مطالعه ی تغییرات هیپرمتیلاسیون پروموتور و بیان ژن های LATs1,LATs2 در بیماران مبتلا به کارسینوم سلولهای سنگفرشی دهان

Study of promoter hypermethylation and expression changes of LATs1, LATs2 genes in patients with oral squamous cell carcinoma


چاپ صفحه 		پژوهان
صفحه نخست سامانه		 مجری و همکاران
مجری و همکاران		 اطلاعات تفضیلی
اطلاعات تفضیلی		 دانلود
دانلود 		علوم پزشکی زاهدان
علوم پزشکی زاهدان

مجریان: محمدایوب ریگی لادز

کلمات کلیدی: -

اطلاعات کلی طرح
hide/show

کد طرح 6833
عنوان فارسی طرح مطالعه ی تغییرات هیپرمتیلاسیون پروموتور و بیان ژن های LATs1,LATs2 در بیماران مبتلا به کارسینوم سلولهای سنگفرشی دهان
عنوان لاتین طرح Study of promoter hypermethylation and expression changes of LATs1, LATs2 genes in patients with oral squamous cell carcinoma
نوع طرح کاربردی
محل اجرای طرح مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی
رسته مطالعاتی بنیادی- کاربردی
دانشکده/مرکز دانشکده دندانپزشکی زاهدان
زمان اجرا -روز 635

اطلاعات مجری و همکاران
hide/show

نام و نام‌خانوادگی سمت در طرح نوع همکاری درجه‌تحصیلی پست الکترونیک
محمدایوب ریگی لادزمجری دکترای تخصصی dr.rigi@gmail.com
در محمد کردی تمندانیهمکار دکترای تخصصی dor_kordi@yahoo.com
حمیده کدههمکار دکترای تخصصی h_a_kade@yahoo.com

اطلاعات تفضیلی
hide/show

عنوان متن
خلاصه طرح به فارسی مطالعه ی تغییرات هیپرمتیلاسیون پروموتور و بیان ژن های LATs1,LATs2 در بیماران مبتلا به کارسینوم سلولهای سنگفرشی دهان
خلاصه طرح به لاتینStudy of promoter hypermethylation and expression changes of LATs1, LATs2 genes in patients with oral squamous cell carcinoma
بيان مسئله تحقيق/اهمیت پژوهشکارسینوم سلولهای سنگفرشی دهان شایعترین سرطان درناحیه فک وصورت است بطوریکه بیش از 90 % بدخیمی های این محدوده را شامل می شود. سرطانهای حفره دهان در آمریکا سالانه موجب مرگ 6000 نفر می شود .ششمین سرطان شایع در جنس مذکر و دوازدهمین سرطان شایع در جنس مونث می باشد و در برخی از کشورها مانند هندوستان شایعترین سرطان می باشد. علیرغم پیشرفت های جراحی ، رادیوتراپی وپروتکل های شیمی درمانی ، بقای طولانی مدت بیماران مبتلا به این کانسر در 3 دهه گذشته درمحدوده 50 تا 60 درصد بوده است1 و هنوز تعیین پروگنوز بیماری صرفاً با انجام بیوپسی و بررسی پاتولوژی صورت می گیرد که این روش با اینکه ارزشمند می باشد اما نیاز به امکانات اولیه جراحی دارد. سرطان دهان شامل نئوپلاسم های بدخیم لب ، مخاط دهان و بخش دهانی حلقی می باشد که غالب این بدخیمی ها ( بیش از 90 % ) شامل کارسینوم سلولهای سنگفرشی مخاط دهان ولب ها میشود. اگر بتوان بیماران مستعد به OSCC را به طریقی قبل از پیدایش ضایعه پیشرفته به روش Noninvasive غربالگری نمود کار بسیار سودمندی خواهد بود.
زمینه تحقیقاتی مطالعات اپی ژنتیکی مانند بررسی هیپرمتیلاسیون در سطح جهانی رشد بالایی داشته و شرکت های تحقیقاتی، دارویی، و درمانی بسیاری در این زمینه ورود کرده اند. اولویت تحقیقاتی این شرکت در حال حاضر تمرکز بر انجام پروژه های تحقیقاتی در زمینه بررسی هیپرمتیلاسیون و ترجمه این تحقیقات به سمت تولید داروهای کنترل کننده ی میزان متیلاسیون است .
باتوجه به موارد فوق و اینکه شیوع این سرطان در استان سیستان و بلوچستان بدلایل مختلف از جمله وجود ریسک فاکتورهای مشخص مانند استفاده از ناس، پان و قلیان، نسبتاً بالاست لذا بررسی مولکولی تغییرات اپی ژنتیکی ژن های مسیر های سیگنالی در سرطان نقش مهمی درتشخیص اولیه بیماری و پیش آگهی بهتر بیماری در طول درمان دارد و نیز سبب روشن شدن بهتر اتیولوژی بیماری خواهد شد.
سابقه طرح وبررسی متون:
مسیرهیپو شبکه بزرگی از ژن ها است که رشد بافتهای مختلف را طی نمو و بازسازی ، همچنین تحت شرایط پاتولوژی مانند سرطان کنترل میکند. به طوری که هر یک از این ژن ها در صورت تغییرات القاء شده توسط هیپرمتیلاسیون پروموتر می تواند نقش انکوژنی یا تومورسوپرسوری بازی کند. قلب مسیر هیپو یک هسته کینازی است که عبارت است از سرین/ ترئونین کینازها شامل "MST1/ MST2/ LATS1/ LATS2/ SAV1/MOB1A/ "MOB1Bکه LATS1و LATS2رشد بافت را با فسفریلاسیون ژن های پروتوانکوژن در این مسیر مانند YAP1 محدود میکنند. حال در صورت هیپرمتیله شدن پروموتر LATs1,LATs2 مسیر هیپو خاموش میشود و YAP1 وارد هسته شده و سبب رونویسی ژن های دخیل در تکثیر بافتی می شود که در نهایت سبب می شود ما شاهد فنوتیپ سرطانی باشیم. اخیراً چندین پروژه درباره دخالت سیگنال هیپو((Hippo درسرطان آغاز شده است. در سال 2002 Xia H و همکارانش نشان دادند که LATs1 چرخه ی سلول را در مرحله ی ورود G2/M تنظیم می کند و نقش مهمی در آپوپتوز بازی می کند2. در سال 2004 Roman-Gomez J و همکارانش نقش هیپرمتیلاسیون پروموتر LATs1 را به عنوان تومور سوپرسور مهم در سرطان خون بررسی کردند3. همچنین در سال 2005 Takahashi Y و همکارانش نیز کاهش بیان این دو ژن را به دلیل هایپرمتیلاسیون ناحیه ی پروموتر در سرطان سینه گزارش نمودند4. در سال 2006Jiang Z و همکارانش هیپر متیلاسیون و بیان LATs1,LATs2 را در سرطان استروسیتوما بررسی شد5. در سال 2010 Sasaki H و همکارانش هایپرمتیلاسیون این دو ژن را در گروه بیمار مبتلا به سرطان ریه در ژاپن بررسی کردند. این ژن ها علاوه بر نقش مهمی که در مسیر هیپو دارند، در چرخه ی سلولی و آپوپتوز نیز ایفای نقش می کند که این نیز میتواند دلیل محکمی بر نقش ای ژن ها در روند سرطانی شدن باشد6. در سال 2012 Tianhai Jiو همکارانش گزارش کردند که بیان کاهش یافته ی LATs1با پیشروی و درمان گلیوما در ارتباط است7. در سال 2013 Piotr M Wierzbick بیان کاهش یافته LATs1 در سرطان کولورکتال را به دلیل هیپرمتیلاسیون پروموتر این ژن گزارش کردند8. در سال 2013 Yu T و همکارانش نقش تومور سوپرسوری این دو ژن را در سرطان های مختلف بررسی کردند9. در سال 2014 Lin XY و همکارانش بیان ژن LATs1 را به عنوان یک فاکتور مهم دخیل در سرطان ریه معرفی کردند10.
LATs: Large Tumor Suppressor Kinase, MST: Macrophage Stimulating, SAV: salvador homolog1, MOB1A MOB Kinase Activator 1A, MOB1B: MOB Kinase Activator 1B.
ژن های مورد مطالعه عبارتند از :
1. ) LATs1 Large tumor suppressor 1) این ژن روی کروموزوم6q25.1 قرار گرفته و پروتئینی با خاصیت سرین/ترئونین کینازی کد می کند که با کیناز CDC2 در چرخه ی سلولی تشکیل کمپلکس می دهد و در ورود G2/M نقش منفی بازی می کند. همچنین این پروتئین با مهار تکثیر و افزایش آپوپتوز توسط مسیر سیگنالی هیپو نقش مهمی در مهار تکثیر سلولی دارد . از دیگر عملکرد های این ژن تنظیم بیان ژن P53 و تنظیم پلیمریزه شدن اکتین ها طی سیتوکینز است. طبق بررسی های انجام شده در پایگاه داده های مانند genecards بیان این ژن در بافت های سرطانی مانند سینه ، پروستات، سرویکس، استخوان، مغز، کبد، ریه، کولون تغییر معناداری نشان داده است.
2. Large tumor suppressor 2) LATs2) این ژن روی کروموزوم 13q11-q12 قرار گرفته و پروتئینی با خاصیت سرین/ترئونین کینازی کد می کند،که درآغاز میتوز برای در تشکیل دوک تقسیم نقش مهمی بازی می کند. همچنین این پروتئین علاوه بر نقش مهمی که در مهار پروتوانکوژن های مسیر سیگنالی هیپو بازی میکند، در آسیب های مربوط به اسکلت سلولی در کنارP53 ایفای نقش می کند.
طبق مطالعات انجام شده در پایگاه داده هایی مانند Expression Atlas و , genecards بیان این ژن در سرطان های بررسی شده مانند استروسیتوما، سینه و همچنین بافت های توموری مانند ناخنک چشم کاهش یافته است.
سوالات و / یا فرضیات پژوهشبیان ژن LATs1 در کارسینوم سلولهای سنگفرشی دهان تغییر می یابد.
هیپرمتیلاسیون پروموتر ژن LATs1 در بیماران مبتلا به کارسینوم سلولهای سنگفرشی رخ می دهد.
بیان ژن LATs2 در کارسینوم سلولهای سنگفرشی دهان تغییر می یابد.
هیپرمتیلاسیون پروموتر ژن LATs2 در بیماران مبتلا به کارسینوم سلولهای سنگفرشی رخ می دهد.
هدف کلی طرحمطالعه ی تغییرات هیپرمتیلاسیون پروموتور و بیان ژن های LATs1,LATs2 در بیماران مبتلا به کارسینوم سلولهای سنگفرشی دهان نسبت به افراد سالم.
اهداف اختصاصی1. تعیین و مقایسه ی میزان بیان ژن LATs1 در بافت سالم و بافت مبتلا به oscc
2. تعیین و مقایسه ی میزان بیان ژن LATs2 در بافت سالم و بافت مبتلا به oscc
3. تعیین و مقایسه ی میزان هیپرمتیلاسیون پروموتر ژن LATs1 در بافت سالم و بافت مبتلا به oscc
4. تعیین و مقایسه ی میزان هیپرمتیلاسیون پروموتر ژن LATs2 در بافت سالم و بافت مبتلا به oscc
سازمانها، مراکز و موسسات و سایر بهره برداران بالقوه دستاوردهای طرحکلیه رشته های پزشکی ودندانپزشکی مرتبط با سرطان دهان و رشته های مرتبط با بیوتکنولوژی
تعریف واژه های تخصصی-
نوع مطالعهمورد - شاهد
جامعه مورد مطالعه(معرفی مشارکت کنندگان)/ محیط پژوهش(معیارهای ورود و خروج ذکر شوند)نمونه های پاتولوژی SCC حفره دهان که شامل لثه نیزشده باشند موجود در دانشکده دندانپزشکی زاهدان وآزمایشگاههای سطح شهر زاهدان و مواردی که جدیدا جراحی شوند با توجه به اینکه بیماری دیگری در زمینه ی سرطان و مشابه آن در دهان نداشته باشند و با بررسی سابقه ی فامیلی آنها، جنس وسن دیگر بیماری ها و همچنین عمر بلوکه ها، نمونه ها بعنوان case واز بیماران در همین محدوده سنی و جنس مشابه که برای جراحیهای روتین پریودونتال به کلینیک ویژه دانشکده دندانپزشکی و همچنین مطب مجری طرح مراجعه میکنند وشرایط ورود به مطالعه را داشته باشندبعنوان گروه control انتخاب میشوند.از بافت لثه ای این بیماران که طی جراحی درمان پاکت حذف میشود برای گروه کنترول استفاده خواهد شد.
حجم نمونه و روش محاسبه آنبا توجه به مطالعات مشابه و تعداد نمونه های موجود در زاهدان تعداد 50 نمونه سالم و 50 نمونه بیمار برای بررسی هیپر متیلاسیون پروموتر و 15 نمونه سالم و 15 نمونه بیمار برای بررسی بیان ژن مورد مطالعه قرار خواهند گرفت.11
روش نمونه گیری(نحوه تخصیص تصادفی و همسانسازی در صورت لزوم ذکر شود)از بلوک های پارافینه تهیه شده از افراد مبتلا به سرطان دهان که بیماری دیگری در این رابطه نداشته باشند به عنوان مورد و از بافت لثه ای افرادی که برای جراحیهای روتین پریودونتال مراجعه میکنند برای گروه کنترل استفاده خواهد شد. نمونه ها حین عمل توسط فرد جراح جداسازی شده و بلافاصله در مورد گروه مبتلا در داخل بلوکه های پارافینی قرار می گیرد.
روش و ابزار جمع آوري داده ها / صحت و استحکام داده ها (پرسشنامه یا فرم اطلاعاتی ضمیمه شود)هنگام نمونه گیری فرم های اطلاعات مربوط به بیماران مثل سابقه ی فامیلی؛ با رضایت آنها پر شده و پس از انجام آزمایشات داده ها بصورت آماری جمع آوری و وارد نرم افزارهای آماری خواهد گردید.
روش اجرای طرح(با جزئیات بطور کامل شرح داده شود)از بلوک های موجود در آزمایشگاههای مذکور که مربوط به oscc حفره دهان می باشند DNA بافت توسط روش phenol chloroform جداسازی وسپس توسط کیت متیلاسیون، DNA جدا شده بی سولفاته می شود. در مرحله ی بعد DNA که تغییرات روی آن انجام شده PCR می شود و بعد محصول روی ژل می رود و باند هایی که با پرایمر متیل و پرایمر غیر متیل تکثیر می شوند را شمارش می کنیم . روی داده های حاصل آنالیز آماری از طریق Epi info انجام می شود. از بافت های تازه ی جمع آوری شده در محلول RNA Later با استفاده از کیتCinnaPure RNA Purification ، RNA استخراج می شود. پس از استخراج بلافاصله با استفاده از کیت First Strand cDNA Synthesis ، روی یخ و سپس در مراحلی با انکوباسیون RNA تبدیل به cDNA کرده و در مرحله بعدی بررسی وضعیت بیان ژن ها صورت می گیرد که بوسیله Realtime – PCRو با استفاده از کیت SYBER Green و روش ctΔΔ انجام خواهد شد.
روش تجزیه، تحليل و توصیف داده‌ها (نمونه‌اي از جدول توخالي ضميمه شود و روش هاي آماري مورد استفاده به طور كامل توضيح داده شود)(کیفی و کمی)معنا دار بودن هیپرمتیلاسیون پروموتر ژن ها از طریق نرم افزارEpi info و تغییرات بیان ژنهای مورد مطالعه توسط نرم افزار SPSS 17 مورد تجزیه وتحلیل اماری قرار خواهد گرفت.
برای آمارتحلیلی ازتست تصحیح fisherو
independentT testاستفاده خواهد شد.
ملاحظات اخلاقی نمونه ها بدون نام از آزمایشگاه ثبت خواهد شد.همچنین از بیماران گروه کنترول برای استفاده از بافت لثه ای آنان(که طی جراحیهای روتین دور انداخته میشود )اجازه گرفته خواهد شد.
محدودیتهای اجرائی طرح و پیش بینی جهت حل آنهامشکل خاصی را جهت اجرای پروژه انتظار نداریم.
کلمات کلیدیبیان ، هیپرمتیلاسیون، LATs1,LATs2، کارسینوم دهان
Expression , Hypermethylation, LATs1&LATs2 , oscc
فهرست منابع و مراجع1.Seethalakshmi C. Early Detection of Oral Squamous Cell Carcinoma (OSCC) - Role of Genetics: A Literature Review. J Clin Diagn Res. 2013 Aug;7(8):1824-6.
2. Xia H, Qi H, Li Y, Pei J, Barton J, Blackstad M, et al. LATS1 tumor suppressor regulates G2/M transition and apoptosis. Oncogene. 2002;21(8):1233-41
3. Roman-Gomez J, Jimenez-Velasco A, Castillejo JA, Agirre X, Barrios M, Navarro G, et al. Promoter hypermethylation of cancer-related genes: a strong independent prognostic factor in acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2004;104(8):2492-8.

4. Takahashi Y, Miyoshi Y, Takahata C, Irahara N, Taguchi T, Tamaki Y, et al. Down-regulation of LATS1 and LATS2 mRNA expression by promoter hypermethylation and its association with biologically aggressive phenotype in human breast cancers. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 2005;11(4):1380-5.

5. Jiang Z, Li X, Hu J, Zhou W, Jiang Y, Li G, et al. Promoter hypermethylation-mediated down-regulation of LATS1 and LATS2 in human astrocytoma. Neuroscience research. 2006;56(4):450-8.

6. Sasaki H, Hikosaka Y, Kawano O, Yano M, Fujii Y. Hypermethylation of the large tumor suppressor genes in Japanese lung cancer. Oncology letters. 2010;1(2):303-7.

7. Ji T, Liu D, Shao W, Yang W, Wu H, Bian X. Decreased expression of LATS1 is correlated with the progression and prognosis of glioma. Journal of experimental & clinical cancer research : CR. 2012;31:67
8. Wierzbicki PM, Adrych K, Kartanowicz D, Stanislawowski M, Kowalczyk A, Godlewski J, et al. Underexpression of LATS1 TSG in colorectal cancer is associated with promoter hypermethylation. World journal of gastroenterology : WJG. 2013;19(27):4363-73.
9. Yu T, Bachman J, Lai ZC. Evidence for a tumor suppressor role for the large tumor suppressor genes LATS1 and LATS2 in human cancer. Genetics. 2013;195(3):1193-6.
10. Lin XY, Zhang XP, Wu JH, Qiu XS, Wang EH. Expression of LATS1 contributes to good prognosis and can negatively regulate YAP oncoprotein in non-small-cell lung cancer. Tumour Biol.2014
11. Kordi-Tamandani DM1, Ladies MA, Hashemi M, Moazeni-Roodi AK, Krishna S, Torkamanzehi A. Analysis of p15INK4b and p16INK4a gene methylation in patients with oral squamous cell carcinoma. Biochem Genet. 2012 Jun;50(5-6):448-53.


پیوست ها
hide/show

نام فایل تاریخ درج فایل اندازه فایل دانلود
lats1 (1).doc1393/03/18301568دانلود
lats1 (1).doc1393/04/14294912دانلود
komite akhlagh (tarhe markaz).doc1393/04/31294912دانلود
6833-comite akhlaq.doc1393/07/22291840دانلود