بررسی بیان و هیپرمتیلاسیون ناحیه پروموتور ژن های PTPN14, MST2, SAV1 در بزاق بعنوان بیومارکر برای تشخیص زودهنگام سرطان سلول سنگفرشی دها ن

Analysis of expression and promoter hypermethylation PTPN14, MST2, SAV1genes in saliva as biomarker for early diagnosis of oral squamous cell carcinoma


چاپ صفحه 		پژوهان
صفحه نخست سامانه		 مجری و همکاران
مجری و همکاران		 اطلاعات تفضیلی
اطلاعات تفضیلی		 دانلود
دانلود 		علوم پزشکی زاهدان
علوم پزشکی زاهدان

مجریان: محمدایوب ریگی لادز

کلمات کلیدی:

اطلاعات کلی طرح
hide/show

کد طرح 7231
عنوان فارسی طرح بررسی بیان و هیپرمتیلاسیون ناحیه پروموتور ژن های PTPN14, MST2, SAV1 در بزاق بعنوان بیومارکر برای تشخیص زودهنگام سرطان سلول سنگفرشی دها ن
عنوان لاتین طرح Analysis of expression and promoter hypermethylation PTPN14, MST2, SAV1genes in saliva as biomarker for early diagnosis of oral squamous cell carcinoma
نوع طرح
محل اجرای طرح
رسته مطالعاتی بنیادی- کاربردی
دانشکده/مرکز دانشکده دندانپزشکی زاهدان
زمان اجرا -روز 427

اطلاعات مجری و همکاران
hide/show

نام و نام‌خانوادگی سمت در طرح نوع همکاری درجه‌تحصیلی پست الکترونیک
محمدایوب ریگی لادزمجری دکترای تخصصی dr.rigi@gmail.com
در محمد کردی تمندانیهمکار دکترای تخصصی dor_kordi@yahoo.com
سیروس ریسبافهمکار دکترای تخصصی s_risbaf@zaums.ac.ir
لیلا فرهاد ملاشاهیهمکار دکترای تخصصی naznar@gmail.com

اطلاعات تفضیلی
hide/show

عنوان متن
خلاصه طرح به فارسی بررسی بیان و هیپرمتیلاسیون ناحیه پروموتور ژن های PTPN14, MST2, SAV1 در بزاق بعنوان بیومارکر برای تشخیص زودهنگام سرطان سلول سنگفرشی دها ن
خلاصه طرح به لاتینAnalysis of expression and promoter hypermethylation PTPN14, MST2, SAV1genes in saliva as biomarker for early diagnosis of oral squamous cell carcinoma
بيان مسئله تحقيق/اهمیت پژوهشسرطان سلول سنگفرشی (scc) شایعترین نئوپلاسم بدخیم حفره دهان است (3 و2 و 1) و حدود 90% همه بدخیمی های دهان را تشکیل می دهد (4 و2و1) این ضایعه یکی از علل مهم موربیدیتی و مورتالیتی در جهان است و میزان بروز آن بر حسب محل جغرافیایی به میزان زیادی متفاوت است (5 و 1) سرطان دهان در بعضی از جمعیت های آسیایی عمدتاً کشورهای جنوب آسیا از جمله هند و پاکستان به طور قابل ملاحظه شیوع بالاتری دارد. در این کشورها سرطان دهان شایعترین سرطان در مردان و دومین سرطان شایع در هر دو جنس می باشد (7و6)
با توجه به اینکه تشخیص زود هنگام کلید درمان سرطان دهان است.)8) اگر بتــــوان بیماران مستعد به Scc را به طریقی قبل از پیدایش ضایعه پیشرفته به روش غیر تهاجمی غربالگری نمود کار بسیار سودمندی خواهد بود .
امروزه استفاده از مسیرهای داخل سلولی و مواد موثر در این مسیرها یکی از روش های درمانی بدخیمی ها است.یکی از این مسیر های سیگنالی که نقش چشمگیری در انواع سرطان ها دارد ، هیپو((Hippo است. درسالهای اخیر افزایش تعداد مطالعات روی پستانداران فرضیه انحراف مسیر هیپو وتومورزایی درموش را قوت بخشیده است. درسرطان های انسانی نیز جهش وتغییر بیان زیرمجموعه ژنهای مسیر هیپو، مشاهده شده است. به عنوان مثال نوروفیبرومین 2 (NF2) تنها ژن مسیر هیپو است که درسرطانها در اثرجهش غیرفعال میشود. مسیرهیپو شامل شبکه بزرگی از پروتئین ها است که رشد بافتهای مختلف راطی نمو وباز سازی و همچنین تحت شرایط آسیب شناختی مانند سرطان کنترل میکند. این مسیرسیگنالی میتواند از طریق محدود کردن تکثیر سلولی وافزایش اپپتوز،تعدادسلول ها واندازه ی ارگان ها را کنترل نماید. (9) قلب مسیر هیپو یک هسته کینازی است که عبارت است از یک جفت سرین/ ترئونین کینازها شامل MST1/ MST2/ LATS1/ LATS2/ SAV1/ MOB1A/ MOB1B. این پروتئینها رشد بافت را توسط فسفریلاسیونYAP1 وابسته به LATS1و LATS2 محدود میکنند. فسفریلاسیون YAP1 و TAZ فعالیت آنها را با ایجاد جایگاه اتصال پروتئینهای 3-3- 14 سرکوب میکند و باعث میشود این پروتئینها داخل سیتوپلاسم تجمع و توسط کازئین کیناز 1 CK یوبی کوئیتینه و تخریب گردند.(10 )محرک های مکانیکی مانند کشش یا انقباض اتصالات سلولی به ترتیب با افزایش بیان YAP و کاهش بیان YAP مسیر هیپو فعال یا غیر فعال می شود که در صورت خاموش شدن، YAP/TAZ وارد هسته شده ورشد بافت وزیست پذیری سلول را ازطریق تنظیم فعالیت فاکتورهای رونویسی مختلف شامل TEADs وSMADsو RUNX توسعه میدهند. فعالیت دیگر مسیر های سیگنالی نیز روی فعال شدن یا غیرفعال شدن Hippoموثر است.مثلا جهش در ژن های مسیر wnt باعث افزایش -cateninβ شده،که این افزایش باعث افزایش ورود YAP به هسته می شود زیرا بتا کاتنین رها شده به YAP متصل شده و به عنوان یک فاکتور رونویسی عمل کرده تا این کو-فاکتور رونویسی روی آن بنشیند و در نهایت روی DNA قرار گیرند.تکثیر کنترل نشده سلول ظاهر اساسی نئوپلازی است ،جهش در پروتئین های مسیرهیپو که باعث هایپر اکتیو شدن YAPوTAZ در پستانداران و YKI در پرندگان میشود،باعث تکثیر اکتوپیک سلول میشود(9)تاکنون مطالعات مشابهی روی افراد سالم وبیمار انجام شده است وافراد درمعرض خطر ابتلا بررسی نشده اند وانجام مطالعه به این شکل برای اولین بار انجام خواهد شد .
نتــــــــایج مطالعات MAEDA وهمکاران درسال 2007 مشخص کرد که در کانسر حفــــــــــره دهان نا پایداری های ژنتیــــکی در هایپر متیـــــلاسیون پــــروموتور DNA نقش دارد که سبب کاهش بیـــــــان (l kappa Bkinase alpha ) Ikk می گردد درنهایت آنها پیــــشنهاد کردند که تغییرات اپی ژنتیک که سبب توقف بیان ژنی ( gene expression ) می شوند ارتباط نزدیک با پیشرفت بیمار به سمت پروگنوز نامطلوب دارد .(11 )
De Moraes وهمکارانش درسال 2008 ، وجود متیلاسیون را در تومورهای ناحیه دهان با پتانسیل تهاجم و متاستاز گزارش کردند ، همچنین آنها پیشنهاد کردند که تغییرات اپی ژنتیک بطور اولیه نقش مهمی در رشد وتوسعه سرطان دهان دارند. (12)
Imai وهمکارانش درسال 2008 ، گزارش کردند که غیرفعال شدن ژن Rfssf2 دراثر تغییرات اپی ژنتیک نقش بسیار مهم وحیاتی در سرطان سلول سنگفرشی دهان بازی می کند. آنها پیشنهاد کردند که از متیلاسیون RASSF 2 می توان بعنوان یک ابزار مولکولی مفید برای تشخیص ودرمان Scc حفره دهان استفاده کرد. (13)
Asokan وهمکارانش در سال 2014،گزارش کردند که متیلاسیون غیرعادی ژن های سرکوب کننده ی تومور از قبیل P16و E-cadherinدر مراحل ابتدایی ایجاد تومورهای سروگردن رخ داده و در پیشرفت بیماری بسیار موثرمیباشد.(14)

Yong-Deokوهمکارانش نیز درسال 2014،بیان نمودند که میتوان ژن های ADAM15, CDC7 IL12RB2 و TNFRSF8 را به عنوان بیومارکرهای مناسبی جهت تشخیص ودرمان oscc درنظر گرفت.(15)

هم چنین تحقیقات Jayalakshmi وهمکارانش در سال 2014، نشان داده است که افزایش بیان S100A4 میتواند به عنوان یک بیومارکر مهم جهت تشخیص ودرمان زودهنگام متاستاز در بیماران osccدر نظرگرفته شود.(16)

Jieru وهمکارانش در سال 2014، اعلام نمودند که بیان ژن های p-Akt, p-mTORو p70 S6Kدربیمارانosccبالاتر از حدمعمول است.(17)
باتوجه به مطالب فوق درایـــن طرح درنظراست احتمال ابتلا به Oscc در افراد در معرض خطر که ریسک فاکتورهای ابتلا را دارند بررسی گردد تاتمهیدات لازم جهت معاینات دوره ای، تشخیص زودهنگام و درمان به موقع ودرنتیجه افزایش طول عمر بیمار انجام شود
سوالات و / یا فرضیات پژوهشفرضیه : میزان متیلاسیون وبیان ژنها در بزاق افراد سالم ، در معرض خطر وبیمار با هم تفاوت دارد
هدف کلی طرحتعیین هیپرمتیلاسیون ناحیه پروموتور ژنهای YAP1, TAZ, NF2 در بزاق ،بعنوان بیومارکر برای تشخیص زود هنگام سرطان سلول سنگفرشی دهان
اهداف اختصاصی1 –تعیین متیلاسیون ناحیه پروموتور ژنهای YAP1, TAZ, NF2 در خون و بزاق گروههای سالم ، در معرض خطر و بیمار
2 – مقایسه متیلاسیون ژنهای یاد شده در خون و بزاق گروههای سالم ، در معرض خطر و بیمار
3 –تعیین میزان بیان ژنهای یاد شده در خون و بزاق گروههای سالم ، در معرض خطر و بیمار
4 – مقایسه میزان بیان ژن های یاد شده در خون و بزاق گروههای سالم ، در معرض خطر و بیمار
5 –تعیین متیلاسیون ژن های یاد شده دربافت سرطانی
7 – تعیین میزان بیان ژنهای یاد شده در بافت سرطانی
8 – مقایسه متیلاسیون ژنهای یاد شده دربافت سرطانی وبزاق فرد بیمار
9 - مقایسه متیلاسیون ژنهای یاد شده دربافت سرطانی وبزاق فرد در معرض خطر
10 - مقایسه متیلاسیون ژنهای یاد شده دربافت سرطانی وبزاق فرد سالم
سازمانها، مراکز و موسسات و سایر بهره برداران بالقوه دستاوردهای طرحسازمانها و مراکز بهداشتی درمانی
تعریف واژه های تخصصیمسیر سیگنالی هیپو: یک مسیر آبشاری کینازی است که در تنظیم اندازه ی ارگانها از طریق ایجاد تعادل بین تکثیر و آپپتوز دخیل است (9)
هایپرمتیلاسیون:یک تغییر اپی ژنتیکی است که شامل اضافه شدن گروه های متیل به ریشه های سیتوزین موجود در جزایرCPG بوده ودر خاموش کردن ژنها دخیل است(10)
بیان ژنی: فرایندی است که بواسطه آن اطلاعات کد شده در یک ژن جهت تولید مولکول های پروتیینی مورد استفاده قرار میگیرد(10)
نوع مطالعهCase - control
جامعه مورد مطالعه(معرفی مشارکت کنندگان)/ محیط پژوهش(معیارهای ورود و خروج ذکر شوند)بیماران مبتلا به ضایعات پیش سرطانی و سرطان سلول سنگفرشی دهان و همراهان سالم بیماران مراجعه کننده به دانشکده دندانپزشکی زاهدان
معیارهای ورود در گروه مورد:
ابتلا به ضایعات پیش سرطانی و سرطان دهان
معیارهای ورود در گروه شاهد:
افراد سالم مراجعه کننده که از لحاظ سن و جنس با گروه مورد هماهنگ باشند
معیارهای خروج از مطالعه:
عدم تمایل جهت شرکت در مطالعه
حجم نمونه و روش محاسبه آنبا توجه به مطالعات قبلی(18) 30 نمونه به عنوان گروه سالم ، 30 نمونه در معرض خطر ابتلا به Scc و30 نمونه بیمار انتخاب ومجموعاٌ 90 نفر بررسی خواهند گردید .
روش نمونه گیری(نحوه تخصیص تصادفی و همسانسازی در صورت لزوم ذکر شود)آسان و در دسترس
روش و ابزار جمع آوري داده ها / صحت و استحکام داده ها (پرسشنامه یا فرم اطلاعاتی ضمیمه شود)اطلاعات افراد شرکت کننده شامل سن و جنس و مصرف الکل و تنباکو و غیره در فرم اطلاعاتی ثبت میشود(ضمیمه شماره 1)
تایید تشخیص بالینی ضایعات بر اساس گزارش هیستو پاتولوژیک انجام خواهد شد
نمونه خون و بزاق از هر 3 گروه و نمونه بافت از گروه مبتلا به سرطان دهان جمع آوری شده و مطالعات ژنیتیک بر روی آنها صورت خواهد گرفت
روش اجرای طرح(با جزئیات بطور کامل شرح داده شود)در این مطالعه جهت بیماران با تشخیص بالینی oscc و ضایعات پیش سرطانی( لکو پلاکیا، اریتروپلاکیا لیکن پلان و فیبروز تحت مخاطی) پرسشنامه ای شامل اطلاعات فردی ، تاریخچه پزشکی وریسک فاکتورهای مرتبط ، توسط متخصص بیماریهای دهان تــکمیل ( نمونـــه پرسشنامه درقسمت پیوست ها آمده است ) می شود.پس از اخذ رضایت نامه کتبی از بیماران خواسته می شود تا cc 15 نرمال سالین را در دهان به مدت 30 ثانیه چرخانده ودر لوله آزمایش مخصوص خالی نمایند. نمونه بزاق تهیه شده در یخچال 4 درجه نگهداری و درپایان وقت همان روز به آزمایشگاه منتقل خواهد شد. سپس بیمار جهت بیوپسی به متخصص جراحی لثه ارجاع میشود .بطوریکه با لحاظ تمامی شرایط ضایعه وبافتهای اطراف 5 میلی متر از حاشیه سالم ضایعه نیز برداشته شود .همچنین بیمارانیکه با تشخیص scc حفره دهان به کلینیک خصوصی جراح فک وصورت همکار طرح ویا درمانگاه فک وصورت بیمارستان خاتم الانبیاء (ص) زاهدان مراجعه نمایند ابتدا به بخش بیماریهای دهان دانشکده دندانپزشکی زاهدان جهت تکمیل پرسشنامه واخذ نمونه بزاق ارجاع وسپس بیوپسی انجام خواهد شد .
بدیهی است که اگر با گزارش پاتولوژی تشخیص oscc یا ضایعات پیش سرطانی فوق الذکر رد شود بیمار مربوطه از مطالعه حذف خواهد شد وادامه درمان بیماران طبق پروتکل مربوطه انجام خواهد شد . همچنین از این افراد cc 3 خون وریدی جهت استخراج DNA و RNA گرفتـــــــه ودر لوله های حاوی مواد ضد انعقاد وارد خواهد شد . وبلافاصله به آزمایشگاه منتقل می گردد .
در آزمایشگاه DNA بافت ارسالی وبزاق توسط روش phenol chloroform جداسازی وسپس توسط کیت متیلاسیون DNA جدا شده سولفاته خواهد گردید. .درمرحله بعدی روی DNA سولفاته شده PCR انجام خواهد شد .
برای جداسازی RNA از کیت جداسازی مربوطه استفاده نموده وسپس RNA بدست آمده پس از تبدیل به CDNA جهت انجام RT – PCR مورد استفاده قرار خواهد گرفت .
پس از انتخاب نمونه های بیمار ودر معرض خطر وتعیین رنج سنی وهمچنین جنس آنان از بین مراجعین به بخش تشخیص دانشکده دندانپزشکی زاهدان 30 نفر مطابق با همان رنج سنی وجنس که فاقد هرگونه ضایعه در محیط دهان باشند به عنوان گروه کنترل انتخاب واز آنان نیز نمونه بزاق و خون بشرح ذکر شده در فوق تهیه وجهت بررسی وضعیت متیلاسیون وبیان ژنها به آزمایشگاه ارسال خواهد گردید.
روش تجزیه، تحليل و توصیف داده‌ها (نمونه‌اي از جدول توخالي ضميمه شود و روش هاي آماري مورد استفاده به طور كامل توضيح داده شود)(کیفی و کمی)ارتبــاط بین میتلاسیون وبیان ژن و متغیرهای مورد مطالعه توسط نرم افزار SPSS 12 ونرم افزار EPIFO – ver . 6 مورد تجزیه وتحلیل آماری قرار خواهد گرفت .
ملاحظات اخلاقی راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی در جمهوری اسلامی ایران، راهنمای عمومی: کدهای 1،2،3،4،5،6،7،8،9،11
راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی در جمهوری اسلامی ایران،فصل 4: کدهای 1،2،3،4
محدودیتهای اجرائی طرح و پیش بینی جهت حل آنها-
کلمات کلیدیهایپرمتیلاسیون – بیان ژن – سرطان سلول سنگفرشی دهان
Hypermethylation , gene expression, oral squamous cell carcinoma

فهرست منابع و مراجع1. sharma P, saxena S, Aggarwal P. Trends in the epidemiology of oral squamous cell carcinoma in western up: An Institutional study. Indian Journal of Dental Research 2010; 21(3): 316-319.
2. Lawoyin Jo, Lawoyin Do, Aderinkun G. Intra - oral squamous cell carcinoma in Ibadan: a review of 90 cases. Afr J Med sci 1997; 26:187-8.
3. Zini A, Czerninski R, sgan - cohen HD. oral cancer over four decades: epidemiology, trends, histology , and survival by anatomical sites. J oral pathol Med 2010; 39: 299-305.
4. Andisheh – Tadbir A, Mehrabani D, Heydari ST. Epidemiology of squamous cell carcinoma of the oral cavity in Iran. J craniofac surg 2008;19(6): 1699-702.
5. Howell. RE, wright BA, Dewar R. Trends in the oral cancer in Nova scotion from 1983 to 1997. oral surg oral Med oral pathol oral Radiol Endod 2003; 95: 205-12.

6. Bhurgri Y, Rahim A, Bhuttok , Bhurgri A, pinjani pK, Usman A, Hassan SH. Incidence of carcinoma of the oral cavity in Karachi - district south. J pak Med Assoc 1998; 48: 321-325.
7. Sankaranarayanan R. oral cancer in india: an epidemiologic and clinical review. oral surg oral Med oral pathol oral Radiol Endod 1990; 69: 325-330.
8- Trivedi DJ, Trivedi CH, Hallikeri K, Udupa R. Salivary sialic Acid As Marker of oral cancer. Int j Sci Inn Tech 2012; 1(1): 48-50.

9.Harvey KF, Zhang X, Thomas DM. The Hippo pathway and human cancer. Nat Rev Cancer 2013; 13(4): 246-57.

10.Shi Z, Jiao S, Zhou Z. Structural dissection of Hippo signaling. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) 2014;209-13

11.Maeda G, et al. Epigenetic inactivation of E-cadherin by promoter hypermethylation in oral carcinoma cells. Odontology 2007; 95(1): 24-9.

12.De Moraes RV, et al. E-cadherin abnormalities resulting from CPG methylation
promoter in metastatic and nonmetastatic oral cancer. Head Neck 2008; 30(1): 85-92.

13.Imai T, et al. Epigenetic inactivation of RASSF2 in oral squamous cell carcinoma. Cancer Sci 2008; 99(5): 958-66.

14.Asokan GS, Jeelani S, Gnanasundaram N. Promoter hypermethylation profile of tumour suppressor genes in oral leukoplakia and oral squamous cell carcinoma. J Clin Diagn Res 2014; 8(10): Zc09-12.

15.Yong-Deok K, et al. Molecular genetic study of novel biomarkers for early diagnosis of oral squamous cell carcinoma. Med Oral Patol Oral Cir Bucal 2014;235-40

16.Natarajan J, et al. Overexpression of S100A4 as a biomarker of metastasis and
recurrence in oral squamous cell carcinoma. J Appl Oral Sci 2014; 22(5): 426-33.

17.Jieru J, etal. Expression and clinical significance of serine-threonine
kinase/mammalian target of rapamycin/p70 S6K signal path- way in oral squamous cell carcinoma. Hua Xi Kou Qiang Yi Xue Za Zhi 2014; 32(5): 504-8.

18- Viet CT ,Jordan RC, Schmidt B. DNA promotor hypermethylation in saliva for the early diagnosis of oral cancer.J Calif Dent Assoc 2007;35(12):844-9.

پیوست ها
hide/show

نام فایل تاریخ درج فایل اندازه فایل دانلود
dr. rigi proposal.doc1393/11/27271360دانلود
komite akhlagh.doc1394/01/31309248دانلود