چاپ صفحه |  صفحه نخست سامانه |  مجری و همکاران |  اطلاعات تفضیلی |  دانلود | علوم پزشکی زاهدان |
| کد طرح | 7213 |
| عنوان فارسی طرح | ژنوتایپینگ انواع فاسیولاجداشده ازگاووگوسفندبااستفاده ازPCR-RFLPدرشهرستان زاهدان |
| عنوان لاتین طرح | Genotyping of Fasciola spp. Isolated from sheep and cattile using PCR-RFLP in Zahedan |
| نوع طرح | |
| محل اجرای طرح | مدیریت توسعه فناوری سلامت |
| رسته مطالعاتی | بنیادی |
| دانشکده/مرکز | دانشکده پزشکی زاهدان |
| زمان اجرا -روز | 270 |
| نام و نامخانوادگی | سمت در طرح | نوع همکاری | درجهتحصیلی | پست الکترونیک |
|---|---|---|---|---|
| محمد جعفری مدرک | مجری اول | استاد راهنما | دکترای تخصصی | mjafari547547@yahoo.com |
| هادی میراحمدی | مجری دوم | استاد راهنما | دکترای تخصصی | hmirahmadi59@gmail.com |
| حسین انصاری | مشاور | مشاور آمار | دکترای تخصصی | smithepi@gmail.com |
| عنوان | متن |
|---|---|
| خلاصه طرح به فارسی | ژنوتایپینگ انواع فاسیولاجداشده ازگاووگوسفندبااستفاده ازPCR-RFLPدرشهرستان زاهدان |
| خلاصه طرح به لاتین | Genotyping of Fasciola spp. Isolated from sheep and cattile using PCR-RFLP in Zahedan |
| بيان مسئله تحقيق/اهمیت پژوهش | فاسیولازیس در چند دههء گذشته به عنوان یک بیماری مهم درپزشکی و دامپزشکی مطرح بوده است(1).اما در سالهای اخیر چهره اپیدمیولوژیک بیماری تغییر کرده است وامروزه میدانیم که این بیماری فقط یک بیماری zoonotic نبوده بلکه آن را به عنوان یک بیماری انگلی انسانی مهم میشناسیم (2و3).در تحقیقات انجام گرفته تخمبن زده شده است که حدود 17 میلیون نفر در دنیا به این عفونت مبتلا می باشند(4). عامل بیماری دو انگل ترماتود Fasciola hepatica و Fasciola gigantica (Fasciolidae:Trematoda)می باشند که گسترش جغرافیایی متفاوتی در دنیا دارند(5). در حالیکه در اروپا, آمریکا و استرالیا فقط با یک گونه F.hepatica مواجه هستیم در بسیاری از مناطق آسیا و آفریقا دو گونه انگل روی هم افتادگی (overlap) دارندکه این وضعیت باعث بروز برخی مشکلات در تمایز این دو گونه شده است(6).
تشخیص رایج و سنتی برای افتراق این دو گونه بر اساس خصوصیات مرفولوژیک کرم بالغ و تخم می باشد(10-7). به هر حال تمایز این دوترماتود کبدی بر اساس علائم بالینی, پاتولوژی و روش های ایمونولوژیکی و مدفوعی دقیق نمی باشد(13-10، 3). تمایز گونه ها و زیر گونه های انگل به خصوص زمانی که با فرم های کوچک و حد واسط سرو کار داریم مشکل است.این روی هم افتادگی در انتشار دو گونه اساس مباحث طولانی در تعیین هویت تاکسونومیک انگل های فاسیولا در کشور های آسیای جنوب شرقی به خصوص ژاپن , کره , تایوان و فیلیپین و حتی ایران و پاکستان و مصر از آفریقابوده است (14). در دو انتهای این طیف انگل های شبیه فاسیولا هپاتیکاوبعضی شبیه فاسیولا ژیگانتیکا بوده در حالی که اشکال حد واسط نیزدیده شده که می توانند مولود پدیده هایی مانند گامتوژنز غیر طبیعی و پارتنوژنز diploid,triploid و Mixploid باشند(1،3،12،13،14) . مطالعات اخیر نشان داده است که گونه های مختلف میزبان اصلی به طور قطع روی حالت مورفومتریک انگل بالغ و تخم اثر می گذارد (19-15) . تکنیک های مختلف جدا سازی پروتئین های انگل در سال های اخیر برای تمایز گونه ها و سوش های انگل های مختلف به کار رفته است. در افتراق بیوشیمیایی بین دو گونه از الگوی پروتئینی که توسط دیسک الکتروفورز در ژل پلی اکریل آمید انجام شده استفاده شده است (20،21،22). در روش IEF(Iso Electric Focusing) در ژل پلی اکریل آمید ساختار کمپلکس ژنتیکی به پروفیل اختصاصی گونه ای داده میشود.IEF پروتئینی های محلول , ساده , تجدید شونده و دارای قابلیت تفکیک خوبی برای جدا سازی گونه های فاسیولا می باشد (23،24،25). همچنین رویکرد های متنوعی بر حسب تفاوت های موجود در ژن های مختلف این دو انگل برای افتراق آنها گزارش شده است. بررسی سکانس های نوکلئوتیدITS 1, و ITS 2 ( Internal Transcription Spacer)از ریبوزومال DNAبه خصوص ITS 1 مارکر ژنتیکی قابل قبولی و معتبری برای طبقه بندی کرم های پهن می باشد (26،27،28). در این روش ها از تکنیک های PCR (Polymerase Chain Reaction)و PCR-RFLP (PCR_Restriction Fragment LengthPolymorphism)وPCR –RAPD(Random AmplifiedPolymorphic DNA fragment-polymerase chain reaction) استفاده می شود(29). با توجه به اینکه فاسیولا در ایران یک تاریخچهء طولانی داشته و با در نظر گرفتن وقوع دو اپیدمی بزرگ فاسیولازیس در استان گیلان که طی آن ده هزار نفراز مردم دو شهر رشت و بندر انزلی مبتلا شدند اهمیت این بیماری و عاملین آن بسیار حائز اهمیت است. نظر به اینکه در مطالعات آزمایشگاهی و سرولوژی تعیین دقیق نوع انگل واجد اهمیت است زیرا دو گونه انگلی باعث اشتباه در جواب آزمایش میگردد. به همین دلیل نیاز به یک تست موثق برای تفکیک گونه های انگل ضروری به نظر می رسد. بویژه اکنون مشخص شده است که الگوی ایجاد علائم پاتولوژیک در میزبان در مورد این دو گونه انگل متفاوت است و مشخص شده که عوارض ایجاد شده در اثر فاسیولا ژیگانتیکا قویتر از هپاتیکا است (30). هم چنین ثابت شده است که تکامل ژیگانتیکا در کبد به زمان بیشتری (بیشتر از 14 هفته ) نیاز دارد در حالیکه هپاتیکا در عرض 8تا 10 هفته در کبد مستقر و بالغ میگردد ( 31،32). تمام این اطلاعات بیانگر لزوم تفریق هرچه دقیقتر و صحیح تر این دو گونه انگلی با استفاده از روش های مولکولی نوین است. در طرح پژوهشی حاضر هدف این است که با بررسی توالی دقیق نوکلئوتیدهادر ژنهای مختلف دوگونه فاسیولا های نامبرده (این کار با استفاده از نرم افزارهای کامپیوتری وداده های بانک ژن انجام می پذیرد)، ژن های مناسبی را برای افتراق این دو گونه با استفاده از فرایند تاثیر آنزیم های محدودالاثر بیابیم. آنگاه با جداسازی تعداد معنی داری از کرم ها از میزبانهای مختلف ابتدا با مورفولوژی و سپس الگوهای PCR-RE آنها را تعیین کرده و ازاین راه گونه هرکدام را دقیقا معلوم کنیم سپس با استفاده از ژن rDNA و روش PCR-RFLP و ژنوتایپینگ و تعیین توالی انجام می شود .بنابراین ، طرح حاضرپس از افتراق این دو گونه قصد دارد ، تعداد قابل توجهی از ایزوله ها را نیز تعیین هویت نماید. آنالیز اطلاعات ژنومیک به دست آمده از بانک ژن ونیز اطلاعات حاضر از طرح های قبلی مجریان این طرح نشان می دهد که گر چه ناحیه ITS1 در دو گونه فاسیولا بسیار به هم شبیه است ولی حتی از روی تعداد بسیار کم نوکلئوتید متفاوت در دو گونه هنوز هم می توان یک سیستم PCR-REبرای افتراق آن دو اجرا نمود. تکنیک های مختلف جداسازی پروتئین های انگلی بویژه در مورد کرم های پهن که تشابه های مورفولوژیک بیشتری دارند در سال های اخیر برای تمایز گونه ها وسوش های انگل های مختلف در میزبان های مختلف بکاررفته اند.اما بدون شک اهمیت روش های مبتنی بر بررسی بازهای هسته ای در این مورد اهمیت بیشتری دارد. نشان داده شده است که مورفولوژی برخی کرم های پهن تحت تاثیر برخی ویژگی های میزبان قرار دارد. مطالعات موروفولوژیک خطای انسانی و آزمایشگاهی زیادی را در پی دارد. لذا با توجه به اهمیت روش های مولکولی و با توجه به تکنیکRFLP- PCR وروش Sequencing اختلافات ژنوتیپی احتمالی بین گونه های فاسیولا در میزبان های مختلف در این مطالعه مورد بررسی قرار خواهد گرفت. هم چنین با توجه به اینکه گونه های مختلف انگلی در نقاط مختلف دنیا با هم متفاوتند و در این منطقه مطالعه جامعی در این خصوص صورت نگرفته مطالعه الگوهای بازهای هسته ای فاسیولا در میزبان های مختلف بسیار حائز اهمیت است.بی شک دانستن این موضوع که این انگل در میزبان های متفاوت دارای الگوی نوکلئوتیدی مشابه یا متفاوت است برای محققین این رشته اهمیت بسیار داشته وبرای مطالعات تشخیصی وتاکسونومیک ضروری است. بررسی متون : در مطالعه ای که در سال 2014توسط شفیعی وهمکاران به منظور تشخیص فاسیولوزیس انسانی در استان کهگیلویه و بوبراحمد انجام شد از قطعه ژنتیکی ITS1,2 و روش PCR-RFLP استفاده شد(33) در مطالعه ای که در سال0 201توسط رکنی و همکاران برای تشخصی ملکولی فاسیولا هپاتیکا با استفاده از روش RAPD-PCR و سکانس قطعه ریببوزومی ITS1 انجام شد.ایزوله های جدا شده هیچ تنوع ژنتیکی در قطعه rDNA-ITS1نشان ندادند. بر اساس پرایمر UBC90 سه الگوی متفاوت برای هر کدام از ایزوله های گوسفندی و گاوی و دو الگوی دیگر برای ایزوله های بوفالو بود.تمام ایزوله های گاوی دارای الگوی یکسانی با پرایمر R151 بودند(34) .در مطالعه شهبازی و همکاران در سال 2011 در تبریز برای شناسایی و تعیین تنوع ژنتیکی فاسیولوز با روش های PCR-RFLP و RAPD-PCR که در روش RAPD هیج گونه تفاوتی بین گونه های هپاتیکا و ژیگانتیکا دیده نشد در حالی که با روش RFLP این دو گونه از هم تفریق داده شدند.(35) در مطالعه ای که در سال 2009 توسط قوامی و همکاران برای آنالیز فنوتیپی و ژتوتیپی فاسیولوز در زنجان انجام گرفت با استفاده از روش PCR-RFLP و قطعه ITS2 برای تفریق گونه های فاسیولوز استفاده گردید.(36) در مطالعه رکنی و همکاران در سال 2010 به منظور تعیین و تشخیص فاسیولا هپاتیکا و ژیگانتیکا بر پایه قطعه ITS1 با استفاده از روش PCR-RFLP نتایجی حاصل شد که می توان از این روش برای تفریق مابین هپاتیکا و ژیگانتیکا و همچنین تشخیص استفاده کرد.(37) در مطالعه مهامی-اسکویی و همکاران برای تعیین و تشخیص ایزوله های فاسیولا با استفاده از PCR-RFLP و قطعه های ریبوزومال (ITS1, 5.8S rDNA, ITS2 ) انجام شد که این روش جدید ( با استفاده از آنزیم محدود کننده Tsp509I) برای تمایز بین گونه ای مناسب و کارا بود.(38) در مطالعه Alasaadaو همکاران در سال 2011با استفاده از روش Real-time PCR(qPCR) برای تفریق بین گونه ای فاسیولا با استفاده از ITS2 مورد استفاده قرار گرفت.(39) در سال 1993 Adlard و همکارانش مقایسهای بر روی rDNA-ITS2 درجمعیتها و گونههای فاسیولیده انجام دادند (40). این مطالعه تنوعها را در توالیهای نوکلئوتیدی ناحیه ITS2 بررسی کرده که خود ناشی از تفاوتهای بین گونهای خانواده فاسیولیده میباشد. در سال 1993 chung و همکاران از روش IEFدر ژل پلی اکریلامید برای آنالیز ژنتیکی گونه های متفاوت فاسیولا استفاده کردند(41) ولی این روش برای تعیین تفاوت های مورفولوژیک بین گونه ای مناسب نبود. Kramer و همکاران اثبات کردند که استفاده از سکانس های تکرار شوندهDNA به عنوان پروب اختصاصی یک ابزار اپیدمیولوژیک خوب برای تعیین فاسیولازیس در حلزون میزبان واسط بوده ولی در شناسایی افتراقی بین دو گونه فاسیولا کاربرد ندارد(42). در سال 1998 Itagaki و همکاران فرم تریپلوئید از فاسیولا در ژاپن را مورد بررسی قرار داده و ارتباط ژنتیکی فاسیولا هپاتیکا و فاسیولا ژیگانتیکا بوسیله توالیهای ITS2 از rDNA را مشخص کردهاند (43). توالیهای ITS2 در کرمهای تریپلوئید ژاپنی به دو تایپ مجزا تقسیم شده که یکی مشابه فاسیولا هپاتیکا و دیگری شباهت با فاسیولا ژیگانتیکا از کشور اندونزی داشت. در سال 1998 Jousson و همکاران استفاده از rDNA-ITS1 جهت مشخص کردن چرخه زندگی مزومتریدی را مورد مطالعه و بررسی قرار دادند(44). باروش PCR-RFLP Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism ) ) تکامل در چرخه زندگی آتی و مطالعات اکولوژیکی در این خانواده مشخص شده است. گونه های فاسیولای مصری با استفاده از معیار های مورفومتریک, مورفولوژیک وکموتاکسونومیک توسط Lotfi و همکاران تعیین شده است(45) ودر نتیجه ثابت شده که هر دو گونه فاسیولا در مصر وجوددارد. در سال 2004 Ramadan و همکاران تعیین اشکال گوناگون ژنتیکی در فاسیولا هپاتیکاهای غیر انسانی و فاسیولا ژیگانتیکا بوسیله تکنیک RAPD-PCR ،( Random Amplified Polymorphic DNA fragments-Polymerase Chain Reaction ) مورد بررسی قرار دادند(46).این اندازهگیری برای تشخیص منحصر به فرد و ردیابی اپیدمیولوژیکی در مناطق اندمیک کمک کننده میباشد. در سال 2005 Seraphima و همکاران سکانس های نوکلئوتید ITS2ازDNA 58 نمونه از کشورهای روسیه , بلاروس , اوکراین , ارمنستان , ترکمنستان , ازبکستان و تاحیکستان را برای افتراق بین دو گونه مورد بررسی قرار دادند(47). Itagaki و همکاران طی بررسی دیگری که انجام دادندخصوصیات ژنتیکی گونه های فاسیولا را در ژاپن بر اساس ژن های ITS 2از rDNAو سیتوکروم cاکسیداز میتوکندریایی (CO1)و NADPدهیدروژناز(NAD1)را مورد بررسی قرار دادند(48). Linو همک).اران در Mainland چین گونه های فاسیولا را با استفاده از توالی ITS2از DNAریبوزومال با روش RFLP PCR تعیین نمودند (49) این روش برای تشخیص مولکولی, مطالعات اکولوژیک و ساختار زنتیکی فاسیولا حتی در نقاط دیگر ارزشمند ومناسب است. در سال 2007 Smith و همکاران با استفاده از Real time-PCR به کلونینگ و تعیین خصوصیت پروتئین شوک حرارتی 17 کیلو دالتونی پرداخته و اختلافاتی را در بیان ژن HSP70در فاسیولا هپاتیکا و ژیگانتیکا یافتند(50). در سال 2007 Perigio و همکاران با استفاده از روش CIAS(Computer Image Analysis System)به توصیف مورفومتریک گونه های فاسیولا هپاتیکا و ژیگانتیکا و گونه های حد واسط در مناطق اندمیک دلتای نیل مصر پرداختند(51). در سال 2007 Alasaad و همکاران با روش PCR و ژن ITS1گونه های مختلف فاسیولا در میزبان ها و مناطق جغرافیایی اسپانیا را مورد بررسی قرار دادند(52) وبعد از تحقیقات دریافتند اختلاف سکانس های به دست آمده مربوط به میزبان های به خصوص و یا نمونه های مناطق جغرافیایی خاصی نمی باشد. مطالعات Valero و همکاران بر روی انگلهای فاسیولا نشان داده است که گونه میزبان نهائی حتی در یک منطقه اندمیک معینی بطور مشخص بر روی اندازه ترماتودهای بالغ و تخم آنها مؤثر است (53و54). در مطالعه اشرفی (54) مقایسه متغیرهای مرفومتریک هپاتیکا و ژیگانتیکای جدا شده از دامهای استان گیلان تفاوت های آماری معنی داری را در اکثر پارامترهای مرفومتریک مطالعه شده نشان می دهد و گزارش شده که این دو گروه نمی توانند به یک گونه تعلق داشته باشند. براین اساس فاسیولا هپاتیکای گیلان از نظر سکانسهای نوکلئوتیدی TIS-2 به فاسیولا هپاتیکای اروپا و فاسیولا ژیگانتیکای گیلان به فاسیولا ژیگانیکای ( بورکینافاسو) شباهت دارد. همچنین مطالعات فنوتیپی با استفاده از مارکرهای مورفومتریک حکایت از وجود تفاوت هایی در الگوی متوفومتریک انگلهای فاسیولای استان گیلان و فاسیولا هپاتیکای خالص امریکای جنوبی ( بولیوی ) و فاسیولا ژیگانتیکای خالص افریقا ( بورکینا فاسو) دارد. |
| سوالات و / یا فرضیات پژوهش | 1. توزیع فراوانی گونه فاسیولا ژیگانتیگا بر حسب نوع میزبان چگونه است؟
2. توزیع فراوانی گونه فاسیولا هپاتیکا بر حسب نوع میزبان چگونه است؟ |
| هدف کلی طرح | ژنوتایپینگ انواع فاسیولاجداشده ازگاووگوسفندبااستفاده از PCR-RFLP درشهرستان زاهدان |
| اهداف اختصاصی | 1. تعیین توزیع فراوانی گونه فاسیولا ژیگانتیگا بر حسب نوع میزبان .
2. تعیین توزیع فراوانی گونه فاسیولا هپاتیکا بر حسب نوع میزبان . |
| سازمانها، مراکز و موسسات و سایر بهره برداران بالقوه دستاوردهای طرح | - کمک به ارتقا آگاهیهای ژنومیک دررابطه با کرمهای پاتوژن به منظور درک بیشتر پاتوژنزیسیته آن ها
- استفاده از مورد بالا جهت بررسی های تشخیصی و کنترل عفونت - منا سب تر کردن بستر تحقیقاتی وسیعتر و کارآمدتر در رابطه با روش های زیست شناسی مولکولی و کاربرد آنها در تحقیقات پزشکی مربوط به کرمهای بیماریزا |
| تعریف واژه های تخصصی | |
| نوع مطالعه | توصیفی-مقطعی |
| جامعه مورد مطالعه(معرفی مشارکت کنندگان)/ محیط پژوهش(معیارهای ورود و خروج ذکر شوند) | جهت تهیه65 مورد کبد آلوده به انگل درنوبت های متعددبه کشتارگاه های زاهدان مراجعه خواهدشد .باهماهنگی باتکنیسینهاوکارشناسان دامپزشکی مسئول بازرسی لاشه ها،کبدهای آلوده به فاسیولاجمع آوری وبه آزمایشگاه منتقل میگردد. |
| حجم نمونه و روش محاسبه آن | باتوجه به نوع آزمایش نیازبه فرمول نمونه گیری نمیباشد.درطرح حاضرحداقل 35 نمونه فاسیولاگوسفندی وحداقل 30 نمونه فاسیولاگاوی ازدامهای آلوده جداشده وهمگی آنهاموردآزمون قرارمیگیرند. |
| روش نمونه گیری(نحوه تخصیص تصادفی و همسانسازی در صورت لزوم ذکر شود) | باتوجه به نوع آزمایش نیازبه فرمول نمونه گیری نمیباشد.درطرح حاضرحداقل 35 نمونه فاسیولاگوسفندی وحداقل 30 نمونه فاسیولاگاوی ازدامهای آلوده جداشده وهمگی آنهاموردآزمون قرارمیگیرند. |
| روش و ابزار جمع آوري داده ها / صحت و استحکام داده ها (پرسشنامه یا فرم اطلاعاتی ضمیمه شود) | مراجعه به کشتارگاه شهرستان زاهدان |
| روش اجرای طرح(با جزئیات بطور کامل شرح داده شود) | روش تهیه انگل ازکشتارگاه:
جهت تهیه انگل در نوبت های متعدد به کشتارگاه های زاهدان مراجعه خواهد شد .با هماهنگی باتکنیسین ها وکارشناسان دامپزشکی مسئول بازرسی لاشه ها،کبد های آلوده به فاسیولاجمع آوری وبه آزمایشگاه منتقل میگردد.انگل های فاسیولا هپاتیکا و فاسیولاژیگانتیکا جمع آوری شده و بطور موقت در بشر حاوی PBS با حرارت 37درجه سانتیگراد قرار داده شده و سپس با تفکیک انگل های نامبرده با استفاده از مشخصات مروفولوژیک، جمعا" 6 بار و به مدت یکساعت با محلول PBS ،o.15M و pH.7.2 ، جهت زدودن مواد اضافی و میکروب ها شستشو می شوند. پس از این مدت انگل ها ی شسته شده جهت انجام آزمایشات مولکولی در اتانول 70% نگه داری میشوند. تشخیص مورفولوژیک فاسیولا هپاتیکا از ژیگانتیکا * تشخیص افتراقی بر مبنای یافته های علمی مندرج در متون انگل شناسی صورت خواهد گرفت که اعم آن برمبنای زیر است: 1. ژیگانتیکا درازتر و دارای قطر باریکتر از هپاتیکاست. 2. مخروط راسی ژیگانتیکا کمتر مشخص است. 3. انتهای ژیگانتیکا گرد و انتهای هپاتیکا نوک تیز است. 4. فاصله انتهای مجموعه بیضه های ژیگانتیکا تا انتهای خلفی کمتر از هپاتیکاست. *Ref. Sahba, G.H., Arfaa, F., Farahmandian, I., Jalali, H., 1972. Animal fascioliasis in Khuzestan, southwestern Iran. J Parasitol 58, 712-716. روش کار بخش مولکولی این آزمایشات در آزمایشگاه انگل شناسی دانشگاه زاهدان و درآزمایشگاه سرولوژی واحدکرم شناسی دانشکده پزشکی انجام خواهد شد. استخراج DNA از بافت های کرم -DNA ی ژنومی از هر کدام از فاسیولاهای بالغ جدا می گردد. برای اینکار ابتدا هر کرم با استفاده از هموژنیزر الکتریکی له شده و با استفاده از SDS (سدیم دودسیل سولفات ) 10% و پروتئیناز K ( 100 میکروگرم در میلی لیتر ) و سپس فنل کلروفرم ایزو آمیل الکل DNA استخراج می شود . آنگاه با استفاده از ایزو پروپانول ، استات سدیم و اتانول 70% DNA تخلیص شده و نهایتا" در 200 میکرولیتر آب مقطر حل شده ودرc20- تا موقع لازم نگهداری می گردد . در صورت لزوم جهت تخلیص بیشتر DNA از کیت های Qamp استفاده می شود . 2- PCR : با استفاده از پرایمرهای تقویت کننده ناحیه internal transcribed spacer 1 یک قطعه حدود 560 جفت بازی تکثیر می گردد . شرایط PCR به قرار ذیل است : الف : پرایمر ها Forward : 5' – GGT GGA TCA CTG GGC TCG TG - 3' Reverse : 5' – TAT GCT TAA ATT CAG CGG GT -3' ب : غلظت های موادPCR 10mMTris 1X PCR buffer 1.5mM Mgcl2 100μM dNTP 50pmol Primer 2.5u Taq polymerase 3- الکتروفورز محصولات PCR : با توجه به اندازه قطعه مورد انتظار ، محصولات PCR در ژل آگارز 2/1 % با استفاده از ولتاژ v 100 به مدت یکساعت الکتروفورز شده ، ژل در اتیدیوم بروماید ( به غلظت 5/0 میکروگرم در میلی لیتر ) رنگ آمیزی شده و با استفاده از uvitec مشاهده و عکس برداری می شود . برای دقت و صحت عملیات مارکر مناسب استفاده می شود . 4-تعیین توالی : تعدادی از نمونه ها جهت تعیین توالی دقیق ( sequencing ) به خارج از کشور ارسال می گردد .توالی ها آنالیز شده وار لحاظ Variabilityو,Conservity بایکدیگر و با نمونه های خارجی بررسی و مقایسه می شود. در صورت conserve بودن به میزان بیش از 99% این قطعه به عنوان Target انتخاب و استفاده میشود. 5- RFLP به منظور درک اختلافات احتمالی بین ایزوله های مختلف ، محصولات PCR با استفاده از آنزیم مناسب ،(انتخاب این آنزیم نیاز به کار نرم افزاری دقیقی دارد که در صورت تصویب این طرح انجام خواهد شد). هضم شده و محصولات هضم اندونوکلئازی مجددا" الکتروفورز می شود . برای اینکار یک میکرولیتر آنزیم با 5/2 میکرولیتر بافر مربوطه و 20 میکرولیتر محصول PCR مخلوط شده و آب مقطر استریل تا حجم 25 میکرولیتر اضافه شده و بمدت 3 ساعت انکوبه می گردد . 6- اجرای روش PCR-RE برروی تمام نمونه های فاسیولا که اینکار با استفاده از آنزیم انتخابی، انجام شده و با استفاده از نرم افزارهای کامپیوتری مورد تجزیه و تحلیل قرار می گیرد. |
| روش تجزیه، تحليل و توصیف دادهها (نمونهاي از جدول توخالي ضميمه شود و روش هاي آماري مورد استفاده به طور كامل توضيح داده شود)(کیفی و کمی) | داده ها برای آنالیزهای آماری با نرم افزارهای SPSS و با استفاده از آزمون کای – اسکوئر با سطح اطمینان 95 درصد موردتجزیه و تحلیل توصیفی قرار می گیرد. |
| ملاحظات اخلاقی | نمونه های موردآزمایش قبلاذبح شده ولذانکته اخلاقی خاصی باقی نمیماند |
| محدودیتهای اجرائی طرح و پیش بینی جهت حل آنها | درحال حاضربه نظرنمی آیدنکته خاصی دراین موردوجودداشته باشد |
| کلمات کلیدی | Genotyping , Fasciola spp, PCR-RFLP, Zahedan |
| فهرست منابع و مراجع | 1. Mas-Coma, S. & Bargues, M. D. (1997). Human liver flukes: a review. Research and Reviews inParasitology 57,145-218.
2. Mas-Coma, S., Esteban, J. G. & Bargues, M. D. (1999). Epidemiology of human fascioliasis: a review and proposed new classification. Bulletin of the World Health Organization 77, 340±6. 3. Mas-Coma, S, Bargues, M. D. & Esteban, J. G. (1999). Human Fasciolosis in Fasciolosis (Dalton, J. P., ed.) pp. 411±34. Wallingford, Oxon, UK: CAB International Publishing. 4. Hopkins, D. R. (1992). Homing in on helminths. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 46, 626±34. 5. Marcilla,A.,Bargues,M.D.,Mas-Coma,S. PCR-RFLP for distinction between Fasciola hepatica and F.gigantica. Molecular and cellular Probes (2002) 16,327-337. 6. Mas-Coma S.,Esteban J.G. and Barges M.D. Epidemiology of human Fascioliasis : a review and proposed new classification .Bulletin of the WHO,1990,72(4). 7. Mas-Coma,S.,Bargues,M.D.,Marty,A.M.&Neafie,R.C. (2000). Hepatic. In Pathology of Trematodiases Infectious Diseases, Vol. 1 Helminthiases (Meyers, W. M., Nea®e, R. C., Marty, A. M.&Wear, D. J., eds) pp. 69±92. 8. Sahba, G. H., Arfaa, F., Farahmandian, I. & Jalali, H. (1972). Animal fascioliasis in Khuzestan, southwestern Iran. Journal of Parasitology 58, 712±16. 9. Bergeon, P. & Laurent, M. (1970). DiffeÂrences entre la morphologie testiculaire de Fasciola hepatica et Fasciola gigantica. Revue d'Elevage et de MeÂdecine VeÂterinaire des Pays Tropicaux 23, 223±7. 10. Valero, M. A., Darce, N. A., Panova, M.&Mas-Coma, S. (2001). Relationships between host species and morphometric patterns in Fasciola hepatica adults and eggs from the Northern Bolivian Altiplano hyperendemic region. Veterinary Parasitology 102, 85±100. 11. El-Shabrawi, M., El-Karaksy, H., Okasha, S. & El-Hennawy, A. (1997). Human fascioliasis: clinical features and diagnostic difficulties in Egyptian children. Journal of Tropical Pediatrics 43, 162±6. 12. Hillyer, G. V. (1999). Immunodiagnosis of human and animal fasciolosis. In Fasciolosis (Dalton, J. P., ed.) pp. 435±47. Wallingford, Oxon, UK: CAB International Publishing. 13. Bergeon, p.,Laurent ,M. Difference entre la morphologie testicularle de Fasciola hepatica et F.gigantica . Rev. Elev. Med , Vet, Pays Trop.1970 ; 23, 223-227. 14. Mass-coma.S., Bargues.M.D. Human liver fluke. A review. Res. Rev. Parasitol.1997;57,145-218. 15. Bergues,M.D. & Mas-coma,S.(1997). Phylogenetic analysis of lymnaeidsnails based on 18S rDNA sequences. Molecular Biology and Evolution 14, 569±77. 16. Bargues, M. D., Vigo, M., Horak, P., Dvorak, J., Patzner, R. A., Pointier, J. P., Jackiewicz, M., Meier- Brook, C. & Mas-Coma, S. (2001). European Lymnaeidae (Mollusca: Gastropoda), intermediate hosts of trematodiases, based on nuclear ribosomal DNA ITS-2 sequences. Infection, Genetics and Evolution 1, 85±107. 17. Soliman, M. S. (1998). Control of veterinary fascioliasis. In Infectious Diseases and Public Health. A Research and Clinical Update (Angelico, M. & Rocchi, G., eds) pp. 334±46. Philadelphia, L'Aquila: Balaban Publishers. 18. Lotfy, W. M., El-Morshedy, H. N., El-Hoda, M. A., El-Tawila, M. M., Omar, E. A . & Farag, H. F. (2002). Identification of the Egyptian species of Fasciola. Veterinary Parasitology 103, 323±32. 19. Kendal,S.B. Relationship between the species of Fasciola and their molluscan host. (1965). Adv.Parasitol,3 : 59-98. 20. Yoshimura,K. 1968.Disk Electrophoretic comparison between Schistosoma japonicumand S.mansoni adult worms. Jpn. J. parasitol. 1: 282-303. 21. Yoshimure,K. 1960a. Paragonimus electrophoretic fraction of whole-body proteinase an aid in specific identification of a species from Sado Island,Japan. Parasitol.,25 : 107-117. 22. Yoshimura,K. 1969b. Paragonimus westermani, P.ohirai, and nivazakii: electrophoretic comparison of whole-body proteins. Exp.parasitol.25:118-130. 23. Klimenko,V.V., Sazanov,A.M. The possibility of differentiation of several species of trematodes and their intermediate hosts by Disk Electrophoresis on Polyacryl- amid Gel ‘mintologii im.K.I. Skryabina. 1972; 19 : 102-105. 24. Lee, C.G., Zimmerman, G.L.,Wee, SH.Fasciola hepatica comparison fluckes from Korea and the United States by Isoelectric Focusing banding patterns of whole-body protein. Vet Parasitol 1992.May; 42 : 311-6. 25. Lee,C.G., Zimmerman,G.L.Banding patterns of Fasciola hepatica and F.gigantica (Trematoda)by Isoelectric Focusing. J.Parasitol.1993.Feb; 79: 120-3. 26. Joussan,O.,Bartoli,p.,Pawlowski,J. Use of the ITS2 rDNA for elucidation of some life cycle of Mesometridae(trematoda , Digenea) . Int j Parasitol. 1998.sep ; 28 : 1403-11. 27. Hashimoto,K.,Wanatobe,T.,Liu, C.X. ,Init, I., Blair,D.,Ohnishi,S., Agatsuma,T. Mitochondrial DNA and nuclear DNA indicate that the Japanes Fasciola species Is F.gigantica.Parasitol.Res. 1997 ; 83 : 220-5. 28. Adlard,R.D., Barker,S.C., Blair,D., Cribb,T.H. Comparison of the ITS2(rDNA) from population and species of Fasciolidae(digenea). Int J.Parasitol . 1993. May ; 23: 423-5. 29. Gasser,R.B., Chilton, N.B. Characterisation of Taeniid Cestode species by PCE-RFLP of ITS2 , rDNA.Acta Top. 1995.Mar ; 59 : 31-40. 30. Roberts, J.A., Estuningsih, E., Wiedosari, E., Spithill, T.W., 1997b. Acquisition of resistance against Fasciola gigantica by Indonesian thin tail sheep. Vet. Parasitol. 73, 215–224. 31. Wiedosari, E., Copeman, D.B., 1990. High resistance to experimental infection with Fasciola gigantica in Javanese thin-tailed sheep. Vet. Parasitol. 37, 101–111. 32. Behm, C.A., Sangster, N.C., 1999. Pathology, Pathophysiology and clinical aspects. In: Dalton, J.P. (Ed.), Fasciolosis. CABI Publishing, Oxon, UK, (Chapter 6), pp. 185–224 33. . Molecular and Morphological Characterization of Fasciola spp. Isolated from Different Host Species in a Newly Emerging Focus of Human Fascioliasis in Iran 34. .Molecular Characterization of Fasciola hepatica Isolatesby RAPD-PCR and Ribosomal ITS1 Sequencing IRANIAN RED CRESCENT MEDICALJOURNAL Volume:12 Issue: 1 Pages: 27 32 Published: JAN 2010 Author(s): Rokni, MB (Rokni, M. B.); Mirhendi, H (Mirhendi, H.)1; Behnia, M (Behnia, 35. Identification and Genetic Variation of Fasciola Species from Tabriz, North-Western IranIranian J ParasitolVol. 6, No.3, 2011, pp.52-59 A Shahbazi, M Akbarimoghaddam, S Izadi, A Ghazanchaii, N Jalali, A Bazmani 36. Genotypic and Phenotypic Analysis of Fasciola IsolatesIranian J Parasitol: Vol. 4, No.3, 2009, pp. 61-70 MB Ghavami1, P Rahimi1, *A Haniloo1, SN Mosavinasab 37. Identification and differentiation of Fasciola hepatica and Fasciola giganticusing a simple PCR-restriction enzyme methodExperimental Parasitology 124 (2010) 209–213 Mohammad Bagher Rokni a, Hossein Mirhendi a,*, Azadeh Mizani a, Mehdi Mohebali a, Mitra Sharbatkhori b,Eshrat Beigom Kia a, Hamid Abdoli c, Shahrokh Izadi c 38. Molecular Identification and Differentiation of Fasciola Isolates Using PCR- RFLP Method Based on Internal Transcribed Spacer (ITS1, 5.8S rDNA, ITS2)Iran J Parasitol. 2011 August; 6(3): 35–42. Mahami-Oskouei M, Dalimi A, Forouzandeh-Moghadam M, Rokni M. 39. A TaqMan real-time PCR-based assay for the identification of Fasciolaspp. Veterinary Parasitology 179 (2011) 266–271 Samer Alasaada,∗, Ramon C. Soriguera, Marawan Abu-Madib, Ahmed El Behairyc,Michael J. Jowersa, Pablo Diez Ba˜nosd, Ana Piriz a, Joerns Fickel e, Xing-Quan Zhuf 40. Adlard RD, Barker SC, Blair D, Cribb TH. Comparison of the second internal transcribed spacer (ribosomal DNA) from populations and species of Fasciolidae (Digenea). Int J Parasitol. 1993 May;23:423-5. 41. Chung G .Lee,Gary L.Zimmerman .Banding pattern of Fasciola hepatica , Fasciola gigantica Trematoda) by Isoelectric Focussing. The Journal of Parasitology,Vol.79,No.1(Feb.,1993) PP.120-123. 42. Keammer F,Schnieder T. Sequence heterogeneity in a repetitive DNA element of Fasciola. Int.J Parasitol.1998, Dec,28(12):1923-9. 43. Itagaki T, Tsutsumi K. Triploid form of Fasciola in Japan: genetic relationships between Fasciola hepatica and Fasciola gigantica determined by ITS-2 sequence of nuclear rDNA. 44. Jousson O, Bartoli P, Zaninetti L, Pawlowski J. Use of the ITS rDNA for elucidation of somelife-cycles of Mesometridae (Trematoda, Digenea). Int J Parasitol. 1998 Sep;28:1403-11. 45. Lotfi W.M,et al. Identification of the Egyptian species Fasciola. Veterinary Parasitology 103 (2002)323-332 46. Ramadan NI, Saber LM. Detection of genetic variabiltiy in nonhuman isolates of Fasciola 47. hepatica and Fasciola gigantica by the RAPD-PCR technique. J Egypt Soc Parasitol 2004Aug;34:679-89. 48. 46. Seraphima K.Semyenova, et al. Polymorphism of Internal Transcribe spscer 2(ITS2)sequence and genetic relationship between Fasciola hepatica and F.gigantica. Acta Parasitica ,2005 ,50(3), 340-243. 49. 47. Itagaki, , et al . Genetic Characterization of partenogenic Fasciola Sp. in Japan on the basis of sequences of Ribosomal and mitochondrial DNA.Parasitology , (Nov,.2005) ,131(5) p.679-685. 50. Lin R.Q , et al. Sequence analysis of the ITS of rDNA support the existence of the Intermediate Fasciola between F.hepatica and F.gigantica in Mainland China.V.101 N.3 , (Aug.,2007), P.813-817. 51. Smith E.R , et al. Fasciola hepatica and F.gigantica : Cloning and characterization of 70 kDa heat-shock proteins reveals variation in HSP70 gene between parasite Species recovered from sheep. Experimental Parasitology, 2007. 52. Periago M.V., et al. First phenotypic description of Fasciola hepatica/F.gigantica intermediate form from the human endemic area, of the Nile Delta, Egypt.WHO Technical Report Series (2007) , 849, 1-570 53. Alassad S., et al. Characterization of Fasciola samples from different hosts species and geographical localities in Spain sequences of Internal Transcribed Spacers of rDNA. Parasitology Research. V.101, Issue :5 , (Oct.,2007)P.1245-1250. 54. Valero M.A., De Renzin and Mas-comas. Ontogenetic Traject Tories: a new approach, in the study of parasite development, with special reference to digenea. Research and Reviews in Parasitology 1991; S1:125-138. 55. Valero,M.A. et al. Relationship between host species and morphometric patterns In Fasciola hepatica adults and eggs from Northern Bolivian Altiplano hyperendemic Region.Veterinary parasitology. (2001).102,85-100 54.اشرفی کیهان.(1384-1383)بررسی فاسیولازیس انسانی و حیوانی در تعیین خصوصیات ژنوتیپی انگل های فاسیولا و ارتباط آن ها به حلزون های ناقل در استان گیلان.پایان نامه دوره PhD رشته انگل شناسی پزشکی دانشگاه علوم پزشکی |
| نام فایل | تاریخ درج فایل | اندازه فایل | دانلود |
|---|---|---|---|
| proposal.docx | 1393/11/16 | 111824 | دانلود |
| 1.pdf | 1393/11/17 | 206566 | دانلود |
| 2.pdf | 1393/11/17 | 249674 | دانلود |
| 3.pdf | 1393/11/17 | 124706 | دانلود |
| proposal eslah shode.docx | 1393/11/28 | 111070 | دانلود |
| proposal eslah shode.pdf | 1393/11/28 | 1128834 | دانلود |
| proposal eslah shode shora pazhoheshi.docx | 1393/12/17 | 109836 | دانلود |
| proposal eslah shode shora pazhoheshi.pdf | 1393/12/17 | 1076635 | دانلود |
| proposal eslah shode shora pazhoheshi2.docx | 1393/12/27 | 111430 | دانلود |
| nahaee.docx | 1394/01/19 | 110281 | دانلود |
