالیز PCR بر روی آن انجام می گیرد . ضمنا PCR PRODUCT سکانس خواهد شد .اطلاعات بدست آمده از مقایسه آلل های بررسی شده ژن ama1 در جمعیت با سوش استاندارد پلاسمودیوم فالسیپاروم حاوی این آللها به وسیله نرم افزار های انالیز اماری (( SPSS18 به استفاده از آزمون کای- اسکوئر انجام می دهیم . پس از انجام انالیز ها اطلاعات مذبور جهت نشرگزارش نهایی پایان نامه قرار خواهند بواسطه AMA1 آنتی بادی هایی را تحریک می کند که مانع تهاجم انگل می شود واکسن های AMA1 براساس 3D7 وFVO در حال حاضراز کارایی بالایی در انسان برخوردارند به رغم وجود شواهد بالینی به نفع کارامدی واکسن ، بااین وجود در حال حاضر بیش از 60 سایت پلیمورفیک در پروتئین AMA1 شناسیایی شده است (17) پلی مورفیسم ژنتیکی و تنوع آنتی ژنیکی در انگل مالاریا، مانع پیشرفت تهیه واکسن مالاریا می باشد. این امر به علت انتی بادی های ایجاد شده علیه یکی از اشکال آللی آنتی ژن های است که به طور غیر قابل اجتناب ممانعت می کند از تهاجم به گلبول قرمز، بوسیله الل های متفاوتی از انتی ژن را که بروز می دهند(18) بنابراین جزئیات مطالعات مولکولی بر روی پلی مورفیسم PFAMA1در یک منطقه ژئوگرافیکی قبل از هر آزمون تجربی یا طراحی واکسن ،اجرا شود.(19) مطالعه ی مشابهی در هندوستان در سال 2007 توسط Sheena Garg وهمکارانش بر روی تنوع وانتخاب طبیعی AMA1 در قطعه ی 1در 157 نمونه از جمعیت میتلا به پلاسمودیوم فالسی پاروم انجام شده بود که از روش مولکولی NESTED PCR و با 157 نمونه انجام شده بود پرایمر مورد استفاده (3—5-ACAAAAATGAGAAAATTATACTGC)F-AMA1 و TTTTAATAGTATGGTTTTTCCATC-3)-5)R می باشد مطالعه ی صورت گرفته بر روی توالی 456 BP ی ژن کد کننده آمینواسید ها برای این 157 نمونه نشان داد که جایگاه 418 نوکلئوتیدی یا مونومورفیک و یا بدون تغییر است ،44 جایگاه دیگر 9/64%پلی مورفیک بوده که 57 هاپلوتایپ AMA1 را ایجاد می کند 2 هاپلوتایپ شایع شامل H56 (37/13%)وh 57 (92/15)%می باشند.همچنین در هیچکدام از ایزوله ها،آلل های 3D7 وdd2وhb3 تفاوت توالی مشاهده نگردید . (20) مطالعه دیگری در سال 2010 در غرب و مرکزافریقا توسط ISSIAKA SOULMA و همکارانش انجام شده که از روش RFLP و از318نمونه فیلتر پیپر استفاده شده بود که معلوم گردید که هتروزایگوسیتی PFAMA1 از MSP3 وEBA 175 بیشتر بوده است.ومعلوم شده که نقشه ژئوگرافیکی انگل می تواند تنوع آنتی ژنیکی متفاوتی را داشته باشد .اطلاعات بدست آمده نشان می دهد که آلل 3D7 از کمترین شیوع در این نواحی برخودار است که می تواند به علت انتخاب طبیعی منطقه ای بواسطه پاسخ های ایمنی همورال باشد به طور طبیعی تنوع AMA1 در مناطق مورد بررسی ،بسیار بالا بود که می تواند مشکلاتی را جهت تولید واکسن بر اساس این آنتی ژن ایجاد نماید .(15) مطالعه ی مشابه دیگر توسط UMAR FAROOQ و همکاران، باعنوان بررسی تنوع ژنتیکی AMA1در ایزوله های شمال و شمال غربی هند ،88 نمونه بالینی را مورد ارزیابی قرار داد که از این میان 67 نمونه با روش RFLP درمورد توالی AMA1 مورد ارزیابی قرار داد که سه تایپ آللی شناسایی شد1)-33 نمونه با وزن مولکولی 950 کیلودالتون 2)-31 نمونه با وزن مولکولی 1000 کیلودالتون و3)- سه نمونه باوزن مولکولی 800 کیلودالتون شناسایی شدRE استفاده شده در این مطالعه (DRA1)می باشد (21) مطالعه ای توسط دکتر مردانی و دکتر کشاورز وهمکاران در دانشگاه تهران در سال 2009 در این خصوص انجام شده و 48 نمونه از کشورایران به روش NESTED PCR موردبررسی قرار گرفته است .به طور خلاصه در این مطالعه سطح بالایی از تنوع نوکلئوتیدی و هاپلوتایپ ازDOMAIN 1)) PFAMA1،را تععین کرده است نتایج بدست آمده همچنین اثبات کرده که انتخاب طبیعی نقش بزرگی را در حفظ تنوع ژنتیکی AMA1 ،تنوع بین ژنی ،در تنوع مشاهده شده از AMA1 ممکن است شرکت کند.22)) یک قطعه 630 bp از ژن AMA1 شامل قطعه ی اول بوسیله روش NESTED PCR از 48 نمونه جمع آوری شده از دومنطقه اندمیک مالاریا از ایران در سال 2009 تا اگوست 2010 و تعیین توالی شدند.هیچ PCR PRODUCTدر نمونه های کنترل منفی ،بدست نیامده است همانند آن هیچ پلی مورفیسم نوکلئوتیدی در اینترون 1 ژن CK1و CDPKوهمه یتوالی شناسایی شده، نبود .اطلاعات توالی قابل آنالیز است برای منطقه 528 bp ی که شامل تمام توالی قطعه ی اول AMA1 می باشد .غیر ازآنالیز توالی 528 bpی ،498 سایت نوکلئوتیدی مونومورفیک یا (invariable) پیداشده است.و 30 سایت باقیمانده 2 سایت singleton variable و28 سایت parasimony informative پلی مورفیک polymorphic بودند از میان 30 سایت پلی مورفیک ،سه سایت 688-599-586 trimorphic بودنددرحالیکه بقیه dimorphic بودند . به طور متوسط تعداد جفت نوکلئوتید های متفاوت (k )9.321 در توالی ژن AMA1بوده است ودر این مطالعه موقعیت آمینواسید های polymorphic در 25CODON از 176 CODONمشاهده شده است. ازاین 25 سایت polymorphic دو سایت (200-197) . سه سایت 196-230-242 موقعیت های trimorphicو tetramorphic داشتندو بقیه 20 سایت dimorphicبودند.22)) یافته های این مطالعه نشان داد که نسبت dnبهds موتاسیون های غیر متشابه به موتاسیون های متشابه برای توالی آنالیز شده ازDOMAIN 1 ) PFAMA1به طور معنی داری بیشتر از p<0.05در نمونه های ایزوله شده از ایران بود که نشان دهنده تاثیرNatural selection مثبت دراین قطعه است. (22) کشور ایران در منطقه مدیترانه شرقی واقع شده است.(23) 16 درصد از جمعیت این کشور در معرض خطر ابتلا به مالاریا قرار دارند.90 درصد موارد ابتلا از سه استان سیستان و بلوچستان،هرمزگان و کرمان منشا می گیرد، که در این میان60 درصد موارد مربوط به سیستان و بلوچستان می باشد. بیشترین میزان بروز پلاسمودیوم فالسی پاروم در برخی از شهرهای مرزی سیستان و بلوچستان ،گزارش شده است. (24-23) در حال حاضر استان س و ب درمرحله حذف انتقال محلی فالسی پاروم تا سال 2015 میلادی میباشد(25)بنا به گزارش آماری مرکز بهداشت استان موارد مالاریای فالسی پاروم وراده سال 90 -350 مورد و موارد انتقال محلی 112 مورد می باشد. با توجه به اهمیت بیماری مالاریای فالسیپاروم و هدف برنامه حذف انتقال محلی فالسی پاروم تا سال 2015 در ایران وهمسایه بودن با پاکستان که اکثر موارد فالسی پاورم وارده از پاکستان هستندو با عنایت به کاندید واکسن بودن این ژن و اینکه تا به امروز گزارش مقایسه ای از بررسی این ژن در موارد محلی و وارده فالسی پاروم در ایران وجود ندارد و لزوم مطالعات مولکولی در خصوص POLYMORPHISM، روی PFAMA1 قبل از طراحی واکسن ومطالعات تجربی،در این مطالعه قصد براین است که که بعد از بیماریابی و نمونه برداری از موارد وارده از خارج ازکشور و انتقال محلی با روش مولکولی NESTED PCR و با توجه به وجود PCR-Product، محاسبه توزیع توالی DNA تمام ژن و آلل های مربوطه قابل اجرا می باشد. و با مقایسه پلیمورفسیمPFAMA1در نمونه های وارده و محلی از نتایج آن در شناخت بیماری و نیز اپیدمیولوژی آن در برنامه حذف مالاریا (توجیه سازمان جهانی بهداشت )که پس از سالیان دراز تلاش و صرف هزینه های بالا در حال اجرا است استفاده کرد همچنین زمینه جهت طراحی واکسن کارامد و داروی موثر فراهم نمود. گرفت. فالسیپاروم |
| سوالات و / یا فرضیات پژوهش | -توزیع فراوانی پلی مورفیسم در ژن کد کنندهAMA1در بین ایزوله های جدا شده از افراد مبتلا به مالاریای فالسی پاروم وارده از پاکستان چگونه است؟ 2-توزیع فراوانی پلی مورفیسم در ژن کد کنندهAMA1در بین ایزوله های جدا شده از افراد مبتلا به مالاریای فالسی پاروم انتقال محلی چگونه است؟ 3- توزیع فراوانی پلی مورفیسم در ژن کد کنندهAMA1در بین ایزوله های جدا شده از افراد مبتلا به مالاریای فالسی پاروم وارده از پاکستان و انتقال محلی متفاوت است. |
| هدف کلی طرح | تعیین میزان شیوع پلی مورفیسم در آلل های 3D7 –K1-HB3 آنتی ژن غشا راسی(AMA1) در بیماران مبتلا به مالاریای فالسی پاروم وارده از خارج از کشور و انتقال محلی در جنوب شرقی ایران |
| اهداف اختصاصی | 1- تعیین توزیع فراوانی پلی مورفیسم درآلل های 3D7-K1-HB3 درAMA1در بین ایزوله های جدا شده از افراد مبتلا به مالاریای فالسی پاروم وارده از پاکستان 2- تعیین توزیع فراوانی پلی مورفیسم در آلل های 3D7-K1-HB3 درAMA1در بین ایزوله های جدا شده از افراد مبتلا به مالاریای فالسی پاروم انتقال محلی 3-مقایسه توزیع فراوانی پلی مورفیسم در آلل های 3D7-K1-HB3 درAMA1در بین ایزوله های جدا شده از افراد مبتلا به مالاریای فالسی پاروم وارده از پاکستان و انتقال محلی |
| سازمانها، مراکز و موسسات و سایر بهره برداران بالقوه دستاوردهای طرح | مراکز بهداشتی درمانی- مراکزو موسسات تحقیقات پزشکی –داروسازی- وزارت بهداشت (اداره مالاریای کشور) |
| تعریف واژه های تخصصی | انتقال محلی:انتقال بیماریتوسط گزش پشه آنوفل درمنطقه محل سکونت رخ داده است. انتقال واردهاز خارج از کشور:انتقال بیماری توسط گزش پشه آنوفل در خارج از کشور رخ داده است. Nested-PCR:تکنیکی دومرحله ای است که جفت پرایمر دوم در محدوده محصول آمپلی فیکاسیون مرحله اول قرار می گیرد.از این روش جهت تعیین گونه،سوش،کلون و مقاومت دارویی استفاده می شود. |
| نوع مطالعه | مقطعی توصیفی - تحلیلی |
| جامعه مورد مطالعه(معرفی مشارکت کنندگان)/ محیط پژوهش(معیارهای ورود و خروج ذکر شوند) | کلیه بیماران مبتلا به مالاریای فالسی پاروم در دوجمعیت وارده از خارج از کشور و انتقال محلی که دارای معیار های زیر باشند: معیار ورود: افرادی که آزمایش میکروسکوپی گسترش خون آنان یا کیت RDT از لحاظ پلاسمودیوم فالسیپاروم مثبت بوده و تحت درمان قرار نگرفته باشند، اخذ موافقت کتبی آگاهانه از افراد مورد مطالعه معیار خروج: بیمارانیکه که رضایت به همکاری ندارند، از مطالعه خارج می شوند. |
| حجم نمونه و روش محاسبه آن | از کلیه شهرستانهای تحت پوشش دانشگاه علوم پزشکی زاهدان از قبیل خاش ،سراوان ، ایرانشهر، کنارک ،نیکشهر ،سرباز ،چابهار و زاهدان نمونه مالایای فالسی پاوم و میکس وارده و محلی تهیه خواهد شد . با توجه به مقالات مشابه انجام شده در منطقه بر روی دیگر ژنها و اللها حجم نمونه معادل 50 محاسبه گردید که با توجه به اینکه در دوجمعیت انتقال محلی و انتقال وارده مطالعه صورت میگیرد حجم نمونه در هر جمعیت 50 نمونه و در کل 100 نمونه محاسبه گردید |
| روش نمونه گیری(نحوه تخصیص تصادفی و همسانسازی در صورت لزوم ذکر شود) | از آنجا که چارچوب نمونه گیری ما مشخص نیست، به روش نمونه گیری در دسترس نمونه ها را از منطقه جنوب شرقی ایران(چابهار،نیکشهر،سرباز،ایرانشهر) جمع آوری می نماییم؛ بدین صورت که دو روز در هفته به مرکز بهداشت شهرستانهای مذکور(چابهار،نیکشهر،سرباز،ایرانشهر) مراجعه و از بین بیمارانی که از نظر میکروسکوپی به پلاسمودیوم فالسیپاروم مبتلا بودند وRapid Test آنها مثبت تشخیص داده شد، نمونه گیری کرده و با حفظ زنجیره سرد، جهت انجام آزمایش به دانشکده بهداشت زاهدان منتقل می نماییم.نمونه گیری از تاریخ تصویب طرح تا تاریخ رسیدن به حجم نمونه ادامه خواهد یافت. |
| روش و ابزار جمع آوري داده ها / صحت و استحکام داده ها (پرسشنامه یا فرم اطلاعاتی ضمیمه شود) | فرم اطلاعات بیمار (شامل مشخصات و نوع انگل –نوع انتقال – ملیت) فرم بررسی انفرادی مالاریا ترمال سایکلر-سمپلر-ترانس داکت |
| روش اجرای طرح(با جزئیات بطور کامل شرح داده شود) | پیش از انجام نمونه گیری مواد و تجهیزات لازم تا مرحله استخراج DNA (به جز تهیه پرایمر ها ) از شرکت های معتبر آزمایشگاهی خریداری شده و در محل مرکز تحقیقات بیماری های گرمسیری شهرستان زاهدان نگهداری می گردد. فرم های پرسشنامه و فرم های اطلاعاتی مربوط به نمونه های اخذ شده توسط نمونه گیر(شخص دانشجو ) به طور کامل پر شده و به همراه نمونه در محفظه Cold Box قرار گرفته تا انتقال زنجیره سرد رعایت گردد. پس از انجام نمونه گیری از مناطق چهار گانه مالاریا خیز جنوب شرقی ایران شامل : چابهار،ایرانشهر،نیکشهر و سرباز، نمونه های خون تام به صورت تازه در ویال های EDTA به مرکز تحقیقات عفونی و بیماریهای گرمسیری زاهدان منتقل وجهت بررسی میکروسکوپی ، رنگ آمیزی گیمسا و جداسازی DNA نگهداری می گردند. DNA نمونه ها با استفاده از کیت استخراج DNA ، Qiagene به سرعت انجام می گیرد که پروتکل انجام روش استخراج دقیقا بر اساس کیت دنبال شده و متعاقبا در روش انجام طرح ذکر گردیده است : استخراج DNA آماده سازی نمونه: خون تام بایستی در لوله های آغشته به سیترات و یا EDTA جمع آوری گردد تا از ایجاد لخته جلوگیری و DNA تجزیه نگردد. DNA جدا شده از خون های حاوی هپارین را نمی توان جهت PCR مورد استفاده قرار داد. به طور عادی Lµ200 از خون تازه برای DNA به اندازه ی gµ2- 10 مورد استفاده قرار می گیرد. اگر مقدار بیشتری DNA مورد نیاز باشد ، Lµ500 از خون تام بایستی در یک میلی لیتر آب مقطر لیز گردد، لکوسیت ها از محیط خارج شوند (سانتریفوژ در 2 دقیقه با دور rpm5000 ) و Lµ 200 از بافر TE در داخل پلت قرار می گیرد . خون را به مدت 2 ماه می توان در دمای 2-4 درجه سانتی گراد نگهداری نمود . برای نگهداری های بیش از 2 ماه باید نمونه ها را به حجم های Lµ 200 تقسیم کرده و در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری کرد. پروتکل استخراج DNA با استفاده از کیت(برگردان کامل پروتکل استخراج DNAکیت به فارسی) 1. Lµ 200 از نمونه را با Lµ 400 از محلول لایز به خوبی مخلوط نمائید و به مدت 5 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی گراد انکوبه کنید. *اگر از نمونه های فریز شده استفاده می کنید، محلول لایز را بایستی قبل از باز شدن فریز به نمونه های اضافه نمائید. سپس نمونه ها را در دمای65 درجه سانتی راد به مدت 10 دقیقه انکوبه نموده و لوله را به طور متناوب به آرامی معکوس(INVERT) کنید. 2. بلافاصله Lµ 600 کلروفرم به پلت اضافه کرده و 3-5 بار معکوس کنید تا به حالت امولسیون در آید و به مدت 2 دقیقه با دور rpm10000 سانتریفوژ نمایید. 3. محلول رسوب دهنده را با مخلوط کردن Lµ 720 از آب دیونیزه ی استریل با Lµ 80 از محلول رسوب دهنده ی غلیظ x10 موجود در کیت تهیه نمایید . 4. فاز آبی فوقانی را که حاوی ماده DNA می باشد را به یک لوله جدید منتقل نموده و Lµ 800 از محلول رسوب دهنده ی تازه تهیه شده را به آن اضافه کنید و به آرامی مخلوط نموده ( با چند بار اینورت کردن) و دمای اتاق به مدت 1-2 دقیقه قرار می دهیم و سپس با دور rpm10000 به مدت 2 دقیقه سانتریفوژ می نماییم. 5. سوپرتانت (بخشی رویی تشکیل شده ) را به طور کامل خارج نموده و پلت حاوی DNA را با Lµ 100 از محلول NaCL مخلوط نموده و به آرامی ورتکس می کنیم. *مطمئن شوید که پلت به طور کامل حاوی مواد محلول شده است . 6. Lµ 300 از اتانول سرد را به پلت اضافه نموده و اجازه می دهیم رسوب DNA تشکیل شود (10 دقیقه در دمای 20- سانتی گراد) و سپس به مدت 3-4 دقیقه با دور rpm10000 سانتریفوژ می نمائیم. اتانول را خارج می کنیم ، پلت را یکبار با اتانول 70% سرد شستشو داده و DNA را با Lµ 100 از آب دیونیزه استریل به حالت محلول درآورده و به آرامی ورتکس می نماییم . نکته: *به علت مقادیر کم DNA در نمونه های سرمی رسوب دهی DNA را به مدت یک تا 2 ساعت در دمای 20- درجه سانتی گراد ادامه می دهیم و حجم آب اضافه شده را به Lµ 20 تقلیل می دهیم . *برای کاربرد PCR شستشوی DNA با اتانول 70% ضروری نیست. *اگر نیاز به DNA ژنومیک حاوی RNA آزاد باشد ،RNAaseA(#ENO531) با غلظت 2/. Mg/ml بعد از مرحله ی 5 به محصول نهایی اضافه شده ، ورتکس گردیده و به مدت 10 دقیقه در دمای 37درجه سانتی گراد انکوبه می گردد. 7. غلظت DNA را با استفاده از روشهای اسپکتروفتومتری و یا به صورت چشمی بعد از الکتروفورز بر روی ژل آگارز می سنجیم ، عدم حضور RNA و مقدار تخمینی طول DNA را چک می نماییم . اغلبg µ 2-10 DNA از Lµ 200 خون تازه دارای طول متوسط تقریبی 50kb می باشد. نکته : *در نمونه های خونی |
| روش تجزیه، تحليل و توصیف دادهها (نمونهاي از جدول توخالي ضميمه شود و روش هاي آماري مورد استفاده به طور كامل توضيح داده شود)(کیفی و کمی) | پلی مورفیسمAMA1 تعداد درصد IMPORTED-----DOMAIN1 INDEJOUS-------DOMAIN1 • با استناد به روشهای آمار توصیفی (جدول توزیع فراوانی،رسم نمودار) و روشهای آمار استنباطی(آزمون مقایسه نسبت با یک عدد ثابت) و استفاده از آزمون کای -اسکوئرداده ها تجزیه و تحلیل می شوند.) |
| ملاحظات اخلاقی | پس از اینکه بیماری افراد مقرض گردید در خصوص اهمیت موضوع طرح با انان صحبت خواهد شد در صورت رضایت آنان جهت همکاری رضایت نامه تکمیل خواهد شد سپس فرم اطلاعات بیمار تکمیل و نمونه گیری انجام خواهد شد ،هم چنین تعهد می شود نام و مشخصات بیماران در هیچ گزارشی قید نشود.(کدهای اخلاقی 1،2،17،20 لحاظ شده است). |
| محدودیتهای اجرائی طرح و پیش بینی جهت حل آنها | عدم همکاری بیمار ره حل : بیان اهمیت طرح -عدم همکاری پرسنل مراکز بهداشتی درمانی جهت تهیه نمونه راه حل : هماهنگی با معاونت محترم بهداشتی در این خصوص و توجیه نمودن پرسنل درگیر از اهمیت موضوع -ست کردن PCR راه حل :درخواست همکاری از اساتید 10- پیش بینی زمان لازم برای اجرای کامل طرح به ماه: 8 ماه |
| کلمات کلیدی | پلی مورفیسم polymorphism آنتی ژن غشا راسی-1 apical membrane antigen-1 انتقال وارده و محلی imported and indejous cases |
| فهرست منابع و مراجع | 1- (http://whqlibdoc.who.int/publications/2010/9789241564106_eng.pdf). 2-Snow, R.W., Guerra, C.A., Noor, A.M., Myint, H.Y., Hay, S.I., 2005. The global distribution of clinical episodes of Plasmodium falciparum malaria. Nature 434, 214–217. 3- Miller, H. L., M. F. Good, and G. Milon. 1994. Malaria pathogenesis ,Science 264:1878–1883. 4-White, N. J., and M. Ho. 1992. The pathophysiology of malaria. Adv. Parasitol. 31:83–173. 5-ادریسیان غ ح. انگل های مالاریا. ادریسیان غ، رضائیان م، قربانی م و همکاران. تک یاخته شناسی پزشکی. اول. تهران: دانشگاه علوم پزشکی تهران؛ 1386: ص228-180. 6-Branch OH, Sutton P, Barnes C, et al. Plasmodium falciparum Genetic Diversity Maintained and Amplified Over 5 Years of a Low Transmission Endemic in the Peruvian Amazon. Mol Biol Evol(MBE) 2011; 28(7): 1973-1986. 7-Kang JM, Moon SU, Kim JY, et al. Genetic polymorphism of merozoite surface protein-1 and merozoite surface protein-2 in Plasmodium falciparum field isolates from Myanmar. Malaria Journal 2010; 9(131). 8-Heidari A, Keshavarz H, Rokni MB, Jelinek T. Genetic diversity in merozoite surface protein (MSP)-1 and MSP-2 genes of Plasmodium falciparum in a major endemic region of Iran. Korean Journal of Parasitology 2007; 45(1): 59-63. 9-Kiwanuka GN. Genetic diversity in Plasmodium falciparum merozoite surface protein 1 and 2 coding genes and its implications in malaria epidemiology: a review of published studies from 1997-2007. J Vector Born Dis 2009; 46: 1-12. 10-Zamani Z, Razavi MR, Sadeghi S, et al. Sequence diversity of the C-terminal region of Plasmodium falciparum merozoite surface protein 1 in Southern Iran. Southeast Asian J Trop Med Public Health(SAJTMPH) 2009; 40(1). 11-Mills KE, Pearce JA, Crabb BS, Cowman AF. Truncation of merozoite surface protein 3 disrupts its trafficking and that of acidic-basic repeat protein to the surface of Plasmodium falciparum merozoites. Mol Microbiol 2002;43:1401–1411. [PubMed: 11952894] 12- Polley, S.D., Chokejindachai, W., Conway, D.J., 2003. Allele frequency-based analyses robustly map sequence site under balancing selection in a malaria vaccine candidate antigen. Genetics 165, 555–561 Polley, S.D., Conway, D.J., 2001. Strong diversifying selection on domains of the Plasmodium falciparum apical membrane antigen 1 gene. Genetics 158, 1505–1512. 13- Saul, A., Lawrence, G., Allworth, A., Elliott, S., Anderson, K., Rzepczyk, C., Martin, L.B., Taylor, D., Eisen, D.P., Irving, D.O., Pye, D., Crewther, P.E., Hodder, A.N., Murphy, V.J., Anders, R.F., 2005. A human phase 1 vaccine clinical trial of the Plasmodium falciparum malaria vaccine candidate apical membrane antigen 1 in Montanide ISA720 adjuvant. Vaccine 23, 3076–3083 Sagara, I., Dicko, A., Ellis, R.D., Fay, M.P., Diawara, S.I., Assadou, M.H., Sissoko, M.S., Kone, M., Diallo, A.I., Saye, R., Guindo, M.A., Kante, O., Niambele, M.B., Miura, K., Mullen, G.E., Pierce, M., Martin, L.B., Dolo, A., Diallo, D.A., Doumbo, O.K., Miller, L.H., Saul, A., 2009. A randomized controlled phase 2 trial of the blood stage AMA1-C1/alhydrogel malaria vaccine in children in Mali. Vaccine 27, 3090– 3098. 14- Dutta, S., Haynes, J.D., Moch, J.K., Barbosa, A., Lanar, D.E., 2003. Invasion-inhibitory antibodies inhibit proteolytic processing of apical membrane antigen 1 of Plasmodium falciparum merozoites. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 100, 12295– 12300. Kocken, C.H., Narum, D.L., Massougbodji, A., Ayivi, B., Dubbeld, M.A., van der Wel, A., Conway, D.J., Sanni, A., Thomas, A.W., 2000. Molecular characterization of Plasmodium reichenowi apical membrane antigen-1 (AMA-1), comparison with P. falciparum AMA-1, and antibody-mediated inhibition of red cell invasion. Mol. Biochem. Parasitol. 109, 147–156. 15- Issiaka Soulama , Jude D. Bigoga , Magatte Ndiaye , Edith C. Bougouma , Josephine Quagraine ,Prisca N. Casimiro , Timothy T. Stedman , and Sodiomon B. Sirima. Genetic Diversity of Polymorphic Vaccine Candidate Antigens (Apical |
| نام فایل | تاریخ درج فایل | اندازه فایل | دانلود |
|---|---|---|---|
| امضای استاد مشاور.PNG | 1391/03/16 | 79853 | دانلود |
| پرسشنامه.docx | 1391/03/16 | 18898 | دانلود |
| رفرنس پایان نامه.pdf | 1391/07/02 | 349694 | دانلود |
| رفرنس پایان نامه 1.pdf | 1391/07/02 | 118366 | دانلود |
| رفرنس.pdf | 1391/07/04 | 960366 | دانلود |
| d.PNG | 1391/07/06 | 283364 | دانلود |
| رضایت نامه اگاهانه.doc | 1391/07/06 | 89088 | دانلود |
| معاونت محترم تحقیقات و فناوری دانشکده پزشکی.docx | 1391/07/19 | 11203 | دانلود |
| 91.7.5.doc | 1391/07/24 | 81408 | دانلود |
| نهایی ارسال شده به دانشگاه.doc | 1391/07/24 | 324096 | دانلود |
