چاپ صفحه |  صفحه نخست سامانه |  مجری و همکاران |  اطلاعات تفضیلی |  دانلود | علوم پزشکی زاهدان |
| کد طرح | 7215 |
| عنوان فارسی طرح | اثر مواد بیواکتیو مختلف بر تمایز دنتینوژنیک سلولهای بنیادی پاپیلای اپیکال (an invitro study) |
| عنوان لاتین طرح | Effects of different bioactive materials on Dentinogenic Differentiation of Stem Cells from Apical Papilla (an in vitro study) |
| نوع طرح | بنیادی-کاربردی |
| محل اجرای طرح | دانشکده دندانپزشکی |
| رسته مطالعاتی | مطالعه تجربی (Experimental)(مطالعه کمی) |
| دانشکده/مرکز | دانشکده دندانپزشکی زاهدان |
| زمان اجرا -روز | 365 |
| نام و نامخانوادگی | سمت در طرح | نوع همکاری | درجهتحصیلی | پست الکترونیک |
|---|---|---|---|---|
| اسحق علی صابری | استاد راهنمای اول پایان نامه دانشجویی | استاد راهنما | دکترای تخصصی | saberiendo@zaums.ac.ir |
| نرگس فرهاد ملاشاهی | استاد راهنمای دوم پایان نامه دانشجویی | استاد راهنما | دکترای تخصصی | nargesfarhadm@gmail.com |
| سحر سلطانی | دانشجو | دکترای تخصصی | sahar145@yahoo.com |
| عنوان | متن |
|---|---|
| خلاصه طرح به فارسی | اثر مواد بیواکتیو مختلف بر تمایز دنتینوژنیک سلولهای بنیادی پاپیلای اپیکال (an invitro study) |
| خلاصه طرح به لاتین | Effects of different bioactive materials on Dentinogenic Differentiation of Stem Cells from Apical Papilla (an in vitro study) |
| بيان مسئله تحقيق/اهمیت پژوهش | ادنتوبلاستها پس از تمایز از سلولهای اکتومزانشیمال پاپیلای دندانی توانایی تکثیر خود را از دست داده و پس از ترشح سریع عاج اولیه وارد فاز استراحت شده و عاج ثانویه فیزیولوژیک را در طول عمر دندان، با سرعت کمتری ترشح میکنند. ادنتوبلاستها همچنین در پاسخ به محرکهای مختلفی از قبیل محرکهای مکانیکی، شیمیایی و باکتریایی قادر به تشکیل عاج ترمیمی هستند، حتی زمانی که ادنتوبلاستها آسیب دیده اند عاج ترمیمی میتواند در پالپ دندان تشکیل شود. تحقیق پیرامون منشأ پیدایش اینگونه از عاج ترمیمی منجر به این ذهنیت شده است که سلولهای پیشساز ادنتوژنیک یا سلولهای بنیادی ممکن است در بافت پالپ وجود داشته باشند. علیرغم انجام مطالعات فراوان هنوز ناشناخته های زیادی درمورد منشاء سلولهای پیشساز/بنیادی طی ساخت عاج ثالثیه ترمیمی و مکانیسمهای مؤثر در تکثیر، تمایز و فعالیت ترشحی آنها وجود دارد. منشاء احتمالی این سلولها میتواند لایه غنی از سلول مجاور ادنتوبلاستهای اولیه، سلولهای اطراف عروق، سلولهای مزانشیمی تمایز نیافته و فیبروبلاستها باشند (1-4).
حضور سلولهای بنیادی در پالپ دندان نخستین بار توسط Gronthos و همکاران به اثبات رسید و تاکنون مطالعات زیادی در زمینه استخراج، تکثیر و تمایز این سلولها صورت گرفته است. دندانهای شیری درحال افتادن از جمله منابع سلول های بنیادی هستند که مزایای خاص خود را دارند. اما دندان عقل نهفته رایجترین منبع دندانی برای استخراج سلولهای بنیادی است. مطالعات صورت گرفته روی سلولهای بنیادی پالپ دندان نشاندهنده توانایی تمایز این سلولها به چندین رده مختلف سلولی ازجمله: استئوژنیک، کندروژنیک، آدیپوژنیک، میوژنیک، نوروژنیک و البته ادنتوژنیک میباشد. پیدایش و پیشرفت مهندسی بافت، فرصتی جهت بازسازی و جایگزینی دندان های از دست رفته ایجاد نموده است. اساس مهندسی بافت، توانایی تمایز سلولهای بنیادی به ردههای مختلف سلولی است (5-7). دندانپزشکی نوین شاهد پیشرفت های سریع در ساخت مواد جدید بوده که رشته اندودنتیکس نیز از این امر مستثنی نمی باشد.از سوی دیگراین پیشرفت ها همگام با مطرح شدن درمان های رژنراتیو با استفاده از سلول های بنیادی می باشند.مواد مورد استفاده در درمان های رژنراتیو در حضور سلول های بنیادی باید قادر به تحریک ساخت نسج سخت بافتی بوده و روی دنتینوژنز سلول های بنیادی پالپ دندان اثر مثبت داشته باشد (8). در دهه اخیر در مطالعات مختلف in vivo وex vivo اثر MTA رادر دنتینوژنز نشان داده اند. آنچه که در میان باید بسیار مورد توجه قرار بگیرد Biocompatibility مواد مورد استفاده در این درمان ها می باشد که MTA این ویژگی نیز در حد عالی دارا می باشد (9, 10). MTA ماده ایست بیواکتیو ، باعثConduction, Induction بافت سخت گردیده .موتاژنیک و سایتوتوکسیک نمی باشد و پاسخ التهابی پایینی دارد(11). نشان داده شده است ، ژن / پروتئین مارکرهای ادنتو/استئوبلاستیک سلولهای درمان شده با MTA بطور مشخصی افزایش یافته است و همچنین phosphorylated Jun N-Terminal Kinase (P - JNK) و Phosphorylated Extracellular Regulated Protein Kinase (P-ERK)در سلولهای درمان شده باMTA با گذشت زمان بطور معنی داری افزایش می یابد ،در حالیکه مهار JNK و ERK بطور معنی داری دیفرانسیاسیون ادنتو/استئوبلاستیک و میزان ALP را کاهش داد (12). درمطالعه ای که توسط Robert schneider و همکاران در سال 2014 انجام شدmigration و proliferation سلول های بنیادی پاپیلای اپیکال تحت تاثیر WMTA مورد بررسی قرار گرفت که در آن نشان داده شد که WMTA موجب migration و proliferation زود هنگام سلول های بنیادی پاپیلای اپیکال انسان می شود(13). اخیرا یک سمان جدید CEM* یا** NEC شامل ترکیبات مختلفی از کلسیم (به طور مثال اکسید کلسیم، فسفات کلسیم، کربنات کلسیم،سیلیکات کلسیم، سولفات کلسیم، هیدروکسید کلسیم و کلرید کلسیم ) معرفی شده است.استفاده کلینیکی از این ماده شبیه MTA می باشد و می تواند در محیط آبی (aqueous) سخت گردد.کار کردن با این ماده آسان است و وقتی از آن به عنوان ماده پر کننده انتهای ریشه استفاده می شود سیل مناسب ایجاد می نماید. CEM توانایی تولید هیدروکسی آپاتیت توسط یونهای با منشا داخلی خود را دارد(14, 15). CEM از سمیت قابل قبولی برخوردار است و می تواند پروسه ی مینرالیزاسیون را القا کند. در مطالعه ای که Ashraf و همکاران در سال 2014 انجام دادند نشان دادند که CEM باعث افزایش بیان ژن استئوکالسین می شود. که این ژن با مینرالیزاسیون سلول های بنیادی در ارتباط می باشد (16). سمان پورتلند از زیست سازگاری خوبی برخوردار است و در مطالعه ای که Kyungو همکارانش در سال 2007 انجام دادند به این نتیجه رسیدند که سمان پورتلند در in vitro باعث بیان ژن های مرتبط با مینرالیزاسیون در سلول های پالپ انسانی می شود(17). گرافت استخوانی اغلب بر پایه ی ساخت مصنوعی استخوان با استفاده از هیدروکسی آپاتیت می باشد یکی از این ترکیبات که در دندانپزشکی هم استفاده می شود، bone Cancellous می باشد که هیدروکسی آپاتیت متخلخل می باشد. مطالعات زیادی نشان داده اند که این گرافت باعث افزایش پرولیفراسیون پالپ دندان و همچنین تمایز استئوژنز و دنتینوژنز سلول های بنیادی می شود(18) (19) (20). . با وجود انجام مطالعاتی در زمینه اثرMTA ،CEM cement و سمان پورتلند وCancellous بر دنتینوژنز سلول های بنیادی پاپیلای آپیکال بطور جداگانه، مطالعات کمی به مقایسه چهار ماده با هم پرداخته بودند. لذا بر آن شدیم که در این مطالعه به بررسی اثر 4 ماده MTA ،CEM cement و Cancellousسمان پورتلند بر دنتینوژنز سلول های بنیادی پاپیلای اپیکال انسانی با اندازه گیری میزان بیان مارکرهای دنتینوژنز (ژن های دنتین سیالوپروتئین و دنتین فسفوسیالوپروتئین و.....) بپردازیم. |
| سوالات و / یا فرضیات پژوهش | /- اثر MTA بر فعالیت دنتینوژنیک سلولهای SCAPs در زمانهای مختلف چگونه است؟ 2- اثر CEM بر فعالیت دنتینوژنیک سلولهای SCAPs در زمانهای مختلف چگونه است؟ 3- اثر سمان پرتلند بر فعالیت دنتینوژنیک سلولهای SCAPs در زمانهای مختلف چگونه است؟ 4- اثر Cancellous بر فعالیت دنتینوژنیک سلولهای SCAPs در زمانهای مختلف چگونه است؟ 5-اثر متریال های مختلف بر فعالیت دنتینوژنتیک سلول های SCAPs در زمان های مختلف متفاوت می باشد. |
| هدف کلی طرح | مقایسه اثر مواد بیواکتیو مختلف بر تمایز دنتینوژنیک سلولهای بنیادی پاپیلای اپیکال(an invitro study) |
| اهداف اختصاصی | -تعیین اثر MTA بر فعالیت دنتینوژنز سلولهای SCAPs در زمانهای مختلف 2-تعیین اثر CEM بر فعالیت دنتینوژنز سلولهای SCAPs در زمانهای مختلف 3- تعیین اثر سمان پرتلند بر فعالیت دنتینوژنز سلولهای SCAPs در زمانهای مختلف 4 -تعیین اثر Cancellous بر فعالیت دنتینوژنز سلولهای SCAPs در زمانهای مختلف 5-مقایسه اثر متریال های مختلف بر فعالیت دنتینوژنتیک سلول های SCAPs در زمان های مختلف |
| سازمانها، مراکز و موسسات و سایر بهره برداران بالقوه دستاوردهای طرح | دانشجویان دوره عمومی،دندانپزشکان و دستیاران دوره های تخصصی |
| تعریف واژه های تخصصی | (21)Portland cement: تشکیل شده از کلسیم اکساید،کاسیم فسفات،سلیکا و الومینیوم (22)(mineral trioxide aggregate)MTA: مخلوطی از سمان پرتلند نوع 1 خالص شده که حاوی بیسموت اکساید جهت رادیواپسیتی است و جهت وایتال پالپ تراپی استفاده میشود. (23)calcium-enriched mixture :CEM cement پودر سفید رنگ تشکیل شده از ذرات ابدوست که در حضور مایعات با پایه اب در کمتر از یک ساعت سخت میشود و هیدروکسی اپاتیت ایجاد میکند و قادر به ایجاد سیل بیولوژیک و فیزیکی میباشد. (24)Cancellous bone: یک نوع تجاری از گرافت استخوانی از هیدروکسی اپاتیت متخلخل |
| نوع مطالعه | بنیادی- کاربردی |
| جامعه مورد مطالعه(معرفی مشارکت کنندگان)/ محیط پژوهش(معیارهای ورود و خروج ذکر شوند) | سلول های بنیادی استخراج شده ازدندان های مو لر سوم با ریشه نابالغ معیار ورود: ۱. دندان اندیکاسیون کشیدن داشته باشد. ۲. فاقد پوسیدگی باشد. ۳. سن بیمار ۱۶ـ۲۴ سال باشد. 4.بیمارسابقه بیماری سیستمیک نداشته باشد. |
| حجم نمونه و روش محاسبه آن | با توجه به اینکه مداخله بر روی نمونه های یکسان ودر شرایط آزمایشگاهی یکسان انجام می شودبااستفاده از مقالات مشابه |
| روش نمونه گیری(نحوه تخصیص تصادفی و همسانسازی در صورت لزوم ذکر شود) | تصادفی آسان و در دسترس |
| روش و ابزار جمع آوري داده ها / صحت و استحکام داده ها (پرسشنامه یا فرم اطلاعاتی ضمیمه شود) | در ضمیمه شماره 2 اورده شده است. |
| روش اجرای طرح(با جزئیات بطور کامل شرح داده شود) | پس از شرح مطابعه برای بیمارنیازمند به خارج کردن دندان مولر سوم نابالغ مندیبل و کسب رضایت اگاهانه
سلول های بنیادی از دو دندان مولر سوم نابالغ فک پایین جدا خواهد شد. دندان ها بلافاصله بعد از خارج کردن با محلول استریل سالین فسفاته (PBS) شسته شده و در همین محلول استریل نگهداری می شوند. سپس سلول های بنیادی با استفاده از هضم آنزیمی از اپیکال پاپیلای دندان جدا شده و در سوسپانسیون پلی D لیزین (که یک محیط کشت می باشد) قرار می گیرند. بعد از مشاهدۀ کلونی های سلولی شبه فیبروبلاست، جهت بدست آوردن سلول های بیشتر، سلول ها در محیط کشت حاوی تریپسین دوباره کشت می شوند. این عمل بین 5 تا 8 بار جهت بدست آوردن سلول های بیشتر تکرار می شود.
MTA ،CEM و Cancellousبراساس توصیه کارخانه سازنده با محلولهای خودشان ترکیب و Portland cement نیز با نرمال سالین تا بدست آمدن قوام خمیری مخلوط می گردد . مواد بمدت 24 ساعت خشک و سپس جهت تهیه پودر آسیاب می شوند .پودر با فیلتر 45 میکرومتر صاف شده و به محیط MEM –α با غلظت 200 میلی گرم در میلی لیتر اضافه می نماییم و بمدت یک هفته در 37 درجه سانتی گراد انکوبه تا مواد بیواکتیو بدست اید . شیرابه بدست امده با صافی 5/2 میکرومتر فیلترو تا قبل از استفاده با حجم مشابه از MEM –α مخلوط می نماییم تا condition medium مواد فوق بدست اید ،حال سلولها با این medium که بطور روزانه تهیه میگردد درمان می شوند. سپس سلول های بنیادی در چاهک های محیط کشت 24 خانه ای قرار داده شده و بطور تصادفی به گروههای 10 تایی تقسیم شده و تحت تاثیر مواد مورد مطالعه قرار می-گیرند. سپس cell proliferation assay ،Flow cytometry، وReal-Time RT PCR انجام میگردد. بررسی چرخهی سلولی و مرگ سلولی با روش فلوسایتومتری مواد و ابزار لازم - محلول پروپیدیوم یدید (PI) با غلظت mg/ml1؛ - ریبو نوکلئاز آ؛ - تریتون X100؛ - اتانول 70% سرد؛ - محلول نمکی بافر فسفات یا همان PBS؛ - دستگاه فلوسایتومتر (BectonDickinson). - روش تهیة محلول ذخیرة پروپیدیوم یدید برای تهیة این محلول، پودر پروپیدیوم یدید در بافر فسفات با غلظت mg/ml 1 حل میشود. این محلول در ظرف تیره و دمای 4 درجة سانتیگراد برای چند ماه پایدار است. روش تهیة کوکتل پایانی پروپیدیوم یدید در تهیة این کوکتل، یک میکرولیتر تریتون X100، 20 میکرولیتر آنزیم ریبونوکلئاز و 20 میکرولیتر از محلول ذخیرة پروپیدیوم یدید باغلظت یک میلیگرم بر میلیلیتر مورد نیاز میباشد. این مواد در بافر فسفات حل شده و به حجم یک میلیلیتر میرسد. آمادهسازی سلولها پس از تیمار سلولها که پیش از این به آن اشاره شده است، سلولها باید برای انجام فلوسایتومتری آماده شوند. مراحل آمادهسازی سلولها بصورت زیر میباشد: - خالی کردن محیط سلولها در یک فالکون ml 15 پاکیزه؛ - شستشوی سلولها با بافر فسفات و افزودن آن به فالکون حاوی محیط؛ - تریپسینه کردن سلولها برای جدا شدن آنها از فلاسک کشت؛ - افزودن سوسپانسیون سلولی به فالکون؛ - سانتریفوژ به مدت 6 دقیقه با دور g200؛ - خالی کردن مایع رویی و اضافه کردن 5/0 میلیلیتر بافر فسفات؛ - سانتریفوژ به مدت 6 دقیقه با دور g200 و دور ریختن مایع رویی؛ - افزودن ml 5/0 بافر فسفات و ml 5/4 اتانول سرد به نمونه همراه با پیپتاژ شدید. با انجام این مراحل، سلولها فیکس شده و میتوان آنها را تا دو ماه در دمای 4 درجة سانتیگراد نگهداری کرد؛ البته بهترین پاسخ تا 24 ساعت پس از فیکس کردن میباشد. رنگآمیزی نهایی سلولها با محلول پروپیدیوم یدید - سانتریفوژ سلولها در g200 به مدت 6 دقیقه؛ - خالی کردن مایع رویی و افزودن ml 5/0 بافر فسفات؛ - سانتریفوژ سلولها در g200 به مدت 6 دقیقه؛ - خالی کردن مایع رویی و حل کردن تهنشین در ml 1 از کوکتل نهایی PI، همراه با پیپتاژ کامل. آنالیز سلولها با روش فلوسایتومتری همانگونه که پیش از این گفته شد، در سلولهای آپپتوتیک غشای سلولی دستنخورده باقی میماند که این امر باعث میشود DNA سلول که از ناحیة نوکلئوزومها برش خورده نتواند از سلول خارج شود. همچنین در این شرایط رنگهای اختصاصی DNA نیز نمیتوانند وارد سلول شوند. با استفاده از تریتونX100 در محلول آمادهسازی سلول، غشای سلولهای آپپتوتیک نفوذپذیر شده و درنتیجه، مولکولهای DNA با وزن پایین از آن عبور میکنند و PI نیز وارد سلول میشود.برای بررسی میزان مرگ سلولی و نوع آن از روش فلوسایتومتری و رنگ آمیزی با پروپیدیوم یدید و ترکیب anexxin νاستفاده می شد. ترکیب anexxin νتمایل بالایی برای فسفاتیدیلسرین موجود در سطح داخلی غشاء دارد ولی در سلولهای زنده این ترکیب توانایی ورود به سلول را نداشته و وارد سلول نمیشود. در سلولهایی که دچار آپاپتوز شده اند فسفاتیدیلسرین موجود در سطح داخلی غشا در سطح بیرونی غشا قرار گرفته و anexxin νمیتواند به آن متصل شود. ترکیب پروپیدیوم یدید بهDNA متصل میشود و در سلولهایی که دچار نکروز شده اند وارد سلول شده و به DNAمتصل میشود. سلولها در مرحله های پایانی آپاپتوز نفوذ پذیر شده و ترکیب annexin νمیتواند وارد سلول شود. در نتیجه در رنگ آمیزی با این دو ترکیب سه حالت وجود دارد که در حالت اول سلول در مراحل اولیه ی آپاپتوز قرار داشته در نتیجهannexin ν به فسفاتیدیلسرین سطحی متصل میشود ولی پروپیدیوم یدید توانایی ورود به سلول را ندارد. در نکروز چون غشای سلولی دچار آسیب شده پروپیدیوم یدید وارد سلول شده و به DNAمتصل میشود. در مراحل نهایی آپاپتوز هم annexin ν و هم وارد سلول شده و برای هر دو ترکیب جواب مثبت است.برای آماده سازی سلولها بعد از تیمار کردن سلولها را تریپسینه نموده سپس آنها را در دور g1200 ساتریفیوژ نموده و دوباره این کار را با ml5 بافر فسفات انجام داده بعد از سانتریفیوژ مجدد ml1 از بافر مخصوص کیت اضافه نموده و بعد از پیپتاژ شدید µl5 از annexin νاضافه نموده و 15 دقیقه در محیط تاریک انکوبه میشود. در آخر هم µl4 محلول پروپیدیوم یدید اضافه کرده و با دستگاه فلوسایتومتری آنالیز میگردد. منحنی هیستوگرام حاصل از دستگاه فلوسایتومتر از آنجاییکه این منحنی در بررسی چرخة سلولی نیز مورد استفاده قرار میگیرد، قلههای بعد از آپاپتوز به ترتیب نشاندهندة فازهای G0/G1,S,G2/M چرخه سلولی می باشد. 2-6-4. روش کار با دستگاه فلوسایتومتر این دستگاه با اندازهگیری نور فلورسانسی که از هر سلول پراکنده میشود و نیز با اندازهگیری محتوای DNA، جمعیتهای مختلف سلولی را از هم تشخیص میدهد. روش کار نیز به این صورت است که سلولهای رنگآمیزی شده در کووتهای ویژهای ریخته شده و در جای مخصوص خود در دستگاه قرار داده میشوند. دستگاه نیز پس از ارزیابی سلولها، دادههای خام اولیه را بدست میآورد. برای پردازش این دادهها، نرمافزارهای ویژهای از جمله نرمافزار WIN-MDI مورد استفاده قرار میگیرد. این نرمافزار، دادههای خام را به صورت منحنیهای Histogram، DotPlot، DensityPlot و Contour نمایش میدهد که در بررسی آپاپتوز و چرخة سلولی از Histogram استفاده میشود. جدا کردن سلولهای منفرد از سایر سلولها در زمان انجام مراحل آمادهسازی، احتمال خرد شدن سلولها و نیز چسبیدن سلولهای خرد شده به هم وجود دارد. از طرف دیگر، ممکن است بعضی سلولها با پیپتاژ از هم جدا نشده و همچنان به هم چسبیده باقی بمانند. این سلولها را که موجب خطا در نتایج بهدست آمده میشوند، نمیتوان حین کار از سلولهای منفرد جدا کرد. به همین دلیل پیش از تفسیر هیستوگرام باید آنها را از سلولهای منفرد تفکیک کرد . جدا کردن سلولهای منفرد از سایر سلولها بررسی های مولکولی در سطح بیان ژن جهت بررسی های مولکولی در سطح بیان ژن، ابتدا استخراج RNAاز سلول ها، طبق پروتکل شرکت سازنده (سیناژن، ایران) و با استفاده از RNX plus انجام می شود. پس از استخراج RNA با خلوص و غلظت بالا از تمامی نمونه های مورد مطالعه، مراحل سنتز cDNA طبق پروتکل شرکت سازنده (Fermentas, USA) انجام می شود. و سپس cDNA سنتز شده جهت انجام واکنش رونویسی معکوس مورد استفاده قرار می گیرد. ابتدا کلیه پرایمرهای طراحی شده مربوط به تمامی ژن های مورد بررسی قرار می گیرد و سپس بررسی بیان ژن ها با استفاده از روش کمی q-RT PCR انجام می گیرد. بررسی کمی بیان ژن با استفاده ازتکنیک آماده سازی پرایمرها پرایمرها به صورت لیوفیلیزه در دسترس قرار می گیرد. برای آماده سازی پرایمرها حجم مشخص آب مقطر استریل به هر تیوب حاوی پرایمر لیوفیلیزه (بر اساس اطلاعات مربوط به هر پرایمر) اضافه شده و این محلول به عنوان استوک در 20- درجه سانتی گراد قرار داده می شود. به این ترتیب جهت انجام کار برای هر بار تست مواد زیر به نسبت های گفته شده در داخل ظروف 48 خانه ریخته و با یکدیگر ترکیب می شود. این مواد شامل : Master Mix+ SYBR Green 5/12 میکرولیتر (ABI, USA) Primer Forward 10 پیکومولار (8/0 میکرولیتر) Primer Reverse 10 پیکومولار (8/0 میکرولیتر) cDNA 1 میکرولیتر DEPC water 9/9 نمونه تا زمان انتقال به دستگاه بر روی یخ نگه داشته می شوند.از تکنیک RT-qPCRجهت تائید بیان ژن های مورد مطالعه به صورت کمی استفاده می شوند. برای این منظور ابتدا با استفاده از محلول RNX-PlusTM (Cinnagen) RNA، کل سلول ها (cell RNX 1ml/106) طبق پروتکل سیناژن استخراج شده و جهت اطمینان از آلودگی با DNA ژنومیک، در معرض DNase I(Fermentase) قرار می گیرد. سپس کیفیت RNA های استخراج شده با دستگاه اسپکتروفوتومتری(DPI-1, Kiagen) مورد ارزیابی قرار می گیرد. جهت تهیه cDNA تک رشته ای از پرایمر OligodT(MWG-Biotech, Germany) و آنزیم نسخه برداری معکوس((Fermentase) و بر اساس پروتکل مربوطه انجام می شود. هر واکنش PCR با استفاده از PCR master mix (Applied Biosystems) و SYBR Green در دستگاه ABI Step One (Applied Biosystems, Sequence Detection Systems.Foster City, CA)طبق پروتکل شرکت سازنده انجام گرفت. توالی پرایمرهای پیش رو و معکوس اختصاصی برای ژن های βactin به عنوان ژن مرجع و توالی پرایمرهای مورد استفاده در این مطالعه در مقاله مربوطه ارائه شده است. 40 سیکل برای هر چرخه Real-time PCR در نظر گرفته شد و دماهای هر سیکل شامل 94 درجه سانتی گراد برای 20 ثانیه، 60-58 درجه سانتی گراد برای 30 ثانیه و 72 درجه سانتی گراد برای 30 ثانیه تنظیم گردید. نمودار Melting جهت بررسی صحت واکنش های PCR انجام شده به صورت اختصاصی برای هر ژن و در هر بار از واکنش به همراه نمودار کنترل منفی جهت بررسی وجود آلودگی در هر واکنش مورد ارزیابی قرار می گیرد. نسبت بیان تمامی ژن های مورد بررسی در این مطالعه، با روش مقایسه ای چرخه آستانه (Threshold Cycle: Ct) طبق روش]Yuan et al., 2006 135[مورد ارزیابی قرار می گیرد. با استفاده از قرار دادن داده ها در فرمول های ΔΔCt و 2–ΔΔCt میزان بیان ژن هدف با ژن مرجع نرمالیز شده و در هر مرحله از کار، بیان ژن مرحله قبل به عنوان کالیبراتور در مظر گرفته میشود. تحلیل آماری داده ها با آزمون آنالیز واریانس یک طرفه و به دنبال آن آزمون Tukey جهت بررسی و معنی داری در سطح P≤0.05 در نظر گرفته می شود. ژن های مورد بررسی شامل : دنتین فسفو سیالو پروتئین و وBSPوOCPو OCNو ALP وTNFα وIL1α و IL1β و ILGamaوRUNX2 می باشد. |
| روش تجزیه، تحليل و توصیف دادهها (نمونهاي از جدول توخالي ضميمه شود و روش هاي آماري مورد استفاده به طور كامل توضيح داده شود)(کیفی و کمی) | means _+SD
مستقل one way , χ2 , t- test به کمک نرم افزار SPSS ، 12 تجزیه تحلیل اماری می شوند. میزان سلول های زنده باقیمانده به تفکیک گروه و زمان زمان گروه ۲۴ ساعت ۴۸ ساعت ۱۶۸ساعت مقدار p برای آزمون MTA cancellous Cem cement Portland cement مقدار P برای آزمون |
| ملاحظات اخلاقی | فرم رضایت آگاهانه در ضمیمه شماره 1 آورده شده کدهای 1،2،3،4،5،11،13،14،15،16،17،27،28،29،30 از راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش پزشکی دارای آزمودنی انسانی در جمهوری اسلامی ایران وکدهای10،11،12،13،15 از راهنمای اخلاقی پژوهش با سلولهای بنیادی در جمهوری اسلامی ایران وکدهای 1،2،3،4،6از راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی در جمهوری اسلامی ایران رعایت میشود. |
| محدودیتهای اجرائی طرح و پیش بینی جهت حل آنها | جدا سازی سلول های بنیادی از اطراف فولیکول دندانی بسیار مشکل می باشد. از طرفی احتمال مرگ سلول ها و آلودگی میکروبی در طی مراحل کشت سلولی بسیار زیاد می باشد.بدین منظور از افراد متخصص و با تجربه که سابقه انجام این مراحل را دارند استفاده خواهد شد.
.عدم امکان کشت سلول در شهر زاهدان و نیاز به انجام ان در تهران |
| کلمات کلیدی | Apical papilla, cell differentiation, stem cell پاپیلای اپیکال،تمایز سلولی،سلول بنیادی |
| فهرست منابع و مراجع | 1. Baume LJ. The biology of pulp and dentine. A historic, terminologic-taxonomic, histologic-biochemical, embryonic and clinical survey. Monographs in oral science. 1980;8:1. 2. Couble M-L, Farges J-C, Bleicher F, Perrat-Mabillon B, Boudeulle M, Magloire H. Odontoblast differentiation of human dental pulp cells in explant cultures. Calcified Tissue International. 2000;66(2):129-38. 3. Cox C, White KC, Ramus DL, Farmer JB, Snuggs HM. Reparative dentin: factors affecting its deposition. Quintessence international (Berlin, Germany: 1985). 1992;23(4):257-70. 4. Smith A, Tobias R, Cassidy N, Plant C, Browne R, Begue-Kirn C, et al. Odontoblast stimulation in ferrets by dentine matrix components. Archives of oral biology. 1994;39(1):13-22. 5. Gronthos S, Brahim J, Li W, Fisher L, Cherman N, Boyde A, et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. Journal of dental research. 2002;81(8):531-5. 6. Herdegen T, Kovary K, Leah J, Bravo R. Specific temporal and spatial distribution of JUN, FOS, and KROX‐24 proteins in spinal neurons following noxious transsynaptic stimulation. Journal of Comparative Neurology. 1991;313(1):178-91. 7. Téclès O, Laurent P, Zygouritsas S, Burger A-S, Camps J, Dejou J, et al. Activation of human dental pulp progenitor/stem cells in response to odontoblast injury. Archives of oral biology. 2005;50(2):103-8. 8. Min K-S, Yang S-H, Kim E-C. The combined effect of mineral trioxide aggregate and enamel matrix derivative on odontoblastic differentiation in human dental pulp cells. Journal of endodontics. 2009;35(6):847-51. 9. Parirokh M, Torabinejad M. Mineral trioxide aggregate: a comprehensive literature review—part III: clinical applications, drawbacks, and mechanism of action. Journal of endodontics. 2010;36(3):400-13. 10. Torabinejad M, Parirokh M. Mineral trioxide aggregate: a comprehensive literature review—part II: leakage and biocompatibility investigations. Journal of endodontics. 2010;36(2):190-202. 11. Min K-S, Park H-J, Lee S-K, Park S-H, Hong C-U, Kim H-W, et al. Effect of mineral trioxide aggregate on dentin bridge formation and expression of dentin sialoprotein and heme oxygenase-1 in human dental pulp. Journal of endodontics. 2008;34(6):666-70. 12. Wang Y, Yan M, Fan Z, Ma L, Yu Y, Yu J. Mineral trioxide aggregate enhances the odonto/osteogenic capacity of stem cells from inflammatory dental pulps via NF‐κB pathway. Oral diseases. 2013. 13. Schneider R, Rex Holland G, Chiego Jr D, Hu JC, Nör JE, Botero TM. White Mineral Trioxide Aggregate Induces Migration and Proliferation of Stem Cells from the Apical Papilla. Journal of Endodontics. 2014. 14. Asgary S, Eghbal MJ, Parirokh M, Ghoddusi J. Effect of two storage solutions on surface topography of two root‐end fillings. Australian Endodontic Journal. 2009;35(3):147-52. 15. Asgary S, Shahabi S, Jafarzadeh T, Amini S, Kheirieh S. The properties of a new endodontic material. Journal of endodontics. 2008;34(8):990-3. 16. Hengameh A, Reyhaneh D, Nima MM, Hamed H. Effects of two bioactive materials on survival and osteoblastic differentiation of human mesenchymal stem cells. Journal of conservative dentistry: JCD. 2014;17(4):349. 17. Min K-S, Kim H-I, Park H-J, Pi S-H, Hong C-U, Kim E-C. Human pulp cells response to Portland cement in vitro. Journal of Endodontics. 2007;33(2):163-6. 18. Nawi NSBM, Ariffin Z, Alam MK, Noor SNFM, Hassan A. The Assessment of Proliferation Rate of Dental Pulp Stem Cells and Stem Cell from Human Exfoliated Deciduous Teeth by Using Two Different Scaffold. International Medical Journal. 2013;20(5):593-6. 19. Liu H-C, Wang D-S, Su F, Wu X, Shi Z-P, Lv Y, et al. Reconstruction of alveolar bone defects using bone morphogenetic protein 2 mediated rabbit dental pulp stem cells seeded on nano-hydroxyapatite/collagen/poly (L-lactide). Tissue Engineering Part A. 2011;17(19-20):2417-33. 20. Shi S, Bartold P, Miura M, Seo B-M, Robey PG, Gronthos S. The efficacy of mesenchymal stem cells to regenerate and repair dental structures. Orthodontics & craniofacial research. 2005;8(3):191-9. 21. Ashraf M, Khan AN, Ali Q, Mirza J, Goyal A, Anwar A. Physico-chemical, morphological and thermal analysis for the combined pozzolanic activities of minerals additives. Construction and Building Materials. 2009;23(6):2207-13. 22. Lee DSDJ, Bogen G. Multifaceted use of ProRootTM MTA root canal repair material. Pediatric dentistry. 2001;23(4):326-30. 23. Samiee M, Eghbal MJ, Parirokh M, Abbas FM, Asgary S. Repair of furcal perforation using a new endodontic cement. Clinical oral investigations. 2010;14(6):653-8. 24. Greenspan DC. Physical And Chemical Properties Of Commercially Available Mineralized Bone Allograft. Zimmer Dental. 2012. |
| معرفی پژوهش/ اهداف پژوهش (عین عبارت هدف پروپوزال را کپی نکنید. بلکه با جملاتی که برای مردم قابل فهم باشد (برای سواد حدود پنجم ابتدایی )هدف را برای شرکت کنندگان توضیح دهید.) در تمام این متن در صورتیکه شرکت کننده کودک یا فرد فاقد ظرفیت تصمیم گیری است باید مواردیکه منظور از "من"، فرد شرکت کننده بوده است به "کودک" یا "فرد تحت سرپرستی من" اصلاح شود و مواردیکه منظور از "من"، رضایت دهنده است به من به عنوان "ولی" یا "قیم قانونی" اصلاح شود. | |
| خون گیری (آیا طرح شما نیاز به خونگیری دارد یا خیر) | |
| نحوه همکاری/ مزایا ی طرح (در این بخش برای شرکت کنندگان به زبان ساده توضیح دهید که: چه مداخله ای بر روی آنها صورت میگیرد. چه اقدامات پاراکلینیکی بر روی آنها انجام میشود. چه نمونه ای و با چه حجمی از آنها میگیرید در این مدت چند نوبت مراجعه باید داشته باشند و به چه فواصلی چه اقداماتی را در پیگیری آنها انجام میدهید. (حتی میتوانید سود بالقوه ای که شرکت کنندگان میتوانند از شرکت در این پژوهش ببرند بنویسید. این سود میتواند شرح احتمال درمان یا تشخیص بهتر بیماریشان، دریافت خدمات سلامت رایگان و یا پرداخت مشوق مالی در ازای جبران همکاریشان باشد) | |
| عوارض جانبی (منظور عوارض و میزان احتمال بروز آنها در این مطالعه است) | |
| جبران عوارض احتمالی (برای آنکه شرکت کننده بتواند ارزیابی مناسبی از سود و زیان شرکت در پژوهش شما داشته باشد لازم است بتواند سود و زیان مداخلات معمول و مداخلات این پژوهش را مقایسه کند. به عنوان مثال میزان موفقیت و میزان عوارض هریک را مقایسه کند.) - او باید بداند كه اگر در حين و بعد از انجام پژوهش هم هر مشكلي اعم از جسمي و روحي به علت شرکت در اين پژوهش برایش پيش آمد درمان عوارض، و هزينههاي آن و غرامت مربوطه بر عهده مجري خواهد بود. | |
| هزینه های مربوط به انجام طرح تحقیقاتی (تمام مداخلات پژوهشی باید برای بیمار رایگان باشد و بیمار بداند شامل چه مواردی هستند. ) | |
| روش های جایگزین در صورت عدم تمایل به شرکت در مطالعه چه روش های درمانی برای بیمار ارائه خواهد شد | |
| محرمانه بودن بیمار باید بداندکه دست اندر كاران اين پژوهش، كليه اطلاعات مربوط به او را نزد خود به صورت محرمانه نگهداشته و فقط اجازه دارند نتايج كلي و گروهي اين پژوهش را بدون ذکر نام و مشخصات بیمار منتشر كنند. و كميته اخلاق در پژوهش با هدف نظارت بر رعایت حقوق وی ميتواند به اطلاعات ایشان دسترسي داشته باشد. | |
| پاسخگویی به پرسش ها در این بخش نام و اطلاعات دسترسی فردی از عوامل پژوهش را که بتواند اطلاعات صحیح و کافی در اختیار شرکت کنندگان قرار دهند و در مورد عوارض و نگرانیها راهنمایی لازم را ارائه دهند ذکر شود | |
| حق نپذیرفتن یا انصراف بیمار باید بداند که شرکت اودر اين پژوهش کاملاً داوطلبانه است و مجبور به شرکت در اين پژوهش نيست و در صورت عدم شرکت از مراقبتهاي معمول تشخيصي و درماني محروم نخواهد شد او باید بداند كه حتي پس از موافقت با شركت در پژوهش ميتواند هر وقت كه بخواهد، پس از اطلاع به مجري، از پژوهش خارج شود و خروج اواز پژوهش باعث محرومیت از دریافت خدمات درمانی معمول برای اونخواهد شد. | |
| رضایت او باید بداند که اگر اشکال يا اعتراضي نسبت به دست اندركاران يا روند پژوهش دارد مي تواند با كميته اخلاق در پژوهش دانشگاه تماس گرفته و مشکل خود را به صورت شفاهي يا كتبي مطرح نمايد. در انتهای فرم قید گردد : اينجانب موارد فوقالذکر را خواندم و فهميدم و بر اساس آن رضايت آگاهانه خود را براي شركت در اين پژوهش اعلام ميکنم. اينجانب ……………… خود را ملزم به اجراي تعهدات مربوط به مجري در مفاد فوق دانسته و متعهد ميگردم در تأمين حقوق و ايمني شركت كننده در اين پژوهش تلاش نمايم | |
| پرسشنامه یا فرم اطلاعاتی |
| نام فایل | تاریخ درج فایل | اندازه فایل | دانلود |
|---|---|---|---|
| PEIVAST-1.docx | 1393/12/14 | 15563 | دانلود |
| PEIVAST 2 JADID.docx | 1393/12/15 | 12371 | دانلود |
| peivast 3 jadid.docx | 1393/12/15 | 12777 | دانلود |
| proposal sahar soltani.doc | 1393/12/15 | 427008 | دانلود |
| proposal sahar soltani.doc | 1394/02/14 | 438272 | دانلود |
| proposal sahar soltani eslah shode.doc | 1394/02/14 | 438272 | دانلود |
| proposal eslah nahaee bad az defe.doc | 1394/04/23 | 452096 | دانلود |
| proposal eslah nahaee bad az defe 2.doc | 1394/08/23 | 432640 | دانلود |
| dr soltani.doc | 1394/08/23 | 465408 | دانلود |
| komite akhlagh.doc | 1394/08/23 | 457728 | دانلود |
