چاپ صفحه |  صفحه نخست سامانه |  مجری و همکاران |  اطلاعات تفضیلی |  دانلود | علوم پزشکی زاهدان |
| کد طرح | 6254 |
| عنوان فارسی طرح | بررسی ژنوتیپ آلل های K1 و 3D7 ناحیه N-terminal پروتئین سطحی مروزوئیت- 6 انگل پلاسمودیوم فالسیپاروم مالاریا (PfMSP-6) به روش Nested-PCR در منطقه جنوب شرقی ایران |
| عنوان لاتین طرح | Genotyping of K1 and 3D7 alleles in N-terminal Region of Merozoit Surface Protein (MSP-6) of Plasmodium falciparum- malaria using Nested-PCR in South-East of Iran |
| نوع طرح | |
| محل اجرای طرح | زاهدان |
| رسته مطالعاتی | توصیفی- تحلیلی |
| دانشکده/مرکز | دانشگاه علوم پزشکی |
| زمان اجرا -روز |
| نام و نامخانوادگی | سمت در طرح | نوع همکاری | درجهتحصیلی | پست الکترونیک |
|---|---|---|---|---|
| طارق بامدی | t.bamedi@gmail.com | |||
| عادل ابراهیم زاده | استاد راهنمای اول پایان نامه دانشجویی | همکاری در اجرای طرح | دکترا(p.h.d) | |
| مهناز شهرکی | مشاور | مشاور آمار |
| عنوان | متن |
|---|---|
| خلاصه طرح به فارسی | بررسی ژنوتیپ آلل های K1 و 3D7 ناحیه N-terminal پروتئین سطحی مروزوئیت- 6 انگل پلاسمودیوم فالسیپاروم مالاریا (PfMSP-6) به روش Nested-PCR در منطقه جنوب شرقی ایران |
| خلاصه طرح به لاتین | Genotyping of K1 and 3D7 alleles in N-terminal Region of Merozoit Surface Protein (MSP-6) of Plasmodium falciparum- malaria using Nested-PCR in South-East of Iran |
| بيان مسئله تحقيق/اهمیت پژوهش | مالاریا ، یکی از عمده ترین بیماری های انگلی شایع در مناطق گرمسیری دنیا است.با بیش از 300 تا 500 میلیون مورد جدید در هر سال،مالاریا مسئول مرگ بین 1-3 میلیون نفر در سرتاسر جهان می باشد که بیش از 90% این موارد مربوط به کودکان است(1و2). این بیماری منتقله از حشره توسط چهار گونه از انگل های مالاریا به نام پلاسمودیوم فالسیپاروم، پلاسمودیوم ویواکس، پلاسمودیوم مالاریه و پلاسمودیوم اووال ایجاد می شود، که از بین چهار گونه ای که در انسان ایجاد عفونت می کنند،خطرناک ترین گونه پلاسمودیوم فالسیپاروم می باشد که عامل اصلی مرگ و میر است. پلاسمودیوم فالسیپاروم مسئول مرگ و میر بیش از 0.9 میلیون نفر در هر سال است ، که 89 درصد این موارد در کودکان زیر 5 سال و زنان بارداری اتفاق می افتد که در مناطق اندمیک مالاریا زندگی می کنند.(3و4) حدود 10 تا 30 درصد از کودکانی که به مالاریای سخت فالسیپاروم مبتلا می گردند، تلف می شوند و عده ای هم اختلالات عصبی دائمی پیدا می کنند.(5)
تلفات و زیان های اجتماعی – اقتصادی ناشی از مالاریا در مناطق مالاریا خیز سبب عدم توسعه، فقر و عقب ماندگی در تعدادی از کشورها شده است. در بعضی از کشورها که بر اثر عملیات مبارزه با مالاریا انتقال این بیماری قطع شده و یا کاهش یافته بود، مالاریا دوباره ظاهر شده و بیماری در حال گسترش به مناطق جغرافیایی جدید است. (5و6) علی رغم تلاشهای گسترده برای کنترل و پیشگیری مالاریا،عوامل متعددی شامل مقاومت پشه های ناقل به حشره کش ها ، عدم تولید واکسن های کار آمد وگسترش سریع سویه های مقاوم به درمان ، وضعیت مالاریا در جهان را وخیم نموده است.(7) تنوع ژنتیکی موجود در ایزوله های پلاسمودیوم فالسیپاروم (وجود انواع مختلف انگل در نواحی جغرافیایی متفاوت)و وجود ژنوتیپ های متعدد در یک نوع پشه خاص ازمهم ترین مشکلات پیش رو در زمینه طراحی واکسن مالاریا می باشند،( چنین پلی مورفیسم گسترده آنتی ژنی ، توانایی انگل ها را برای مخفی شدن از سیستم ایمنی بدن افزایش می دهد و سیستم ایمنی بدن توانایی ایجاد پاسخ مناسب در مقابل این دامنه گسترده از آنتی ژنهای متنوع در حال گردش از جمعیت انگل ها را ندارد.(8و9) مقاومت به پلاسمودیوم به دلیل وجود آنتی بادی های محافظت کننده ی طبیعی در ساکنین مناطق هایپراندمیک نشان دهنده ی وجود آنتی ژن های ایمونوژنیک در مرحله ی خونی پلاسمودیوم فالسیپاروم است.(10) به عنوان مهم ترین عامل ارتباط بین میزبان و عامل بیماریزا سطح مروزوئیت را می توان به عنوان یک هدف مشخص برای تولید واکسن مالاریا در نظر گرفت. تعداد زیادی از آنتی ژن های بالقوه داوطلب برای تولید واکسن که تاکنون مورد شناسایی قرار گرفته اندیا بر روی سطح مروزوئیت ها و یا ارگانلهای اپیکال قرار دارند و یا در ارتباط با آنها هستند.(11) از بین چند آنتی ژنی که در مراحل مختلف زندگی پلاسمودیوم فالسیپاروم مورد بررسی قرار گرفته است ،6 MSP- (Merozoite Surface Protein-6) به دلیل القاء تولید آنتی بادی توسط سیستم ایمنی یکی اهداف بالقوه جهت تولید واکسن در مراحل اولیه تکامل پلاسمودیوم فالسیپاروم می باشد. پروتئین سطحی مروزوئیت- 6 پلاسمودیوم فالسیپاروم(PfMSP -6) نوعی آنتی ژن پنهان می باشد که پس از آنکه توسط PfSUB1 پروتئولیز می شود تولید قطعه ای 36 کیلو دالتونی می کند که همراه با پروتئین سطحی مروزوئیت- 1 پلاسمودیوم فالسیپاروم(PfMSP-1) و پروتئین سطحی مروزوئیت- 7 پلاسمودیوم فالسیپاروم(PfMSP-7) نوعی کمپلکس چند واحدی را در سطح مروزوئیت ایجاد می کند. این کمپلکس سطح مروزوئیت را احاطه کرده و نوعی پوشش را در اطراف انگل شکل می دهد. این موقعیت پروتئین سطحی مروزوئیت- 6 پلاسمودیوم فالسیپاروم(PfMSP-6) بر سطح مروزوئیت باعث شده است که افرادی که به انگل آلوده می شوند بر علیه این پروتئین آنتی بادی تولید کنند. وجود موقعیت خاص پروتئین سطحی مروزوئیت -6 پلاسمودیوم فالسیپاروم(PfMSP-6) بر سطح مروزوئیت و همچنین القاء تولید آنتی بادی توسط میزبان باعث شده که پروتئین سطحی مروزوئیت- 6 پلاسمودیوم فالسیپاروم(PfMSP-6) به عنوان یک کاندید مناسب جهت تولید واکسن مورد توجه قرار گیرد(12-13). پروتئین سطحی مروزوئیت- 6 پلاسمودیوم فالسیپاروم (PfMSP-6) به وسیله ژنی بر روی کروموزوم 10 کد می شود. پروتئین سطحی مروزوئیت -3 پلاسمودیوم فالسیپاروم(PfMSP-3) ارتباط بسیار نزدیکی با پروتئین سطحی مروزوئیت -6 پلاسمودیوم فالسیپاروم(PfMSP-6) داشته و اکنون در فاز نخست vaccine trialsمی باشد(15-13). هر چند نقش وعملکرد دقیق پروتئین سطحی مروزوئیت -6 پلاسمودیوم فالسیپاروم(PfMSP-6) مشخص نشده است اما به نظر می رسد این پروتئین در شناسایی گلبول قرمز و اتصال انگل به آن نقش دارد. از نظر تئوری پروتئین سطحی مروزوئیت- 6 پلاسمودیوم فالسیپاروم(PfMSP-6) نوعی هدف بالقوه برای تولید واکسن می باشد چرا که افراد آلوده به پلاسمودیوم فالسیپاروم دارای آنتی بادی ضد پروتئین سطحی مروزوئیت -6 پلاسمودیوم فالسیپاروم(PfMSP-6) در سرم خود می باشند و از طرفی مشخص شده است که این آنتی بادی در محیط آزمایشگاه (in vitro) مانع از رشد پلاسمودیوم فالسیپاروم می گردد(15). مطالعاتی که اخیرا بر روی PfMSP1 و PfAMA1 صورت گرفته حاکی از آن است که تنوع ژنی یکی از موانع بالقوه و اصلی در تولید واکسن برای مرحله خونی پلاسمودیوم فالسیپاروم می باشد. دو آلل اصلی پروتئین سطحی مروزوئیت -6 پلاسمودیوم فالسیپاروم(PfMSP-6) ، K1 و 3D7 می باشند که به علت کشف نخستین گونه های پلاسمودیوم فالسیپاروم نامگذاری شده اند. اغلب تفاوت بین آلل های مختلف پروتئین سطحی مروزوئیت- 6 پلاسمودیوم فالسیپاروم(PfMSP-6) محدود به ناحیه انتهای N (N-terminal) می شود. با این وجود جهش های نقطه ای (SNP) در کل طول ژن، از دیگر عوامل اختلاف بین دو آلل مختلف می باشند(15-13). کشور ایران در منطقه مدیترانه شرقی واقع شده است (16). 16 درصد از جمعیت این کشور در معرض خطر ابتلا به مالاریا قرار دارند.90 درصد موارد ابتلا از سه استان سیستان و بلوچستان، هرمزگان و کرمان منشا می گیرد، که در این میان60 درصد موارد مربوط به سیستان و بلوچستان می باشد (17و18). بیشترین میزان بروز پلاسمودیوم فالسیپاروم در برخی از شهرهای مرزی سیستان و بلوچستان(چابهار، نیکشهر، سرباز، ایرانشهر) ،گزارش شده است (16). Subhash Singh وهمکارانش در مطالع ای که بر روی پروتئین سطحی مروزوئیت -6 پلاسمودیوم فالسیپاروم(PfMSP-6) انجام دادند مشخص ساختند که این آنتی ژن سطحی پلاسمودیوم فالسیپاروم در ناحیه C-terminus دارای اپی توپ هایی می باشد که با آنتی بادی های ضد پروتئین سطحی مروزوئیت- 3 پلاسمودیوم فالسیپاروم(PfMSP-3) دارای واکنش متقاطع می باشند. همچنین آنها پی بردند که این آنتی ژن دارای برخی اپی توپها می باشد که آنتی بادی ضد آنها مانع از اتصال پلاسمودیوم فالسیپاروم به گلبول های قرمز می شوند. این آنتی بادی ها نقش حفاظتی داشته و تولید آنها در افراد مبتلا مانع آلودگی مجدد این افراد به پلاسمودیوم فالسیپاروم می گشت(14). همچنین در مطالعه دیگری که توسط J. Andrew Pearce و همکارانش از دانشگاه استرالیا انجام دادند مشخص گشت که پروتئین سطحی مروزوئیت -6 پلاسمودیوم فالسیپاروم (PfMSP-6) نوعی پروتئین سطحی پلاسمودیوم فالسیپاروم می باشد که موجب تحریک سیستم ایمنی می گردد و باعث می شود آنتی بادی ضد تعدادی از اپی توپ های پروتئین سطحی مروزوئیت- 6 پلاسمودیوم فالسیپاروم (PfMSP-6) در افرادی می گردد که به صورت مکرر با انگل پلاسمودیوم فالسیپاروم و مواجه شده بودند(13). طی مطالعه کوهورت وسیعی که طی سال های 2003 تا 2006 توسط Aaron T Neal و همکارانش در منطقه آمازون انجام گرفت. از روستاهای مختلف این منطقه نمونه برداری شده و سپس فراوانی آلل های K1 و 3D7 را در پروتئین سطحی مروزوئیت- 6 پلاسمودیوم فالسیپاروم (PfMSP-6) مورد بررسی قرار داده و سپس با سکانس کردن و مقایسه سکانس این مناطق باسکانس آلل های K1 و 3D7 پی به میزان متغییر بودن ناحیه C-terminal سطحی مروزوئیت- 6 پلاسمودیوم فالسیپاروم (PfMSP-6) پرداختند. آنان در نهایت به این نتیجه رسیدند که سطحی مروزوئیت- 6 پلاسمودیوم فالسیپاروم (PfMSP-6) دارای ثبات بالایی بوده و دارای تغییر کمی بوده و بنابراین کاندید بسیار مناسب جهت تولید واکسن مرحله خونی بر علیه پلاسمودیوم فالسیپاروم می باشد. در این مطالعه آنان همچنین به این نتیجه رسیدند که دو آلل K1 و 3D7 دارای پراکندگی جهانی بوده و لی در بین روستاهای مختلف ناحیه آمازون دارای فراوانی متفاوتی می باشند(12). طی مطالعه in vitro ای که توسط Christian W. Kauth و همکاران بر روی MSP-1-MSP-6 و MSP-7 انجام دادند به این نتیجه رسیدند که آنتی بادی ضد هر یک از این آنتی ژنها می تواند مانع از تکثیر پلاسمودیوم فالسیپاروم گردد. آنان پس از انجام cloning و سپس بررسی بیان ژن به این نتیجه رسیدند که آنتی بادی هایی که در بدن افراد برعلیه هر یک ا ز آنتی ژنهای سطحی MSP-1-MSP-6 و MSP-7 تشکیل می شود می تواند عاملی بالقوه برای ممانعت از رشد وتکثیر انگل پلاسمودیوم فالسیپاروم باشد (15). با توجه به جستجوهای انجام گرفته در منابع مختلف انگلیسی و فارسی مطلب یا مقاله یا پایان نامه تحقیقاتی مشابه دال بر اجرای چنین طرحی در کشور ایران مشاهده نگردید و احتمالا به نظر می رسد این طرح برای اولین بار در این ناحیه (جنوب شرق ایران) در حال انجام شدن می باشد، لذا در بررسی متون قادر به ذکر کار های مشابه انجام شده روی ژل آگارز می سنجیم ، عدم حضور RNA و مقدار تخمینی طول DNA را چک می نماییم . اغلبg µ 2-10 DNA از Lµ 200 خون تازه دارای طول متوسط تقریبی 50kb می باشد. نکته : *در نمونه های خونی میزان DNA بسته به میزان سلول های لکوسیتی متفاوت است. *DNA های ویروسی بدست آمده از از نمو نه های سرمی در ژل اگارز قابل مشاهده نمی باشد . * Lµ 1-5 از محلول DNA برای Lµ 50 PCR کفایت می کند. پس از استخراج DNA ، پرایمر های اختصاصی ژن MSP-6 جهت انجام Nested-PCR سفارش داده می شود که این پرایمر ها ذیلا ذکر گردیده اند. External Primers for Nested-PCR of MSP-6 Gene: msp-6 (F) 5'--CGTGAATACTATTTTCGTTACTT--3' msp-6 (R) 5'--CAGCAGTCTTTTTTGTTTCAT--3' Internal Primers for Nested-PCR of MSP-6 Gene: msp-6 (F) 5'--CCCCATCAATCTTATGTCCAG--3' msp-6 (R) 5'--CACTTTCTTCATCTATGTCATCTTCTT--3' جهت انجام Nested-PCRاز DNA استخراج شده(1.5 میکرولیتر) و Premix-PCR استفاده می گردد. بدین صورت که ابتدا از DNA استخراج شده پلاسمودیوم فالسیپاروم بیماران در 35 سیکل در دمای 95 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه ،50 در جه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه و 65 درجه سانتی گراد به مدت 1 دقیقه به همراه یک مرحله نهایی در 65 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه با استفاده از پرایمر های External ،PCR اولیه انجام می گیرد. واکنش Nested –PCR تحت شرایط ذکر شده قبلی صورت خواهد گرفت با این تفاوت که به جای DNA-template بیماران مبتلا به پلاسمودیوم فالسیپاروم از محصول واکنش PCR (1 میکرولیتر) اولیه استفاده می گردد. طبقه بندی آلل های MSP-6 به وسیله تفاوت در اندازه (size variation) ایجاد شده به وسیله الکتروفورز بر روی ژل آگارز 2 درصد و رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید و مقایسه با lader marker 50bp تعیین خواهد گردید. پس از انجام الکتروفورز و انجام رنگ امیزی، ژل آگارز به transduct منتقل شده و عکس برداری و آنالیز PCR بر روی آن انجام می گیرد . اطلاعات بدست آمده از مقایسه آلل های بررسی شده ژن MSP-6 در جمعیت با سوش استاندارد پلاسمودیوم فالسیپاروم حاوی این آللها به وسیله نرم افزار های انالیز اماری (( SPSS18 انجام می دهیم . پس از انجام انالیز ها اطلاعات مذبور جهت نشرگزارش نهایی پایان نامه قرار خواهند گرفت. در این منطقه بر روی زن MSP-6 نبوده ایم. با توجه به اهمیت پلاسمودیوم فالسیپاروم در ناحیه جنوب شرقی ایران و کاندید واکسن بودن ژن MSP-6، در این مطالعه قصد بر این است که پس از نمونه برداری در این منطقه اندمیک، با بررسی ناحیه N-terminal ژن MSP-6، ژنوتیپ های بین آللی و بین ژنی را به وسیله ی روش های مولکولی NESTED-PCR مشخص نماییم. با توجه به وجود PCR-Product، محاسبه توزیع فراوانی آلل های مورد بررسی قابل اجرا می باشد. نتایج حاصل از این مطالعه در طراحی واکسن مالاریا، درمان بیماری و استراتژی کنترل و حذف پلاسمودیوم فالسیپاروم کمک شایانی خواهد کرد. |
| سوالات و / یا فرضیات پژوهش | -توزیع فراوانی پلی مورفیسم در ژن کد کنندهMSP-6 در بین ایزوله های جدا شده از افراد مبتلا به مالاریا چگونه است؟
2-توزیع فراوانی جمعیت های ژنتیکی ایزوله های جدا شده از افراد مبتلا به مالاریای فالسیپاروم به روش Nested- PCR چگونه است؟ |
| هدف کلی طرح | تعیین ژنوتیپ آلل های K1 و D73ناحیهN-terminal پروتئین سطحی مروزوئیت- 6 انگل پلاسمودیوم فالسیپاروم مالاریا (PfMSP-6) به روش Nested-PCR در منطقه جنوب شرقی ایران (چابهار، نیکشهر ، سرباز، ایرانشهر) |
| اهداف اختصاصی | -تعیین توزیع فراوانی پلی مورفیسم در ژن کد کننده آنتی ژن MSP-6 در بین ایزوله های جدا شده از افراد مبتلا به مالاریا
2-تعیین توزیع فراوانی جمعیت های ژنتیکی ایزوله های جدا شده از افراد مبتلا به مالاریای فالسیپاروم به روش |
| سازمانها، مراکز و موسسات و سایر بهره برداران بالقوه دستاوردهای طرح | سازمان علوم پزشکی کشور |
| تعریف واژه های تخصصی | پلاسمودیوم فالسیپاروم
تعیین ژنوتیپ پروتئین سطحی مروزوئیت-6 |
| نوع مطالعه | توصیفی-مقطعی |
| جامعه مورد مطالعه(معرفی مشارکت کنندگان)/ محیط پژوهش(معیارهای ورود و خروج ذکر شوند) | کلیه افراد مبتلا به مالاریای فالسیپاروم در ناحیه جنوب شرق ایران(چابهار،نیکشهر،سرباز،ایرانشهر) در سال 1392 که دارای معیارهای زیر باشند:
معیار ورود: افرادی که آزمایش میکروسکوپی گسترش خون آنان از لحاظ پلاسمودیوم فالسیپاروم مثبت بوده و طی ماه گذشته تحت درمان قرار نگرفته باشندو مثبت بودن لام آنها به کمک نوار های Rapid Sterip test مرکز بهداشت تایید شده باشند. معیار خروج: افرادی که رضایت به همکاری ندارند، از مطالعه خارج می شوند |
| حجم نمونه و روش محاسبه آن | با توجه به مطالعات مشابه انجام شده(12) حجم نمونه معادل 68 محاسبه گردید. |
| روش نمونه گیری(نحوه تخصیص تصادفی و همسانسازی در صورت لزوم ذکر شود) | از آنجا که چارچوب نمونه گیری ما مشخص نیست، به روش نمونه گیری در دسترس نمونه ها را از منطقه جنوب شرقی ایران (چابهار، نیکشهر، سرباز، ایرانشهر) جمع آوری می نماییم؛ بدین صورت که دو روز در هفته به مرکز بهداشت شهرستانهای مذکور (چابهار، نیکشهر، سرباز، ایرانشهر) مراجعه و از بین بیمارانی که از نظر میکروسکوپی به پلاسمودیوم فالسیپاروم مبتلا بودند وRapid Test آنها مثبت تشخیص داده شد، نمونه گیری کرده و با حفظ زنجیره سرد، جهت انجام آزمایش به دانشکده بهداشت زاهدان منتقل می نماییم.نمونه گیری از تاریخ تصویب طرح تا تاریخ رسیدن به حجم نمونه ادامه خواهد یافت. |
| روش و ابزار جمع آوري داده ها / صحت و استحکام داده ها (پرسشنامه یا فرم اطلاعاتی ضمیمه شود) | 1- فرم اطلاعاتی ساده
2- میکروسکوپ نوری جهت تشخیص لامهای مثبت پلاسمودیوم فالسیپاروم 3- نوارهای تشخیص سریع پلاسمودیوم فالسیپاروم مرکز بهداشت 4- روشهای مولکولی Nested-PCR |
| روش اجرای طرح(با جزئیات بطور کامل شرح داده شود) | پیش از انجام نمونه گیری مواد و تجهیزات لازم تا مرحله استخراج DNA (به جز تهیه پرایمر ها ) از شرکت های معتبر آزمایشگاهی خریداری شده و در محل مرکز تحقیقات بیماری های گرمسیری شهرستان زاهدان نگهداری می گردد. فرم های پرسشنامه و فرم های اطلاعاتی مربوط به نمونه های اخذ شده توسط نمونه گیر(شخص دانشجو ) به طور کامل پر شده و به همراه نمونه در محفظه Cold Box قرار گرفته تا انتقال زنجیره سرد رعایت گردد. پس از انجام نمونه گیری از مناطق چهار گانه مالاریا خیز جنوب شرقی ایران شامل : چابهار،ایرانشهر،نیکشهر و سرباز، نمونه های خون تام به صورت تازه در ویال های EDTA به مرکز تحقیقات عفونی و بیماریهای گرمسیری زاهدان منتقل وجهت بررسی میکروسکوپی ، رنگ آمیزی گیمسا و جداسازی DNA جدا سازی DNA نگهداری می گردند. DNA نمونه ها با استفاده از کیت استخراج DNA ، Qiagene به سرعت انجام می گیرد که پروتکل انجام روش استخراج دقیقا بر اساس کیت دنبال شده و متعاقبا در روش انجام طرح ذکر گردیده است :
استخراج DNA آماده سازی نمونه: خون تام بایستی در لوله های آغشته به سیترات و یا EDTA جمع آوری گردد تا از ایجاد لخته جلوگیری و DNA تجزیه نگردد. DNA جدا شده از خون های حاوی هپارین را نمی توان جهت PCR مورد استفاده قرار داد. به طور عادی Lµ200 از خون تازه برای DNA به اندازه ی gµ2- 10 مورد استفاده قرار می گیرد. اگر مقدار بیشتری DNA مورد نیاز باشد ، Lµ500 از خون تام بایستی در یک میلی لیتر آب مقطر لیز گردد، لکوسیت ها از محیط خارج شوند (سانتریفوژ در 2 دقیقه با دور rpm5000 ) و Lµ 200 از بافر TE در داخل پلت قرار می گیرد . خون را به مدت 2 ماه می توان در دمای 2-4 درجه سانتی گراد نگهداری نمود . برای نگهداری های بیش از 2 ماه باید نمونه ها را به حجم های Lµ 200 تقسیم کرده و در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری کرد. پروتکل استخراج DNA با استفاده از کیت(برگردان کامل پروتکل استخراج DNAکیت به فارسی) 1. Lµ 200 از نمونه را با Lµ 400 از محلول لایز به خوبی مخلوط نمائید و به مدت 5 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی گراد انکوبه کنید. *اگر از نمونه های فریز شده استفاده می کنید، محلول لایز را بایستی قبل از باز شدن فریز به نمونه های اضافه نمائید. سپس نمونه ها را در دمای65 درجه سانتی راد به مدت 10 دقیقه انکوبه نموده و لوله را به طور متناوب به آرامی معکوس(INVERT) کنید. 2. بلافاصله Lµ 600 کلروفرم به پلت اضافه کرده و 3-5 بار معکوس کنید تا به حالت امولسیون در آید و به مدت 2 دقیقه با دور rpm10000 سانتریفوژ نمایید. 3. محلول رسوب دهنده را با مخلوط کردن Lµ 720 از آب دیونیزه ی استریل با Lµ 80 از محلول رسوب دهنده ی غلیظ x10 موجود در کیت تهیه نمایید . 4. فاز آبی فوقانی را که حاوی ماده DNA می باشد را به یک لوله جدید منتقل نموده و Lµ 800 از محلول رسوب دهنده ی تازه تهیه شده را به آن اضافه کنید و به آرامی مخلوط نموده ( با چند بار اینورت کردن) و دمای اتاق به مدت 1-2 دقیقه قرار می دهیم و سپس با دور rpm10000 به مدت 2 دقیقه سانتریفوژ می نماییم. 5. سوپرتانت (بخشی رویی تشکیل شده ) را به طور کامل خارج نموده و پلت حاوی DNA را با Lµ 100 از محلول NaCL مخلوط نموده و به آرامی ورتکس می کنیم. *مطمئن شوید که پلت به طور کامل حاوی مواد محلول شده است . 6. Lµ 300 از اتانول سرد را به پلت اضافه نموده و اجازه می دهیم رسوب DNA تشکیل شود (10 دقیقه در دمای 20- سانتی گراد) و سپس به مدت 3-4 دقیقه با دور rpm10000 سانتریفوژ می نمائیم. اتانول را خارج می کنیم ، پلت را یکبار با اتانول 70% سرد شستشو داده و DNA را با Lµ 100 از آب دیونیزه استریل به حالت محلول درآورده و به آرامی ورتکس می نماییم . نکته: *به علت مقادیر کم DNA در نمونه های سرمی رسوب دهی DNA را به مدت یک تا 2 ساعت در دمای 20- درجه سانتی گراد ادامه می دهیم و حجم آب اضافه شده را به Lµ 20 تقلیل می دهیم . *برای کاربرد PCR شستشوی DNA با اتانول 70% ضروری نیست. *اگر نیاز به DNA ژنومیک حاوی RNA آزاد باشد ،RNAaseA(#ENO531) با غلظت 2/. Mg/ml بعد از مرحله ی 5 به محصول نهایی اضافه شده ، ورتکس گردیده و به مدت 10 دقیقه در دمای 37درجه سانتی گراد انکوبه می گردد. 7. غلظت DNA را با استفاده از روشهای اسپکتروفتومتری و یا به صورت چشمی بعد از الکتروفورز بر |
| روش تجزیه، تحليل و توصیف دادهها (نمونهاي از جدول توخالي ضميمه شود و روش هاي آماري مورد استفاده به طور كامل توضيح داده شود)(کیفی و کمی) | با استناد به روشهای آمار توصیفی (جدول توزیع فراوانی،رسم نمودار)و روشهای آمار استنباطی(آزمون مقایسه نسبت با یک عدد ثابت) تجزیه و تحلیل می شوند |
| ملاحظات اخلاقی | نمونه گیری و مصاحبه با رضایت کامل افراد مبتلا به مالاریا انجام خواهد شد،هم چنین تعهد می شود نام و مشخصات بیماران در هیچ گزارشی قید نشود.(کدهای اخلاقی 1،2،17،20 لحاظ شده است) |
| محدودیتهای اجرائی طرح و پیش بینی جهت حل آنها | - مشکل تهیه مواد وامکان طولانی شدن زمان دریافت آنها
راه حل: تصویب سریع تر طرح و دریافت بودجه آن - عدم نمونه گیری مناسب راه حل: آموزش به فرد نمونه گیر - عدم همکاری بیمار راه حل: توضیح دادن در مورد منافع این طرح و این که هیچ ضرری متوجه آنان نخواهد شد و اطلاعات آنها به طور محرمانه باقی خواهد ماند و نامشان فاش نخواهد شد. |
| کلمات کلیدی | پلاسمودیوم فالسیپاروم
تعیین ژنوتیپ پروتئین سطحی مروزوئیت-6 |
| فهرست منابع و مراجع | 1. Breman JG. The ears of the hippopotamus: manifestations, determinants, and estimates of the malaria burden. Am J Trop Med Hyg 2001;64:1–11. [PubMed: 11425172]
2. Marsh K. Malaria—a neglected disease? Parasitology 1992;104(Suppl):S53–S69. [PubMed: 1589300] 3. Miller, H. L., M. F. Good, and G. Milon. 1994. Malaria pathogenesis ,Science 264:1878–1883. 4. White, N. J., and M. Ho. 1992. The pathophysiology of malaria. Adv. Parasitol. 31:83–173. 5. ادریسیان غ ح. انگل های مالاریا. ادریسیان غ، رضائیان م، قربانی م و همکاران. تک یاخته شناسی پزشکی. اول. تهران: دانشگاه علوم پزشکی تهران؛ 1386: ص228-180. 6. Branch OH, Sutton P, Barnes C, et al. Plasmodium falciparum Genetic Diversity Maintained and Amplified Over 5 Years of a Low Transmission Endemic in the Peruvian Amazon. Mol Biol Evol (MBE) 2011; 28(7): 1973-1986. 7. Kang JM, Moon SU, Kim JY, et al. Genetic polymorphism of merozoite surface protein-1 and merozoite surface protein-2 in Plasmodium falciparum field isolates from Myanmar. Malaria Journal 2010; 9(131). 8. Heidari A, Keshavarz H, Rokni MB, Jelinek T. Genetic diversity in merozoite surface protein (MSP)-1 and MSP-2 genes of Plasmodium falciparum in a major endemic region of Iran. Korean Journal of Parasitology 2007; 45(1): 59-63. 9. Kiwanuka GN. Genetic diversity in Plasmodium falciparum merozoite surface protein 1 and 2 coding genes and its implications in malaria epidemiology: a review of published studies from 1997-2007. J Vector Born Dis 2009; 46: 1-12. 10. Zamani Z, Razavi MR, Sadeghi S, et al. Sequence diversity of the C-terminal region of Plasmodium falciparum merozoite surface protein 1 in Southern Iran. Southeast Asian J Trop Med Public Health(SAJTMPH) 2009; 40(1). 11. Mills KE, Pearce JA, Crabb BS, Cowman AF. Truncation of merozoite surface protein 3 disrupts its trafficking and that of acidic-basic repeat protein to the surface of Plasmodium falciparum merozoites. Mol Microbiol 2002;43:1401–1411. [PubMed: 11952894] 12. Neal AT, Jordan SJ, Oliveira AL, Hernandez JN, Branch OH, Rayner JC. Research Limited variation in vaccine candidate Plasmodium falciparum Merozoite Surface Protein-6 over multiple transmission seasons. 2010. 13. Pearce JA, Triglia T, Hodder AN, Jackson DC, Cowman AF, Anders RF. Plasmodium falciparum merozoite surface protein 6 is a dimorphic antigen. Infection and immunity. 2004;72(4):2321-8. 14. Singh S, Soe S, Roussilhon C, Corradin G, Druilhe P. Plasmodium falciparum merozoite surface protein 6 displays multiple targets for naturally occurring antibodies that mediate monocyte-dependent parasite killing. Infection and immunity. 2005;73(2):1235-8. 15. Kauth CW, Woehlbier U, Kern M, Mekonnen Z, Lutz R, Mücke N, et al. Interactions between merozoite surface proteins 1, 6, and 7 of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Journal of Biological Chemistry. 2006;281(42):31517-27. 16. Khalili MB, Anvari Tafti MH, Sadeh M. Epidemiological pattern of malarial disease in the province of Yazd, Iran (Since 1986-2006). World Journal of Medical Sciences(World J. Med. Sci.) 2009; 4(1): 41-45. 17. WHO. Iran (Islamic Republic of). 2009. Available from: http://www.who.int/malaria/publications/country-profiles/profile_irn_en.pdf 18. رئیس اداره ی مالاریا. کاهش 40 درصدی مالاریا در سیستان و بلوچستان. وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشکی-اخبار و گزارش [20596]. 4 آبان، 1389: ص60. http://www.behdasht.gov.ir |
| نام فایل | تاریخ درج فایل | اندازه فایل | دانلود |
|---|---|---|---|
| rezayatname.doc | 1392/09/23 | 90112 | دانلود |
| final msp6.pdf | 1392/09/23 | 1154563 | دانلود |
| J. Biol. Chem.-2006-Kauth-31517-27.pdf | 1392/09/23 | 484565 | دانلود |
| journal.pone.0005410.pdf | 1392/09/23 | 813457 | دانلود |
| image0058.tif | 1392/09/26 | 18530 | دانلود |
| image0059.tif | 1392/09/26 | 18515 | دانلود |
| image0061.tif | 1392/09/26 | 17946 | دانلود |
| image0062.tif | 1392/09/26 | 12847 | دانلود |
| MSP-6 EDITED kamel.doc | 1392/09/26 | 354816 | دانلود |
| repair_metodology.doc | 1392/10/23 | 409088 | دانلود |
| metodologhy shora.doc | 1392/12/03 | 409600 | دانلود |
| nahaeee.doc | 1392/12/03 | 410112 | دانلود |
