اثرات نوروپروتکتیو عصاره ریشه ویتانیا کواگولانس (پنیر باد) بر سیستم آنتی اکسیدانی و نورونهای ناحیه CA1هیپوکمپ رت های نر مدل ایسکمی فراگیر مغزی

The nueroprotective effects of withania coagulant root extract on antioxidant system and CA1 hippocampus cells in global reperfusion ischemia in male rats .


چاپ صفحه 		پژوهان
صفحه نخست سامانه		 مجری و همکاران
مجری و همکاران		 اطلاعات تفضیلی
اطلاعات تفضیلی		 دانلود
دانلود 		علوم پزشکی زاهدان
علوم پزشکی زاهدان

مجریان: مریم سربیشگی درمیان

کلمات کلیدی:

اطلاعات کلی طرح
hide/show

کد طرح 6813
عنوان فارسی طرح اثرات نوروپروتکتیو عصاره ریشه ویتانیا کواگولانس (پنیر باد) بر سیستم آنتی اکسیدانی و نورونهای ناحیه CA1هیپوکمپ رت های نر مدل ایسکمی فراگیر مغزی
عنوان لاتین طرح The nueroprotective effects of withania coagulant root extract on antioxidant system and CA1 hippocampus cells in global reperfusion ischemia in male rats .
نوع طرح
محل اجرای طرح مدیریت توسعه فناوری سلامت
رسته مطالعاتی تجربی- آزمایشگاهی
دانشکده/مرکز دانشکده پزشکی زاهدان
زمان اجرا -روز

اطلاعات مجری و همکاران
hide/show

نام و نام‌خانوادگی سمت در طرح نوع همکاری درجه‌تحصیلی پست الکترونیک
مریم سربیشگی درمیاناستاد راهنمای اول پایان نامه دانشجوییاستاد راهنمادکترای تخصصی msarbishegi@yahoo.co.in
زهرا حیدریاستاد راهنمای دوم پایان نامه دانشجوییاستاد راهنمادکترای تخصصی histology_iri@yahoo.com
حمیدرضا محمودزاده ثاقبمشاورمشاور علمیدکترای تخصصی histology@ymail.com
محبوبه دوستکامی دانشجوکارشناسی ارشدmahbobedostkami@yahoo.com

اطلاعات تفضیلی
hide/show

عنوان متن
خلاصه طرح به فارسی اثرات نوروپروتکتیو عصاره ریشه ویتانیا کواگولانس (پنیر باد) بر سیستم آنتی اکسیدانی و نورونهای ناحیه CA1هیپوکمپ رت های نر مدل ایسکمی فراگیر مغزی
خلاصه طرح به لاتینThe nueroprotective effects of withania coagulant root extract on antioxidant system and CA1 hippocampus cells in global reperfusion ischemia in male rats .
بيان مسئله تحقيق/اهمیت پژوهشسکته مغزی سومین علت مرگ و میر در دنیا می باشد و پیش بینی می شود تا سال 2020 بیماریهای عروقی مغز دومین عامل مرگ و میر در دنیا خواهد شد [1]. درمانهای کمی برای ایسکمی وجود دارد. یکی از این موارد استفاده از فعال کننده های پلاسمینوژن بافتی (از قبیل استرپتوکیناز) می باشد که موجب باز شدن عروق مسدود می شود. اگر چه بعلت محدودیت هایی استفاده از این دارو هم بسیارکم می باشد[2]. پس از وقوع سکته مغزی تشکیل ادم یکی از علل مهمی است که نقش بسزایی درمرگ نورونی وگسترش ضایعات مغزی دارد[3]. بطوریکه مطالعات نشان داده اند حدود 50% مرگ و میر در آسیب های شدید مغزی مانند سکته یا تروما ناشی از ادم مغزی می باشد[4]. احتمالأ ادم مغزی فشار داخل جمجمه را افزایش داده و با تحت فشارقرار دادن عروق مغزی و کاهش خونرسانی به بافت مغز سبب گسترش ضایعه می شود[5]. کاهش یا قطع جریان خون به قسمتی از مغز بدنبال انسداد یکی از شریانها ی تغذیه کننده آن منجر به ایجاد ایسکمی مغزی ـ موضعی می شود. در مرکز ایسکمی نورونها در همان دقایق اول دچار ضایعات برگشت ناپذیر شده و از بین می روند، در حالیکه در حاشیه آن منطقه ای وجود دارد بنامpenumbra که جریان خون ضعیفی از عروق جانبی می گیرد. نورونها در این ناحیه بتدریج و با گذشت زمان، در اثر فعال شدن مسیر های نوروتوکسیک مختلف از بین رفته و باعث گسترش ضایعه ایسکمی می شود[6-7]. برقراری مجدد جریان خون درناحیه ایسکمی باعث تولید پرواکسیدانت های مختلف شده و سطح کلسیم را افزایش می دهد، سبب آسیب میتوکندری ها وباعث آزاد شدن محتویات آن ها می شود. معمولأ ایسکمی خفیف بدون برقراری مجدد خون منجر به تولید رادیکال های سوپر اکسید و یا پراکسید هیدروژن نمی شود[8]. اما بر قراری مجدد جریان خون به دنبال ایسکمی مغزی تشکیل رادیکال های آزاد را تسریع کرده وسبب اختلال در عملکرد میتوکندری ها و آسیبDNA و مرگ سلول می شود[9].
مطالعات نشان می دهندکه عوامل ROS (Reactive Oxygen Species) مانند سوپراکسید و رادیکالهای هیدروکسیل درتکامل ادم مغزی و ضایعات مغزی نقش مهمی دارند [10]. تشکیل رادیکالهای آزاد بویژه سوپر اکسیدانها و پروتئازها بدنبال ایسکمی مغزی باعث تغییر سد خونی مغزی وتشکیل ادم و مرگ سلولها می شود، برقراری مجدد جریان خون مغز بعد از ایسکمی موقتی نفوذپذیری عروق مغز را افزایش داده و ادم ایجاد شده پس از ایسکمی را وخیم تر می سازد[11]. علت مرگ تدریجی نورون در ناحیه ناحیه شبه ایسکمیک و ایجاد ضایعات ثانویه پس از ایسکمی مغزی دقیقأ مشخص نیست، اما احتمال می دهند فعال شدن مسیر های آبشاری نورتوکسیک بسیار پیچیده از جمله افزایش بیش از حد کلسیم داخل سلولی، رادیکالهای آزاد، آزاد شدن اسید آمینه تحریکی گلوتامات، اسید آراشیدونیک و متابولیت های آن، سیتوکاین ها، التهاب ،آپوپتوز و تشکیل ادم در این ناحیه باعث گسترش ضایعه و ایجاد ضایعات ثانویه می شود [12-13].
شواهد زیادی حاکی از آن است که التهاب یکی از مهمترین دلایل گسترش حجم ضایعه ایسکمیک و ایجاد اختلالات پس از آن می باشد .
توقف جریان خون مغز منجر به مرگ نکروتیک نورون ها گردیده و باعث ایجاد پاسخ های ایمنی و نهایتا فعال شدن سلولهای التهابی و اینفیلتراسیون می گردد . ریپرفیوژن عروق مسدودشده بدلیل گردش خون جانبی جبرانی یا ریکانالیزیشن درمانی منجر به تولید ROS گردیده و این امر خود باعث تحریک سلولهای ایسکمیک و ترشح سایتوکاین های التهابی مانندTNFα(عامل نکروز توموری آلفا) ، IL1-β (اینترلوکین 1- بتا ) وکموکین ها می گردد .ترشح سایتوکاین های التهابی باعث بیانAdhesion molecules در عروق مغزی و بازگشت لکوسیت های محیطی می گردد که این امر باعث شدت یافتن سیگنالهای التهابی آبشاری و نهایتا باعث افزایش صدمه سلولی می شود . [14-15]
مطالعات قبلی نشان داده اند که نقص در بیان و یا کاهش عوامل التهابی باعث کاهش حجم ضایعه ایسکمی مغزی در مدلهای حیوانی می شود . [16]
از طرفی عوامل ROS بطور مستقیم باعث صدمه به غشاء سلولی و اکسیداسیون چربیهای غشاء می شوند .(17)
ظرفیت آنزیمهای آنتی اکسیدانی بافت مغزی توسط ایسکمی ریپرفیوژن تحت تاثیر قرار می گیرد . این سیستم جهت مقابله علیه رادیکالهای آزاد که باعث صدمه به بافت مغزی می گردد مهم است . (18)
بافت مغز بدلیل متابولیسم بالا و مصرف 20% ازکل اکسیژن بدن و پایین بودن میزان آنتی اکسیدانهای اندوژن مانند گلوتاتیون پراکسیداز(GPX)، سوپراکسید دیس موتاز (SOD) و کاتالاز (CAT) نسبت به سایر بافتها در مقابل صدمات اکسداتیو بسیار حساس می باشد . (19)
سلولهای پیرامیدال هیپوکمپ یکی از آسیب پذیر ترین نورونها به صدمات ایسکمیک مغزی می باشند .(20)
بنابراین تقویت سیستم آنتی اکسیدانی مغز ممکن است در کاهش صدمات رادیکالهای آزاد طی ایسکی مغزی موثر باشد .
در حال حاضر دانش درمان صدمات ایسکمی مغزی کافی نمی باشد بنابراین تحقیق روی عوامل محافظتی مغزی که با کمترین ریسک همراه باشد مورد توجه محققین قرار گرفته است استفاده از محصولات گیاهی بدلیل ایمن، ارزان و در دسترس قرار داشتن یکی از منابع ایده آل برای تحقیق می باشد .
گیاه پنیرباد ) ویتانیا کواگولانس ( متعلق به خانواده ی سولاناسه گیاهی است پایا، درختچه ای که به صورت خودرو در سراسر پاکستان و هم چنین جنوب غربی هند و افغانستان میروید . در ایران پراکنش این گیاه محدود به منطقه ی بلوچستان در استان سیستان و بلوچستان است و عمدتاً در رویشگاه های طبیعی شهرستانهای سراوان، خاش و ارتفاعات بم پشت رشد میکند دامداران محلی در استان سیستان و بلوچستان از میوه های گیاه دارویی ویتانیا کواگولانس با استفاده از شیر گاو و گوسفند یک نوع پنیر سفید نرم تولید میکنند که کاملا به صورت تجربی تهیه میشود . [21]
قسمت های مختلف این گیاه در طب سنتی برا ی درمان ، اسهال، استفراغ و فشارخون تجویز می شود یافته های جدید حاکی از تأثیرات ضد سرطانی ، ضد دیابتی ،ضد التهابی وآنتی اکسیدانی آن می باشد . [22-23]
اخیراً نشان داده شده که ویتانیا کواگولانس می تواند باعث مهار عوامل التهابی مانندTNFα گردد .[24]
Mesaik و همکارانش طی مطالعه ای نشان دادند که ویتانیا کواگولانس دارای قدرت مهار بیان اینترلوکین - 2 و مهار پرولیفراسیون لنفوسیت ها می باشد . [25]
همچنین ویتانیا کواگولانس با مهار بیان cox-2 دارای اثر بیشتری بر مهار التهاب نسبت به ضد التهابهای غیر استروئیدی دارد. [26]
از طرفی خاصیت آنتی اکسیدانی آن طی مطالعات زیادی به اثبات رسیده است بطوریکه استفاده از آن بعنوان یک ماده (anti aging) ضد پیری و جوان کننده توصیه می شود . [27] علاوه بر این نتایج مثبت تاثیر آن بر بیماریهای ناشی از افزایش سن مانند بیماریهای قلبی عروقی و دیابت ، آلزایمر ، پارکینسون و سرطان گزارش شده است . [28]
با توجه به اینکه این گیاه بومی منطقه سیستان و بلوچستان بوده و تاکنون تاثیر آن بر ایسکمی مغزی بررسی نشده است بنابراین هدف از این مطالعه بررسی اثرات نوروپروتکتیو این گیاه بر سیستم آنتی اکسیدانی و نورونهای ناحیه CA1هیپوکمپ در مدل ایسکمی فراگیر ریپرفیوژن می باشد .
مشکل جاری که سیاست گزار با آن مواجه است کدام است؟
محل اول بکارگیری نتایج تحقیق
پیشنهاد اول نحوه کاربرد
روش های موجود کدامها هستند؟
منافع و مضرات روشهای موجود کدامند؟
سوالات و / یا فرضیات پژوهش• عصاره هیدروالکلی ویتانیا کواگولانس باعث حفظ نورونهای ناحیه CA1 هایپوکامپ رت ها می شود .
• عصاره هیدروالکلی ویتانیا کواگولانس باعث افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز در هایپوکمپ رت ها می گردد .
• عصاره هیدروالکلی ویتانیا کواگولانس باعث افزایش فعالیت آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز در هایپوکمپ رت ها می گرددد .
• عصاره هیدروالکلی ویتانیا کواگولانس باعث افزایش فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در هایپوکمپ رت ها می گردد .
• عصاره هیدروالکلی ویتانیا کواگولانس باعث کاهش میزان مالون دی آلدئید در ناحیه هایپوکمپ رت ها می گردد .
• عصاره هیدروالکلی ویتانیا کواگولانس باعث کاهش تعداد سلولهای آپوپتوتیک در سلولهای ناحیه CA1 هایپوکامپ رت ها می گردد .
هدف کلی طرحبررسی اثرات نوروپروتکتیو ویتانیا کواگولانس (پنیر باد) بر سیستم دفاع آنتی اکسیدانی و نورونهای ناحیه CA1 هیپوکامپ رت های نر بدنبال ایسکمی فراگیر ریپرفیوژن
محل دوم بکارگیری نتایج تحقیق
پیشنهاد دوم نحوه کاربرد
اهداف اختصاصی• تعیین اثرعصاره هیدروالکلی ویتانیا کواگولانس بر تعداد نورونهای ناحیه CA1 هایپوکامپ
• تعیین اثر عصاره هیدروالکلی ویتانیا کواگولانس بر میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در ناحیه هایپوکمپ
• تعیین اثر عصاره هیدروالکلی ویتانیا کواگولانس بر میزان فعالیت آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز در ناحیه هایپوکمپ
• تعیین اثر عصاره هیدروالکلی ویتانیا کواگولانس بر میزان فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در ناحیه هایپوکمپ
• تعیین اثر عصاره هیدروالکلی ویتانیا کواگولانس بر میزان مالون دی آلدئید ( MDA ) ناحیه هایپوکمپ
• تعیین اثر عصاره هیدروالکلی ویتانیا کواگولانس بر تعداد سلولهای آپوپتوتیک ناحیه CA1 هایپوکمپ
• مقایسه اثر عصاره هیدروالکلی ویتانیا کواگولانس در دوز های 500 و1000 میلی گرم بر تعداد سلولهای آپوپتوتیک ناحیه CA1 هایپوکمپ
• مقایسه اثر عصاره هیدروالکلی ویتانیا کواگولانس در دوز های 500 و1000 میلی گرم بر تعداد نورونهای ناحیه CA1 هایپوکمپ
چرا پیام تحقیق شما حلال مشکل جاری است؟
پیام تحقیق شما چه منافعی از نظر هزینه، کارایی و بهره وری برای مدیر دارد؟
سازمانها، مراکز و موسسات و سایر بهره برداران بالقوه دستاوردهای طرح
محل سوم بکارگیری نتایج تحقیق
اهداف كاربردی
پیشنهاد سوم نحوه کاربرد
تعریف واژه های تخصصیایسکمی مغزی فراگیر : قطع یا کاهش شدید جریان خون به تمام مغز.
ریپرفیوژن: باز گشت مجدد خون بعد از ایسکمی .
برای اجرای راه حل پیشنهادی شما چه موانع و حمایتهایی وجود دارند؟
نوع مطالعهتجربی و آزمایشگاهی
محل چهارم بکارگیری نتایج تحقیق
پیشنهاد چهارم نحوه کاربرد
جامعه مورد مطالعه(معرفی مشارکت کنندگان)/ محیط پژوهش(معیارهای ورود و خروج ذکر شوند)70 رت نژاد Wistar
حجم نمونه و روش محاسبه آندر این مطالعه 70 سر (7 گروه ده تایی) موش صحرایی نر نژادWistar بصورت تصادفی ساده از بین جمعیت در دسترس انتخاب می گردد .
روش نمونه گیری(نحوه تخصیص تصادفی و همسانسازی در صورت لزوم ذکر شود)در این مطالعه 70 سر (7 گروه ده تایی) موش صحرایی نر نژادWistar بصورت تصادفی ساده از بین جمعیت در دسترس انتخاب می گردد
روش و ابزار جمع آوري داده ها / صحت و استحکام داده ها (پرسشنامه یا فرم اطلاعاتی ضمیمه شود)سطح آنتی اکسیدان های سوپراکسید دیس موتاز ،گلوتاتیون پراکسیداز و کاتالاز با استفاده از کیت های مخصوص و تعیین تغییرات بافتی با استفاده از میکروسکوپ نوری (رنگ آمیزی نیسل) ،سلولهای آپوپتوتیک توسط کیت تانل و شمارش تعداد سلولها با استفاده از نرم افزار انجام می گردد .
روش اجرای طرح(با جزئیات بطور کامل شرح داده شود)در این تحقیق از تعداد 70 موش صحرایی نر نژاد ویستار در محدوده وزنی 250-200 گرم و سن 3 الی 4 ماه استفاده می شود . حیوانات در شرایط استاندارد و با دوره روشنایی و تاریکی 12ساعته و دمای 3±21 نگهداری می شوند و دسترسی آزاد به آب و غذا خواهند داشت .
گروه بندی حیوانات :
حیوانات بطور تصادفی انتخاب شده و در 7گروه 10تایی زیر قرار می گیرند :
گروه 1 : به مدت 30 روز عصاره گیاه ویتانیا کواگولانس را به میزان mg/kg500 از طریق گاواژ دهانی دریافت کرده و پس از آن تحت القاء ایسکمی گلوبال ریپرفیوژن مغزی قرار می گیرند .
گروه 2 : به مدت 30 روز عصاره گیاه ویتانیا کواگولانس را به میزان mg/kg1000 از طریق گاواژ دهانی دریافت کرده و پس از آن تحت القاء ایسکمی گلوبال ریپرفیوژن مغزی قرار می گیرند .
گروه 3 : به مدت 30 روز عصاره گیاه ویتانیا کواگولانس را به میزان mg/kg500 از طریق گاواژ دهانی دریافت کرده و پس از آن تحت استرس ایسکمی بدون مسدود کردن شریان کاروتید مشترک قرار می گیرند .
گروه 4 : به مدت 30 روز عصاره گیاه ویتانیا کواگولانس را به میزان mg/kg1000 از طریق گاواژ دهانی دریافت کرده و پس از آن تحت استرس ایسکمی بدون مسدود کردن شریان کاروتید مشترک قرار می گیرند .
گروه 5 : به مدت 30 روز آب مقطر را از طریق گاواژ دهانی دریافت کرده و پس از آن تحت القاء ایسکمی گلوبال ریپرفیوژن مغزی قرار می گیرند .
گروه 6 : به مدت 30 روز آب مقطر را از طریق گاواژ دهانی دریافت کرده و پس از آن تحت استرس ایسکمی بدون مسدود کردن شریان کاروتید مشترک قرار می گیرند .
گروه 7 : گروهی که هیچگونه مداخله ای در آن صورت نمی گیرد .
عصاره گیری از گیاه ویتانیا کواگولانس:
جمع آوری نمونه های ریشه گیاه پنیرباد از گلخانه مرکز پژوهشی گیاهان دارویی و زینتی دانشگاه سیستان و بلوچستان انجام می شود. نمونه ها بعد از جمع آوری با آب بدون یون شسته و در دمای25° در محیط آزمایشگاه خشک شده و عصاره هیدروالکلی به میزان مورد نیاز تهیه می گردد

تعیین خاصیت آنتی اکسیدانی عصاره :
تعیین خاصیت آنتی اکسیدانی عصاره ویتانیا کواگولانس با استفاده از فعالیت مهار رادیکالها توسط روش Moon و Terato (29)با کمی تغییرات بر پایه قدرت مهار رادیکال ثابت 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) اندازه گیری می شود . از بوتیلات هیدروکسی تولوئن(BHT) به عنوان کنترل مثبت استفاده می شود .
روش ایجاد ایسکمی :
جهت بیهوش کردن موشهای صحرایی کلرال هیدرات با دوز 400 میلی گرم به ازای هر کیلوگرم وزن به صورت داخل صفاقی تزریق میشود. برشی بطول 2 سانتی متر در جلو گردن حیوان داده عضلات این ناحیه کنار زده شده تا شریان کاروتید مشترک دیده شود. سپس شریان کاروتید مشترک در دو طرف توسط میکروکلمپ به مدت 30 دقیقه به طور موقت مسدود می گردد. 72 ساعت بعد نیمی از حیوانات هرگروه پس از بیهوشی کامل کشته شده و سپس سر حیوان را جدا نموده و سریعاً مغز را از داخل جمجمه بیرون می آوریم و توسط فسفات بافر سرد Phosphat-Buffered-Salin(PBS) شستشو می دهیم .
پس از جدا نمودن هیپوکمپ آن را با تریس بافر سرد هموژن می نمائیم . سپس محلول بدست آمده را سانتریفیوژ کرده و محلول رویی برداشته و میزان مالون دی الدئید و فعالیت آنزیمهای گلوتاتیون پراکسیداز ، سوپراکسید دیس موتاز و کاتالاز در این مایع اندازه گیری می شود .
اندازه گیری میزان مالون دی آلدئید (MDA) به روش اسپکتروفتومتری
برای اندازه گیری میزان مالون دی آلدئید از روش Satoh (30)استفاده میشود . واکنش مالون دی آلدئید با اسیدتیو باربیتوریک در دمای جوش، منجر به تولید رنگ صورتی می شودکه بوسیله n بوتانول استخراج میگردد و جذب آن در طول موج 530 نانومتر قرائت می گردد .

اندازه گیری فعالیت آنزیم کاتالاز
اندازه گیری آنزیم کاتالاز بر اساس قابلیت آنزیم جهت شکستن H2O2 با استفاده از روش Aebi (31)انجام می گردد . کاهش جذب در 240 نانومتر محاسبه می شود .
اندازه گیری میزان فعالیت SOD
فعالیت سوپراکسید دیسموتاز (SOD) بر اساس اکسیداسیون NADPH طبق روش Misra and Fridovich(32) انجام می گردد .تغییرات جذب در 480 نانومتر قرائت می شود .
اندازه گیری فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز(GPx)
روش بکار رفته در اندازه گیری فعالیت آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز بر اساس روش Paglia and Valentine (33)انجام می گردد. فعالیت آنزیم در کاهش جذب در 340 نانومتر محاسبه و بصورت U/mg بیان می شود، در این روش GSH اکسیدشده را تبدیل به NADPHاکسیداشده می کند که در نهایت توسط آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز کاتالیزه می شود .

فیکساسیون به روش پرفیوژن (Perfusion)
برای مطالعات بافتی و تهیه لام، فیکساسیون به روش پرفیوژن ترانس کاردیال انجام میشود. پس از بیهوشی عمیق بلافاصله با برش میانی پوست وجدار قدامی شکم، از طریق بطن چپ حدود 150-100 سی سی از محلول نرمال سالین برای خارج کردن خون از درون رگ ها در مدت زمان 10-5 دقیقه و سپس حدود 300-400 سی سی از محلول فیکساتیو پارافرمالدیید 4 درصد حل شده در بافر فسفات 1/0 مولار(4/7pH=)، به مدت 30-45 دقیقه از رگ ها عبور داده شد . پس از پایان پرفیوژن، سر حیوان جدا ، مغز خارج شده و طبق اطلس پاکسینوس (34) (ناحیه CA1 هیپوکمپ) علامت گذاری و درهمان فیکساتیو postfix می شود .
روش انجام رنگ آمیزی نیسل (Nissl staining):
به دنبال پرفیوژن ترانس کاردیال، نمونه مغز را به مدت 24-12در فیکساتیوPostfix نموده و به منظور انجام فیکس کردن بافتها نمونه ها در دستگاه پروسسور قرار داده می شوند .
نهایتاً قالب گیری با پارافین انجام شده و برش گیری کرونال با ضخامت 5 میکرون انجام سپس با محلول رنگ کرزیل ویوله استات (Cresyle violet acetate) 1/0 درصد رنگ آمیزی می شوند .
مطالعه میزان مرگ برنامه ریزی شده سلول با استفاده از کیت TUNEL
پس از دپارافینه کردن و آب دهی برشهای بافتی ، اسلایدها طبق پروتکل شرکت سازنده کیت به ترتیب با Proteinase K ، 3% H2O2 ومخلوطی از محلولهای Label solution (450µl) و Enzym solution (50µl) انکوبه میشوند .جهت Detection نیز انکوباسیون با محلول POD و نهایتا محلولDiaminobanzidin) )DAB انجام خواهدشد و پس از Counterstain (رنگ زمینه) توسط هماتوکسیلین آب گیری و شفاف سازی ، در آخر نمونه ها مونت خواهند شد .
کنترل منفی: به منظور کنترل منفی بر اساس دستورالعمل کیت تعدادی از برشهای تهیه شده تنها با حلال آنزیم بدون وجود آنزیم پوشانده می شوند. بقیه مراحل مانند پروتکل فوق انجام خواهد شد .
آنالیزهای مورفومتریک:
به منظور شمارش تعداد سلولها در سمت راست ناحیه CA1هیپوکمپ از هر بلوک پارافینی 5 مقطع 5 میکرونی با فاصله 30 میکرون تهیه و پس از رنگ آمیزی، عکس گرفته شده و با بزرگنمایی ×400 نورونهای پیرامیدال دارای هسته و حدود سلولی مشخص شمارش می گردد
روش تجزیه، تحليل و توصیف داده‌ها (نمونه‌اي از جدول توخالي ضميمه شود و روش هاي آماري مورد استفاده به طور كامل توضيح داده شود)(کیفی و کمی)داده های حاصل از این مطالعه با استفاده از نرم افزار SPSS جمع آوری می گردد. جهت تجزیه و تحلیل داده ها از آنالیز واریانس یکطرفه (ANOVA) استفاده شده و جهت تأیید آن از تست های آماری (Tukey) استفاده خواهد شد
ملاحظات اخلاقی در این تحقیق همه آزمایشات مطابق آئین نامه کمیته اخلاق پژوهشی دانشگاه برای مطالعات حیوانی صورت خواهد گرفت. جراحی ها و نهایتأ کشتن حیوانات تحت شرایط بیهوشی عمیق انجام خواهد شد تا حیوان در طول آزمایش و بعد از آن کمترین درد و رنج را تحمل نماید.
محدودیتهای اجرائی طرح و پیش بینی جهت حل آنهاتاخیر در تامین مواد و مرگ و میر حیوانات
کلمات کلیدیایسکمی مغزی فراگیر– ویتانیا کواگولانس - هیپوکمپ
فهرست منابع و مراجع1. Huang, Y., McNamara, J.O. Ischemic stroke: “Acidotoxicity” is a perpetrator. Cell,2004. 118, 665–670.

2. Doyle, K.P., R.P. Simon, and M.P. Stenzel-Poore, Mechanisms of ischemic brain damage. Neuropharmacology, 2008. 55(3): p. 310-318.
3. Sharma, H.S., J. Westman, and F. Nyberg, Pathophysiology of brain edema and cell changes following hyperthermic brain injury. Progress in brain research, 1998. 115: p. 351-412.
4. Bardutzky, J. and S. Schwab, Antiedema therapy in ischemic stroke. Stroke, 2007. 38(11): p. 3084-3094.
5. CELLULAR, O., The pathophysiology of brain edema and elevated intracranial pressure. Cleveland Clinic journal of medicine, 2004. 71: p. S7.
6. Iadecola, C., et al., Inducible nitric oxide synthase gene expression in brain following cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 1995. 15(3): p. 378-384.
7. Siesjö, B.K., Pathophysiology and treatment of focal cerebral ischemia: Part I: Pathophysiology. Journal of neurosurgery, 1992. 77(2): p. 169-184.
8. Lundgren, J., et al., Acidosis-Induced Ischemic Brain Damage: Are Free Radicals Involved? Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 1991. 11(4): p. 587-596.
9. Murakami, K., T. Kondo, and P.H. Chan, Reperfusion following focal cerebral ischemia alters distribution of neuronal cells with DNA fragmentation in mice. Brain research, 1997. 751(1): p. 160-164.
10. Kinouchi, H., et al., Attenuation of focal cerebral ischemic injury in transgenic mice overexpressing CuZn superoxide dismutase. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1991. 88(24): p. 11158-11162.
11. Hopkins, S.J. and N.J. Rothwell, Cytokines and the nervous system I: expression and recognition. Trends in neurosciences, 1995. 18(2): p. 83-88.
12. Wang, Q., X.N. Tang, and M.A. Yenari, The inflammatory response in stroke. Journal of neuroimmunology, 2007. 184(1): p. 53-68.
13. Siesjö, B.K., Cell damage in the brain: a speculative synthesis. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 1981. 1(2): p. 155-185.
14. Danton, G.H. and W.D. Dietrich, Inflammatory mechanisms after ischemia and stroke. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology, 2003. 62(2): p. 127-136.
15. Mehta, S.L., N. Manhas, and R. Raghubir, Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain research reviews, 2007. 54(1): p. 34-66.
16. Nawashiro, H., D. Martin, and J.M. Hallenbeck, Inhibition of tumor necrosis factor and amelioration of brain infarction in mice. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 1997. 17(2): p. 229-232.

17. 17. Toyokuni S. Reactive oxygen species-induced molecular damage and its application in pathology. Pathol Int 1999;49:91-102.

18. Akyol O, Herken H, Uz E, Fadillioglu E, Unal S, Sogut S, et al. The indices of endogenous oxidative and antioxidative processes in plasma from schizophrenic patients. The possible role of oxidant/antioxidant imbalance. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 2002;26:995-1005.

19. Shulman RG, Rothman DL, Behar KL, Hyder F.Energetic basis of brain activity: implications for neuroimaging.Trends Neurosci. (2004);27:489–495

20. K. Hiroyuki, K. Kyuya, N. Shinichi, Neuronal damage following repeated brain ischemia in the gerbils, Brain Res. 479 (1989) 366–367.


21. Ghahreman, A. and F. Attar, Biodiversity of plant species in Iran, vol. 1, Publication of University of Tehran. Tehran, Iran, 1999.
22. Hemalatha, S., et al., Hypolipidemic activity of aqueous extract of Withania coagulans Dunal in albino rats. Phytotherapy research, 2006. 20(7): p. 614-617.
23. Jaiswal, D., P.K. Rai, and G. Watal, Antidiabetic effect of Withania coagulans in experimental rats. Indian Journal of Clinical Biochemistry, 2009. 24(1): p. 88-93.
24. Youn, U.J., et al., Biologically active withanolides from Withania coagulans. Journal of natural products, 2013. 76(1): p. 22-28.
25. Mesaik, M.A., et al., Biological and molecular docking studies on coagulin-H: Human IL-2 novel natural inhibitor. Molecular immunology, 2006. 43(11): p. 1855-1863.
26. Wube, A.A., et al., Constituents of the stem bark of< i> Discopodium penninervium and their LTB< sub> 4 and COX-1 and-2 inhibitory activities. Phytochemistry, 2008. 69(4): p. 982-987.
27. Register, O., Ashwagandha (Withania somnifera).
28. Maurya, R., Chemistry and pharmacology of Withania coagulans: an Ayurvedic remedy. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2010. 62(2): p. 153-160.
29. Moon, J.H., Terao, J. Antioxidant activity of caffeic acid and dihydrocaffe- icacid in lard and human low-density lipoprotein. J. Agric. Food Chem. 1998; 46,5062–5065.
30. Satho, K. Serum lipid peroxide in cerebrovascular disorders determined by a new colorimetric method. Clin. Chim. Acta 1978, 90, 37–43.
31. Aebi H. Catalase. In: Bergmeyer HU, editor. Methods of enzymatic analysis. New York:Academic Press; 1974. p. 673–7.
32. Misra HP, Fridovich I. The role of superoxide anion in the autooxidation of epinephrine and a simple assay for superoxide dismutase. J Biol Chem. (1972) ; 247:3170-3175.
33. Paglia DE, Valentine WN. Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase. J Lab Clin Med 1967;70:158–69.
34. Paxinos, G., Watson, C.The rat brain in stereotaxic coordinates. Academic Press/Elsevier, Amsterdam. 2007.
معرفی پژوهش/ اهداف پژوهش
(عین عبارت هدف پروپوزال را کپی نکنید. بلکه با جملاتی که برای مردم قابل فهم باشد (برای سواد حدود پنجم ابتدایی )هدف را برای شرکت کنندگان توضیح دهید.) در تمام این متن در صورتیکه شرکت کننده کودک یا فرد فاقد ظرفیت تصمیم گیری است باید مواردیکه منظور از "من"، فرد شرکت کننده بوده است به "کودک" یا "فرد تحت سرپرستی من" اصلاح شود و مواردیکه منظور از "من"، رضایت دهنده است به من به عنوان "ولی" یا "قیم قانونی" اصلاح شود.
خون گیری
(آیا طرح شما نیاز به خونگیری دارد یا خیر)
نحوه همکاری/ مزایا ی طرح
(در این بخش برای شرکت کنندگان به زبان ساده توضیح دهید که: چه مداخله ای بر روی آنها صورت میگیرد. چه اقدامات پاراکلینیکی بر روی آنها انجام میشود. چه نمونه ای و با چه حجمی از آنها میگیرید در این مدت چند نوبت مراجعه باید داشته باشند و به چه فواصلی چه اقداماتی را در پیگیری آنها انجام میدهید. (حتی میتوانید سود بالقوه ای که شرکت کنندگان میتوانند از شرکت در این پژوهش ببرند بنویسید. این سود میتواند شرح احتمال درمان یا تشخیص بهتر بیماریشان، دریافت خدمات سلامت رایگان و یا پرداخت مشوق مالی در ازای جبران همکاریشان باشد)
عوارض جانبی
(منظور عوارض و میزان احتمال بروز آنها در این مطالعه است)
جبران عوارض احتمالی
(برای آنکه شرکت کننده بتواند ارزیابی مناسبی از سود و زیان شرکت در پژوهش شما داشته باشد لازم است بتواند سود و زیان مداخلات معمول و مداخلات این پژوهش را مقایسه کند. به عنوان مثال میزان موفقیت و میزان عوارض هریک را مقایسه کند.) - او باید بداند كه اگر در حين و بعد از انجام پژوهش هم هر مشكلي اعم از جسمي و روحي به علت شرکت در اين پژوهش برایش پيش آمد درمان عوارض، و هزينه‌هاي آن و غرامت مربوطه بر عهده مجري خواهد بود.
هزینه های مربوط به انجام طرح تحقیقاتی
(تمام مداخلات پژوهشی باید برای بیمار رایگان باشد و بیمار بداند شامل چه مواردی هستند. )
روش های جایگزین
در صورت عدم تمایل به شرکت در مطالعه چه روش های درمانی برای بیمار ارائه خواهد شد
محرمانه بودن
بیمار باید بداندکه دست اندر كاران اين پژوهش، كليه اطلاعات مربوط به او را نزد خود به صورت محرمانه نگه‌داشته و فقط اجازه دارند نتايج كلي و گروهي اين پژوهش را بدون ذکر نام و مشخصات بیمار منتشر كنند. و كميته اخلاق در پژوهش با هدف نظارت بر رعایت حقوق وی مي‌تواند به اطلاعات ایشان دسترسي داشته باشد.
پاسخگویی به پرسش ها
در این بخش نام و اطلاعات دسترسی فردی از عوامل پژوهش را که بتواند اطلاعات صحیح و کافی در اختیار شرکت کنندگان قرار دهند و در مورد عوارض و نگرانیها راهنمایی لازم را ارائه دهند ذکر شود
حق نپذیرفتن یا انصراف
بیمار باید بداند که شرکت اودر اين پژوهش کاملاً داوطلبانه است و مجبور به شرکت در اين پژوهش نيست و در صورت عدم شرکت از مراقبت‌هاي معمول تشخيصي و درماني محروم نخواهد شد او باید بداند كه حتي پس از موافقت با شركت در پژوهش مي‌تواند هر وقت كه بخواهد، پس از اطلاع به مجري، از پژوهش خارج شود و خروج اواز پژوهش باعث محرومیت از دریافت خدمات درمانی معمول برای اونخواهد شد.
رضایت
او باید بداند که اگر اشکال يا اعتراضي نسبت به دست اندركاران يا روند پژوهش دارد مي تواند با كميته اخلاق در پژوهش دانشگاه تماس گرفته و مشکل خود را به صورت شفاهي يا كتبي مطرح نمايد. در انتهای فرم قید گردد : اينجانب موارد فوق‌الذکر را خواندم و فهميدم و بر اساس آن رضايت آگاهانه خود را براي شركت در اين پژوهش اعلام مي‌کنم. اينجانب ……………… خود را ملزم به اجراي تعهدات مربوط به مجري در مفاد فوق دانسته و متعهد مي‌گردم در تأمين حقوق و ايمني شركت كننده در اين پژوهش تلاش نمايم
تخصص
عنوان پیام پژوهشی ( حداکثر 20 کلمه)
پیام کلیدی (حداکثر 80 کلمه)
متن پیام پژوهشی ( حداکثر240 کلمه)
اهمیت موضوع(50 کلمه)
مهمترین نتایج طرح به زبان غیر تخصصی(70 کلمه)
موارد کاربرد نتایج طرح (80 کلمه)
تأثیرات و کاربردها
محدودیت‌های شواهد چه بودند؟
آیا این خبر می‌تواند از نظر اجتماعی، سیاسی، فرهنگی، بهداشتی، ارزش های دینی و قوانین سازمان غذا و دارو، تبعاتی داشته‌باشد؟
در صورتی که این طرح منتج به مقاله شده است لینک مقاله درج شود
منابع و مراجع : حداکثر چهار مرجع اصلی استفاده شده در طرح تحقیقاتی مورد نظر را ذکر نمایید
پرسشنامه یا فرم اطلاعاتی

پیوست ها
hide/show

نام فایل تاریخ درج فایل اندازه فایل دانلود
proposal2222.docx1393/02/09112390دانلود
1 001.jpg1393/02/09379625دانلود
2 001.jpg1393/02/09318309دانلود
3 001.jpg1393/02/09407433دانلود
4 001.jpg1393/02/09420748دانلود
5 001.jpg1393/02/09368376دانلود
6 001.jpg1393/02/09315018دانلود
7 001.jpg1393/02/09193141دانلود
WITHANIA COAGULANS DUNAL- AN OVERVIEW.pdf1393/02/09236252دانلود
article1380797337_Bhatnagar et al.pdf1393/02/09288070دانلود
Siesjo_Part 2_Pathophysiology and treatment.pdf1393/02/091921919دانلود
untitled.JPG1393/02/0938907دانلود
eslah metodology.docx1393/02/15112581دانلود
eslah metodology.docx1393/02/29114980دانلود
nahaee.docx1393/02/31115007دانلود