تعیین بار انگلی از بافت های مختلف مدل موشی آلوده به توکسوپلاسموزیس حاد پس از تاثیر فلوکونازول به صورت تنها و ترکیب با سولفادیازین و پیریمتامین با روش Real-time PCR

Determination of parasitic burdens from Various Tissues of Infected Mouse Model of Acute Toxoplasmosis after-effects of Fluconazole alone and in Combination with Sulfadiazine and Pyrimethamin using Real-time PCR


چاپ صفحه 		پژوهان
صفحه نخست سامانه		 مجری و همکاران
مجری و همکاران		 اطلاعات تفضیلی
اطلاعات تفضیلی		 دانلود
دانلود 		علوم پزشکی زاهدان
علوم پزشکی زاهدان

مجریان: محمد جعفری مدرک

کلمات کلیدی:

اطلاعات کلی طرح
hide/show

کد طرح 7187
عنوان فارسی طرح تعیین بار انگلی از بافت های مختلف مدل موشی آلوده به توکسوپلاسموزیس حاد پس از تاثیر فلوکونازول به صورت تنها و ترکیب با سولفادیازین و پیریمتامین با روش Real-time PCR
عنوان لاتین طرح Determination of parasitic burdens from Various Tissues of Infected Mouse Model of Acute Toxoplasmosis after-effects of Fluconazole alone and in Combination with Sulfadiazine and Pyrimethamin using Real-time PCR
نوع طرح بنیادی-کاربردی
محل اجرای طرح مدیریت توسعه فناوری سلامت
رسته مطالعاتی کاربردی
دانشکده/مرکز دانشگاه علوم پزشکی
زمان اجرا -روز 300

اطلاعات مجری و همکاران
hide/show

نام و نام‌خانوادگی سمت در طرح نوع همکاری درجه‌تحصیلی پست الکترونیک
جلال زمانمشاور دکترا - PHDjalal.jn@gmail.com
هادی میراحمدیمشاور دکترای تخصصی hmirahmadi59@gmail.com
سینا سکندرپورهمکار sina_sekandarpour87@yahoo.com
محمد جعفری مدرکمجریاستاد راهنمادکترای تخصصی mjafari547547@yahoo.com

اطلاعات تفضیلی
hide/show

عنوان متن
خلاصه طرح به فارسی تعیین بار انگلی از بافت های مختلف مدل موشی آلوده به توکسوپلاسموزیس حاد پس از تاثیر فلوکونازول به صورت تنها و ترکیب با سولفادیازین و پیریمتامین با روش Real-time PCR
خلاصه طرح به لاتینDetermination of parasitic burdens from Various Tissues of Infected Mouse Model of Acute Toxoplasmosis after-effects of Fluconazole alone and in Combination with Sulfadiazine and Pyrimethamin using Real-time PCR
بيان مسئله تحقيق/اهمیت پژوهشتوکسوپلاسما گوندی یک انگل متعلق به اپی کمپلکسا با انتشار جهانی است و از آلوده کننده های مهم پزشکی تمام سلولهای هسته دار پستانداران است(1). توکسوپلاسما گوندی انگل داخلی سلولی اجباری و مشترک بین انسان وحیوانات است.گربه به عنوان میزبان اصلی و سایر پستانداران و پرندگان بعنوان میزبان واسط مورد هجوم این تک یاخته قرار می گیرند(2, 3). در افراد دارای ایمنی کامل ، توکسوپلاسموزیس معمولاً فاقد علامت است یا به صورت تظاهرات پوستی (بثورات جلدی) آدنوپاتی در نوزادانی که از طریق مادرزادی آلوده می شوند و بیماران با نقص ایمنی مانند مبتلایان به ایدز(Acquired immunodeficiency syndrome: AIDS ) و دریافت کنندگان عضو پیوندی ، توکسوپلاسموزیس، ممکن است تهدیدکننده زندگی آن ها باشد(4).
تخمین زده شده است که تقریبا"هرساله 225000 مورد جدید در ایالت متحده گزارش میشود تصور میکنند که 50% موارد انتقال مربوط به خوردن غذاهایی میشود که انگل در داخل آنها زنده مانده است(5). علاوه بر این 4000بیمار ایدزی هرسال در ایالت متحده مبتلا به آنسفالیت توکسوپلاسمایی میشوند واز نقطه نظر اقتصادی،عفونت توکسوپلاسما گوندی اثر منفی شدیدی روی جامعه داردکه به علت مواردی مثل افزایش هزینه های درمان، شیمی درمانی بیماران ایدزی، آزمایش سرولوژیکی برای زنان باردار، مراقبت بیمار،از دست دادن باروری و درمان مادران وکودکان آلوده می باشد(5).بروز آلودگی اکتسابی جدید به میزان خطر آلوده شدن در منطقه مورد نظر و مقدار جمعیتی که قبلا آلوده نشده اند بستگی دارد. لذا، اطلاع دقیق از میزان شیوع توکسوپلاسموز درهر منطقه ضروری است(6). توکسوپلاسما می تواند از طریق خوردن ااوسیستهای موجود درغذا یا آب وبا توسط مصرف کیستهای بافتی موجود در گوشت خام یا نپخته به اشخاص انتقال یابد که گوشت خوک مهمترین منبع گوشتی از نظر توکسوپلاسما گوندی در ایالت متحده وگوشت بره مهمترین منبع در سراسر جهان است(5). توکسوپلاسما قادر است در میزبان مهره دار گوناگونی دوره تکامل خود را طی کنداما میزبان نهایی آن گربه خانگی وانواع خاصی ازدیگر اعضای گربه سانان است(6). تفاوت های آشکار بین میزان شیوع توکسوپلاسموز در مناطق مختلف به دلیل پراکندگی جغرافیائی آب و هوا یا رژیم و عادات غذایی بر عامل بیماری است، چرا که توکسوپلاسموز در نواحی خشک کمترین شیوع و در نواحی گرم و مرطوب بالاترین شیوع را دارد(7). با توجه به عوارض و ضایعات جبران ناپذیر در افرادی با ایمنی سرکوب شده و در نوزادان متولد شده، تشخیص توکسوپلاسموز یس و متعاقب آن درمان، ضروری است(8, 9). انگل به سه شکل ااوسیست،تاکی زوئیت و برادی زوئیت وجود دارد که ااوسیست شکل انتقالی انگل وتاکی زوئیت شکلهایی هستند که به سرعت تکثیر می شوند و مسئول گسترش آغازین عفونت وتخریب بافتها هستند در حالی که برادی زوئیتها به آهستگی تکثیر یافته و کیست تشکیل می دهند (6, 10). اشکال بیماری به صورت حاد،تحت حاد،مزمن وعود بیماری می باشد(11-13). در مدت عفونت حاد توکسوپلاسما گوندی کیستهای درون بافتی را در مغز وعضلات ایجاد می کند،اکثر عفونتهای اولیه بدون نشانه هستند اما بعضی اشکال مزمن نشانه دار مثل عفونتهای چشمی وعفونتهای انتشار یافته وجود دارد .زمانی که عفونت اولیه در مدت بارداری اتفاق می افتد میتواند منجربه ناهنجاریهای شدید نوزادی وعوارض چشمی در جنین شود.در بیماران آلوده به HIVمقادیرپایین TCD4+اجازه فعالسازی دوباره عفونت نهفته وتکثیر دوباره انگل را میدهد ومنجر به بیماری نشانه داری مثل توکسوپلاسموریس مغزی میشود(14). در ایران نیز این انگل شیوع داشته ومیزان آلودگی به توکسوپلاسما در استانهای جنوبی کشور کمتر از مناطق شمالی بوده است.از مهمترین راههای پیشگیری ممانعت از خوردن کیستهای آلوده کننده وجلوگیری از تماس با ااوسیستهای دفع شده از گربه می باشد(15). اخیرا"تلاشها برای حذف این انگل در بعضی از قسمتهای جهان موفقیت آمیز بوده است اما ثابت شده است که بسیار پرخرج می باشد امروزه بعضی از داروها مثل اسپیرامایسین، اریترومایسین وآزیترومایسین برای درمان توکسوپلاسموزیس وجود دارند اما این داروها نمی توانند به تنهایی کاملا" این انگل را حذف کنند ودرجه تاثیر آنها خیلی پایین است بنابراین پیدا کردن یک روش جدید برای درمان توکسوپلاسموزیس مهم می باشد(16).
در حال حاضر موثرترین درمان برای توکسوپلاسموز ترکیب هم افزایی سولفادیازین (SDZ) و پیریمتامین (PYR)، که بلوک های سنتز و کاهش اسید فولیک در Tachyzoites است و یا در موارد عدم تحمل سولفا، پیریمتامین با کلیندامایسین ترکیب شده است(17, 18). تجویز همزمان فولینیک اسید به رژیم غذایی بیمار نیز به منظور به حداقل رساندن اثرات سمی پیریمتامین که می تواند سبب سرکوب مغز استخوان در بیماران شود گنجانده شده است.اگر چه بسیار موثر است، اما این درمان معمولا با بسیاری از واکنش های جانبی، به ویژه در بیماران مبتلا به ایدز ، از جمله مسمومیت خونی به علت PYR و حساسیت به دلیل SDZ همراه است و در بیماران مبتلا به انسفالیت توکسوپلاسمایی (TE)بعد از قطع دارو در طول دوره ای 6-4 هفته درمان باعث عود مجدد بیماری شود(19, 20).
همان طور که از واژه بر می آید مفهوم Real time PCR مشاهده ای لحظه به لحظه یک فرایند می باشد.در این سامانه یک رنگ فلورسانت نقش دارد که در هر سیکل تقسیم از خود نور مرئی صاتع می نماید که توسط آشکارگر شناسایی و ثبت می شود(21).اولین بار در سال 1992 higuchi و همکاران با اضافه کردن اتیدیوم بروماید به مخلوط PCR جزء پیشگامان این تکنیک بودند(22).از کاربرد Real time PCR می توان به بررسی بیان ژن،تاثیر دارو درمانی،تعیین Load عوامل عفونی،ژنوتیپینگ و موارد بسیار دیگر می باشد(23, 24).
چنانچه Real time PCR در حال حاضر به عنوان تکنیکی برای سنجش کمی توکسوپلاسما در اندام های موش در نظر گرفته می شود(25-27).
با توجه به مطالب ذکر شده جایگزین کردن داروی مناسب با سمیت کمتر نسبت به درمان های حاضر یا ترکیبات داروهای مختلف جهت کنترل و درمان بیماری توکسوپلاسموزیس یکی از اولویتهای ضروری است.
در مطالعه انجام شده توسط Érica S. Martins-Duarte که در سال 2010 در برزیل انجام شد، که به بررسی اثر دارو ایتراکونازول و فلوکونازول بر انگل توکسوپلاسما گوندی در مدل موشی مورد ارزیابی قرار گرفت. در این تحقیق در پایان مطالعه میزان بقاء موش ها و کیست های مغزی بررسی گردید و اینچنین بیان شد که دارو های فوق اثر ضد انگلی بالا داشته و داروی امن نسبت به دیگر دارو های موجود در بازار می باشد (20).
در مطالعه ای که توسط Érica S. Martins-Duarte که در سال 2013 در برزیل انجام شد، به بررسی اثر دوز های مختلف دارو فلوکونازول در ترکیب با سولفدیازین و پریمتامین بر علیه توکسوپلاسموزیس حاد در مدل موشی مورد ارزیابی قرار گرفت و اینگونه بیان شد که دوز پایین داروی فلوکونازول اثر ضد انگلی قوی به صورت ترکیبی با سولفادیازین و پریمتامین و ترکیب به صورت تک با پیریمتامین بر انگل داشته و میزان مرگ میر در موش ها را کاهش داده است(19).
در مطالعه انجام شده توسط Olgica Djurkovic´ -Djakovic و همکاران که در سال 2012 در صربستان انجام شد، که بار انگلی در بافت های مختلف موش بعد از ایمن زایی، به روش Real time PCR مورد بررسی قرار گرفت و اینچنین بیان شد که در پایان دوره 49 روزه میزان بار انگلی در بافت مغز بسیار بالا بوده و بافت کبد از DNA انگل به صورت کامل پاک شده است(26).
در مطالعه انجام شده توسط Ahmad Daryani و همکاران که در سال 2014 در شمال ایران انجام شد، که بار انگلی در بافت های متفاوت موش آلوده به انگل توکسوپلاسما که توسط آنتی ژن انگل ایمن زایی در انها انجام شده بود و با استفاده از روش Real time PCR قطعه ای ژنی B1 انگل مورد سنجش قرار گرفت، بعد از انجام آزمایش و بررسی بار انگلی در بافت های مختلف اینگونه بیان شد که بار انگل در بافت ها به مقدار قابل توجهی کاهش یافته این امر نشان دهنده حساسیت روش Real time PCR برای تشخیص انگل در بافت های مختلف و موثر بودن واکسن پیشنهادی بود است (25).
سوالات و / یا فرضیات پژوهش1- اثر فلوکونازول بر کمیت انگل توکسوپلاسما گوندی در بافت مغز مدل موشی آلوده به توکسوپلاسموزیس حاد چگونه است؟
2- اثر فلوکونازول بر کمیت انگل توکسوپلاسما گوندی در بافت کبد مدل موشی آلوده به توکسوپلاسموزیس حاد چگونه است؟
3- اثر فلوکونازول در ترکیب با سولفادیازین و پیریمتامین بر کمیت انگل توکسوپلاسما گوندی در بافت مغز مدل موشی آلوده به توکسوپلاسموزیس حاد چگونه است؟
4- اثر فلوکونازول در ترکیب با سولفادیازین و پیریمتامین بر کمیت انگل توکسوپلاسما گوندی در بافت کبد مدل موشی آلوده به توکسوپلاسموزیس حاد چگونه است؟
5- اثر فلوکونازول در ترکیب با پیریمتامین بر کمیت انگل توکسوپلاسما گوندی در بافت مغز مدل موشی آلوده به توکسوپلاسموزیس حاد چگونه است؟
6- اثر فلوکونازول در ترکیب با پیریمتامین بر کمیت انگل توکسوپلاسما گوندی در بافت کبد مدل موشی آلوده به توکسوپلاسموزیس حاد چگونه است؟
هدف کلی طرحتعیین بار انگلی از بافت های مختلف مدل موشی آلوده به توکسوپلاسموزیس حاد پس از تاثیر فلوکونازول به صورت تنها و ترکیب با سولفادیازین و پیریمتامین با روش Real-time PCR
اهداف اختصاصی1- بررسی اثر فلوکونازول بر کمیت انگل توکسوپلاسما گوندی در بافت مغز مدل موشی آلوده به توکسوپلاسموزیس حاد
2- بررسی اثر فلوکونازول بر کمیت انگل توکسوپلاسما گوندی در بافت کبد مدل موشی آلوده به توکسوپلاسموزیس حاد
3- بررسی اثر فلوکونازول در ترکیب با سولفادیازین و پیریمتامین بر کمیت انگل توکسوپلاسما گوندی در بافت مغز مدل موشی آلوده به توکسوپلاسموزیس حاد
4- بررسی اثر فلوکونازول در ترکیب با سولفادیازین و پیریمتامین بر کمیت انگل توکسوپلاسما گوندی در بافت کبد مدل موشی آلوده به توکسوپلاسموزیس حاد
5- بررسی اثر فلوکونازول در ترکیب با پیریمتامین بر کمیت انگل توکسوپلاسما گوندی در بافت مغز مدل موشی آلوده به توکسوپلاسموزیس حاد
6- بررسی اثر فلوکونازول در ترکیب با پیریمتامین بر کمیت انگل توکسوپلاسما گوندی در بافت کبد مدل موشی آلوده به توکسوپلاسموزیس حاد
سازمانها، مراکز و موسسات و سایر بهره برداران بالقوه دستاوردهای طرحبکار گیری نتایج حاصله در جهت بهبود پروتکل درمانی توکسوپلاسما در سطح کشور
تعریف واژه های تخصصیتوکسوپلاسما گوندی : یک تک یاخته انگلی داخل سلولی اجباری از شاخه آپی کمپلکسا است که قادر به آلودگی انسان و طیف وسیعی از حیوانات خونگرم می باشد.

توکسوپلاسموزیس: بیماری ایجاد شده توسط توکسوپلاسما گوندی که در جنین بصورت سقط یا ناهنجاری های مادرزادی و در افراد ایمونوساپرس بصورت درگیری سیستم اعصاب مرکزی ، آنسفالیت و حتی مرگ دیده می شود.

تاکی زوئیت : فرم فعال و تکثیر شونده توکسوپلاسما گوندی که به تمامی سلولهای هسته دار میزبان حمله کرده ودر مرحله حاد بیماری دیده می شود.
برادی زوئیت : فرم غیر فعال با تکثیر آهسته توکسوپلاسما گوندی که در داخل کیست نسجی ودر مرحله مزمن بیماری دیده می شود.
اووسیست : فرم حاصل از سیکل جنسی انگل در روده گربه که با مدفوع دفع شده و باعث آلودگی میزبانان واسط می شود.
فلوکونازول: داروی‌ ضد قارچ‌ است‌ که‌ برای‌ عفونت‌های‌ کاندیدایی‌ دهان‌ (برفک‌)، گلو، و واژن‌ و عفونت های سیستمیک ناشی از کاندیدیاز کریپتوکوکوز و در درمان عفونت قارچی پوستی مصرف می شود. .این دارو در قارچ های حساس به دارو،آنزیم های وابسته به CYP450 را مهار می نماید وبیوسنتز دیواره سلولی را مختل می کند.جذب خوارکی دارد و بعد از جذب در مایعات بدن به سرعت پخش می شود.
پیریمتامین:یک دارو ضد مالاریا و توکسوپلاسمای قوی می باشد که آنتاگونیست اسید فولیک است. اثر درمانی این دارو بر اساس اختلاف نیاز انگل و سلول های میزبان به اسید فولیک برای سنتز نوکلئیک اسید است.در درمان توکسوپلاسموز،این دارو را توأم با یک دارو سولفانامایدی به علت اثر تقویتی دو دارو به کار می رود.
سولفادیازین: یک آنتی بیوتیک کوتاه اثر از دسته سولفانامید ها است.سولفانامید ها در درمان شانکروئید،مالاریا،نوکاردیازیس،توکسوپلاسموز و... استفاده می شود. موجب مهار تشکیل دی هیدروفولات از PABA می شود که در نهایت منجر به وقفه در ساخت پورین ها و تیمیدین و DNA می گردد.به راحتی از دستگاه گوارش جذب می شود.متابولیسم کبدی دارد.
واکنش زنجیره پلی مراز (PCR) : در زیست شناسی ملکولی واکنش زنجیره پلی مراز روشی است برای تکثیر یک یا چند نسخه از یک قطعه ملکول DNA که موجب تولید میلیونها نسخه از یک توالی خاص DNA می گردد. این روش متکی بر چرخه حرارتی ، شامل چرخه هایی از اعمال حرارت و سردکردن واکنش برای ذوب و نسخه برداری آنزیمی ملکول DNA است
Real-time PCR: یک روش PCR می باشد که همان طور که از معنی واژه بر می آید مشاهده لحظه به لحظه یک فرآیند می باشد. در این روش در هر سیکل از واکنش نور مرئی توسط یک رنگ فلورسانس ساطع می شود که توسط آشکارگر این نور شناسایی و ثبت می شود.
نوع مطالعهتجربی(Experimental)
جامعه مورد مطالعه(معرفی مشارکت کنندگان)/ محیط پژوهش(معیارهای ورود و خروج ذکر شوند)موش های آزمایشگاهی نژاد BALB/c
معیار ورود موش های ماده دارای سن 8-6 هفته و وزن 25-20 گرم
حجم نمونه و روش محاسبه آن55 سر موش ماده نژاد BALB/C در 11گروه به صورت تصادفی تقسیم می شوند
روش نمونه گیری(نحوه تخصیص تصادفی و همسانسازی در صورت لزوم ذکر شود)برای انجام آزمایشات ، حیوانات به طور تصادفی در 11 گروه (55 موش) قرار خواهند گرفت
روش و ابزار جمع آوري داده ها / صحت و استحکام داده ها (پرسشنامه یا فرم اطلاعاتی ضمیمه شود)انجام آزمایش بر روی بافت های مغز و کبد موش
روش اجرای طرح(با جزئیات بطور کامل شرح داده شود)تکثیر و نگهداری انگل:

مواد لازم برای تکثیر و نگهداری انگل شامل 10 سر موش سوری، بافر فسفات سالین(PBS)،پنی سیلین،آب مقطر 1000 سی سی ابتدا بافر را تهیه و به PH 7.4-7.2 می رسانیم سپس محلول را اتوکلاو کرده و بعد از پایین آمدن دما به آن 100unit/ml پنی سیلین به آن اضافه می کنیم و تا زمان انجام آزمایش در یخچال نگهداری خواهد شد. تکثیر انگل در موش انجام می شود به این ترتیب که ابتدا تاکی زوییت سویه RH توکسوپلاسما به صورت جامد تهیه می کنیم. جهت حذف ماده نگهدارنده یک بار با محلول PBS شست و شو داده و سپس با دو پاساژ متوالی داخل صفاقی در موش سوری انگل احیا می شود. برای تکثیر و نگهداری انگل به هر موش cc ۵/۰ مایع صفاقی حاوی102 تاکی زوییت زنده و u/ml۱0۰ پنی سیلین به طور داخل صفاقی تلقیح می شود. پس از گذشت ۳ الی ۴ روز حفره صفاقی موش‌های آلوده باcc ۵ بافر PBS سرد شست و شو و تاکی زوییت‌ها جمع آوری می شدند. سپس در میکروتیوپ‌های 1.5 سی سی تقسیم و در 20- درجه سانتی گراد نگهداری خواهد شد.برای حذف ماکروفاژهای صفاقی 5 سی سی PBS را به انگل بدست امده اضافه می کنیم و به مدت 10 دقیقه در 800 دور سانتریفوژ می کنیم و مایع رویی را تخلیه می کنیم این عمل را 3 بار تکرار می کنیم.بعد از شستشو با شمارش تعداد انگل با لام نئوبار رسوب باقی مانده در ویال های کوچک تقسیم می شود و در 20- درجه سانتی گراد نگهداری خواهد شد.

آلوده سازی موش ها:

بعد از آلوده کردن موش BALB/c توسط تاکی زوئیتهای سویه RH توکسوپلاسما گوندی به میزان عدد به صورت داخل صفاقی موش ها آلوده شده و یک روز بعد آلوده شدن موش ها دارو درمانی شروع می شود.

گروه ها:

تعداد 55 سر موش ماده نژاد Balb/c با سن 8- 6 هفته و وزن 25-20 گرم که به مدت یک هفته در شرایط محیطی( با درجه حرارت 2±23 سانتی گراد، 12 ساعت نور 12 ساعت تاریکی، رطوبت 40 درصد)قرار می دهیم تا سازگاری پیدا کنند. بعد از سازگاری موش ها با محیط به طور تصادفی موش ها را به 11 گروه 5 تایی تقسیم می کنیم گروه ها شامل:

گروه کنترل sham که انگل و دارو دریافت نمی کنند

گروه کنترل منفی که شامل 5 سر موش BALB/c است ودارو دریافت نکرده و تنها حلال دارو ها پلی اتیلن گلیکول(PEG)دریافت می کنند.

گروه کنترل مثبت که شامل 5 سر موش BALB/c است و فقط ترکیب داروهای سولفادیازین و پریمتامین دریافت می کنند.

گروه کنترل مثبت که شامل 5 سر موش BALB/c است و فقط دارو پریمتامین دریافت می کنند.

گروه های درمان که شامل 8گروه : که شامل 5 سر موش BALB/c است و شامل:

گروه درمان فلوکونازول که خود به دو زیر گروه که یکی دوز mg/kg 10 و گروه دیگر دوز mg/kg20 را روزانه دریافت می کنند

گروه درمان فلوکونازول در ترکیب با سولفادیازین و پریمتامین که این گروه به دو زیر گروه تقسیم می شود که در این دو زیر گروه دوز درمانی سولفادیازین mg/kg40 و دوز پریمتامین mg/kg 1 ثابت بوده و تفاوت در دوز فلوکونازول می باشد که در یک گروه دوز mg/kg 10 و گروه دیگر دوز mg/kg20 را روزانه دریافت می کنند.

گروه درمان فلوکونازول در ترکیب با پریمتامین که خود به سه زیر گروه تقسیم می شود که در سه زیر گروه دوز درمانی پریمتامین mg/kg 10 ثابت و تفاوت در دوز های درمانی دارو فلوکونازول می باشد که در گروه اول دوز mg/kg 20 در گروه دوم دوز mg/kg 40 و در گروه سوم دوز mg/kg 80 را به صورت روزانه دریافت می کنند.

درمان:

درمان در تمام گروه ها 24 ساعت بعد آلوده کردن موش ها شروع می شود و به صورت روزانه یک بار به مدت 10 روز انجام می شود. بعد از اتمام دوره درمان موش ها به مدت 30 روز بررسی می شود و میزان مرگ و میر موش ها ثبت می شود.

کشتار موش ها:

در پایان روز 10 یک موش از هر گروه و در پایان دوره 41 روزه تمام موش های زنده باقی مانده کشته می شود(طبق دستورالعمل کار با حیوانات آزمایشگاهی)سپس مغز و کبد بعد از تشریح جدا،وزن شده و با سرم فیزیولوژی کامل شستشو شده تا خون آنها کامل خارج شود تا در صورت وجود آلودگی،آلودگی از بافت باشد سپس بافت ها را درمحلول PBS گذاشته وهموژن شده و در پایان مطالعه با گروه کنترل از نظر بار انگلی مقایسه می شود.

بررسی میزان بار انگل:

پس از پایان مطالعه و هموژن کردن بافت های مورد نظر و تهیه سوپرناتانت و نگهداری در 70- سپس توسط کیت،DNA هر نمونه استخراج شده در ادامه پرایمر ها برای قطعه ژنی B1 انگل توکسوپلاسما گندی طراحی شده و توسط دستورالعمل های استانداردReal-time PCR بار انگل توکسوپلاسما گندی در بافت های کبد و مغز را مورد بررسی قرار می دهیم.

روش تجزیه، تحليل و توصیف داده‌ها (نمونه‌اي از جدول توخالي ضميمه شود و روش هاي آماري مورد استفاده به طور كامل توضيح داده شود)(کیفی و کمی)پس از گرد آوری اطلاعات لازم,داده ها در نرم افزار spss نسخه 18 وارد و تجزیه و تحلیل خواهد شد.آزمون های آماری شامل آنالیز واریانس دو طرفه (ANOVA)،کای دو
ملاحظات اخلاقی نحوه رفتار با حیوانات به تایید کمیته اخلاق دانشگاه خواهد رسید.همچنین فرم چک لیست کار با حیوانات آزمایشگاهی بر اساس کد های راهنمای کار با حیوانات ابلاغی وزارت بهداشت تکمیل و زمیمه شده است در تمام مراحل,کار با حیوانات آزمایشگاهی بر اساس پروتوکول استاندارد کار با حیوانات آزمایشگاهی عمل خواهد شد.
محدودیتهای اجرائی طرح و پیش بینی جهت حل آنها• مشکل تهیه مواد و امکان طولانی شدن زمان دریافت آنها
• تلف شدن حیوانات در طول اجرا طرح
• یکی از خطاهای احتمالی، خطای فرد مشاهده گر در قرائت نتایج می باشد . برای برآورد اثر آن ، محقق بر روی 50 نمونه از دو فرد مشاهده گر به طور مستقل استفاده می کند و هر کدام از این افراد نتایج را بدون اطلاع از یکدیگر ثبت می نمایند. در نهایت با محاصبه ضریب توافق کاپا ، میزان توافق دو مشاهده گر تعیین می گردد و در صورتی که ضریب توافق کاپا بالای 95٪ باشد ، خطای مشاهده گر قابل تحمل خواهد بود..
• یکی دیگر از منابع خطا، خطای ابزار می باشد. فقط از دستگاههایی استفاده خواهد شد که قبلا توسط کارشناسان بخش کالیبره و استاندارد شده باشند(روایی آنها مورد تایید باشد). درضمن برای بررسی پایایی (تکرار پذیری) نتایج ، آزمون Real time PCR بر روی نمونه ها به مدت شش ماه تکرار می گردد و هر بار نتایج ثبت می گردد.
کلمات کلیدیToxoplasma gondii
Real-time_PCR
Fluconazole
فهرست منابع و مراجع1. Mesquita RT, Ziegler AP, Hiramoto RM, Vidal JE, Pereira-Chioccola VL. Real-time quantitative PCR in cerebral toxoplasmosis diagnosis of Brazilian human immunodeficiency virus-infected patients. Journal of medical microbiology. 2010 Jun;59(Pt 6):641-7.
2.Dubey JP. Strategies to reduce transmission of Toxoplasma gondii to animals and humans. Veterinary parasitology. 1996 Aug;64(1-2):65-70.
3.Dubey JP, Frenkel JK. Toxoplasmosis of rats: a review, with considerations of their value as an animal model and their possible role in epidemiology. Veterinary parasitology. 1998 May;77(1):1-32.
4. Lin MH, Chen TC, Kuo TT, Tseng CC, Tseng CP. Real-time PCR for quantitative detection of Toxoplasma gondii. Journal of clinical microbiology. 2000 Nov;38(11):4121-5.
5. Jauregui LH, Higgins J, Zarlenga D, Dubey JP, Lunney JK. Development of a real-time PCR assay for detection of Toxoplasma gondii in pig and mouse tissues. Journal of clinical microbiology. 2001 Jun;39(6):2065-71.
6.Black MW, Boothroyd JC. Lytic cycle of Toxoplasma gondii. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 2000 Sep;64(3.
7.Swierzy IJ, Muhammad M, Kroll J, Abelmann A, Tenter AM, Luder CG. Toxoplasma gondii within skeletal muscle cells: a critical interplay for food-borne parasite transmission. International journal for parasitology. 2014 Feb;44(2):91-8.
8.Kadri D, Crater AK, Lee H, Solomon VR, Ananvoranich S. The potential of quinoline derivatives for the treatment of Toxoplasma gondii infection. Experimental parasitology. 2014 Oct;145:1
9.Duhey JP, Whitesell LE, Culp WE, Daye S. Diagnosis and treatment of Neospora caninum--associated dermatitis in a red fox (Vulpes vulpes) with concurrent Toxoplasma gondii infection. Journal of zoo and wildlife medicine : official publication of the American Association of Zoo Veterinarians. 2014 Jun;45(2):454-7.
10.Ding JQ, Wu K, Tan F, Chen XG. [Establishment of an in vitro tachyzoite-bradyzoite interconversion system for Toxoplasma gondii]. Nan fang yi ke da xue xue bao = Journal of Southern Medical University. 2010 Apr;30(4):668-71..
11.D'Angelo JG, Bordon C, Posner GH, Yolken R, Jones-Brando L. Artemisinin derivatives inhibit Toxoplasma gondii in vitro at multiple steps in the lytic cycle. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 2009 Jan;63(1):146-50. PubMed PMID: 18988681.
12.Lopes AP, Dubey JP, Darde ML, Cardoso L. Epidemiological review of Toxoplasma gondii infection in humans and animals in Portugal. Parasitology. 2014 Nov;141(13):1699-708.
13.Dubey JP, Jones JL. Toxoplasma gondii infection in humans and animals in the United States. International journal for parasitology. 2008 Sep;38(11):1257-78.
14.Ueno N, Lodoen MB, Hickey GL, Robey EA, Coombes JL. Toxoplasma gondii-infected natural killer cells display a hypermotility phenotype in vivo. Immunology and cell biology. 2014 Dec 23.
15.Jafari R, Sadaghian M, Safari M. Seroprevalence of Toxoplasma gondii Infection and Related Risk Factors in Tabriz City, Iran, 2008. Journal of research in health sciences. 2012;12(2):119-21..
16.Murakami Y, Hoshi M, Hara A, Takemura M, Arioka Y, Yamamoto Y, et al. Inhibition of increased indoleamine 2,3-dioxygenase activity attenuates Toxoplasma gondii replication in the lung during acute infection. Cytokine. 2012 Aug;59(2):245-51.
17.Notarangelo FM, Wilson EH, Horning KJ, Thomas MA, Harris TH, Fang Q, et al. Evaluation of kynurenine pathway metabolism in Toxoplasma gondii-infected mice: implications for schizophrenia. Schizophrenia research. 2014 Jan;152(1):261-7.
18.Selseleh M, Modarressi M, Shojaee S, Mohebali M, Eshraghian M, Selseleh M, et al. Brain Tissue Cysts in Infected Mice with RH-Strain of Toxoplasma gondii and Evaluation of BAG1 and SAG1 Genes Expression. Iranian journal of parasitology. 2013 Jan;8(1):40-6.
19.Martins-Duarte ES, de Souza W, Vommaro RC. Toxoplasma gondii: the effect of fluconazole combined with sulfadiazine and pyrimethamine against acute toxoplasmosis in murine model. Experimental parasitology. 2013 Mar;133(3):294-9.
20.Martins-Duarte ES, Lemgruber L, de Souza W, Vommaro RC. Toxoplasma gondii: fluconazole and itraconazole activity against toxoplasmosis in a murine model. Experimental parasitology. 2010 Apr;124(4):466-9.
21.Aksoy U, Marangi M, Papini R, Ozkoc S, Bayram Delibas S, Giangaspero A. Detection of Toxoplasma gondii and Cyclospora cayetanensis in Mytilus galloprovincialis from Izmir Province coast (Turkey) by Real Time PCR/High-Resolution Melting analysis (HRM). Food microbiology. 2014 Dec;44:128-35.
22.Higuchi R, Dollinger G, Walsh PS, Griffith R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Bio/technology. 1992 Apr;10(4):413-7.
23.Costa JG, Carneiro AC, Tavares AT, Andrade GM, Vasconcelos-Santos DV, Januario JN, et al. Real-time PCR as a prognostic tool for human congenital toxoplasmosis. Journal of clinical microbiology. 2013 Aug;51(8):2766-8.
24.Lin Z, Zhang Y, Zhang H, Zhou Y, Cao J, Zhou J. Comparison of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) and real-time PCR method targeting a 529-bp repeat element for diagnosis of toxoplasmosis. Veterinary parasitology. 2012 Apr 30;185(2-4):296-300.
25.Daryani A, Sharif M, Dadimoghaddam Y, Souteh MB, Ahmadpour E, Khalilian A, et al. Determination of parasitic load in different tissues of murine toxoplasmosis after immunization by excretory-secretory antigens using Real time QPCR. Experimental parasitology. 2014 Aug;143:55-9.
26.Djurkovic-Djakovic O, Djokic V, Vujanic M, Zivkovic T, Bobic B, Nikolic A, et al. Kinetics of parasite burdens in blood and tissues during murine toxoplasmosis. Experimental parasitology. 2012 Jul;131(3):372-6.
27.Homan WL, Vercammen M, De Braekeleer J, Verschueren H. Identification of a 200- to 300-fold repetitive 529 bp DNA fragment in Toxoplasma gondii, and its use for diagnostic and quantitative PCR. International journal for parasitology. 2000 Jan;30(1):69-75.

پیوست ها
hide/show

نام فایل تاریخ درج فایل اندازه فایل دانلود
Toxoplasma gondii Fluconazole and itraconazole activity against toxoplasmosis.pdf1393/10/27419869دانلود
Toxoplasma gondiiThe effect of fluconazole combined with sulfadiazine and.pdf1393/10/27479574دانلود
Determination of parasitic load in different tissues of murine.pdf1393/10/27537810دانلود
eslah onvan va metodology.doc1393/11/11493568دانلود
nahaee.doc1393/11/18494080دانلود