شناسایی گونه های لیشمانیوز جلدی با روش مولکولی، با هدف قرار دادن ژن HSP70 در شهرستان چابهار و کنارک1394

Identification of cutaneous leishmaniasis species with Molecular methods by targeting HSP70 gene at city of Chabahar and Konarak 2015


چاپ صفحه 		پژوهان
صفحه نخست سامانه		 مجری و همکاران
مجری و همکاران		 اطلاعات تفضیلی
اطلاعات تفضیلی		 دانلود
دانلود 		علوم پزشکی زاهدان
علوم پزشکی زاهدان

مجریان:

کلمات کلیدی:

اطلاعات کلی طرح
hide/show

کد طرح 7232
عنوان فارسی طرح شناسایی گونه های لیشمانیوز جلدی با روش مولکولی، با هدف قرار دادن ژن HSP70 در شهرستان چابهار و کنارک1394
عنوان لاتین طرح Identification of cutaneous leishmaniasis species with Molecular methods by targeting HSP70 gene at city of Chabahar and Konarak 2015
نوع طرح
محل اجرای طرح مدیریت توسعه فناوری سلامت
رسته مطالعاتی توصیفی- تحلیلی
دانشکده/مرکز دانشکده پزشکی زاهدان
زمان اجرا -روز 360

اطلاعات مجری و همکاران
hide/show

نام و نام‌خانوادگی سمت در طرح نوع همکاری درجه‌تحصیلی پست الکترونیک
علیرضا سلیمی خراشادمجری اولاستاد راهنمادکترای تخصصی salimi35ali@yahoo.com
عادل ابراهیم زادهمجری دوماستاد راهنمادکترا(p.h.d)
هادی میراحمدیمشاورمشاور تخصصیدکترای تخصصی hmirahmadi59@gmail.com
مهناز شهرکی پورمشاورمشاور آمارکارشناسی ارشدmahnaz@gmail.com
علیرضا سهراب نهادهمکار کارشناس ارشدsohrabnahad.a@gmail.com

اطلاعات تفضیلی
hide/show

عنوان متن
خلاصه طرح به فارسی شناسایی گونه های لیشمانیوز جلدی با روش مولکولی، با هدف قرار دادن ژن HSP70 در شهرستان چابهار و کنارک1394
خلاصه طرح به لاتینIdentification of cutaneous leishmaniasis species with Molecular methods by targeting HSP70 gene at city of Chabahar and Konarak 2015
بيان مسئله تحقيق/اهمیت پژوهشلیشمانیازیس جلدی یک عفونت انگلی پوستی مشترک بین انسان و حیوان است که توسط تک یاخته ای از جنس لیشمانیا ایجاد می شود، نیش گونه هایی از پشه خاکیphlebotomus ) ) باعث انتقال لیشمانیازیس به انسان می شود، انگل در بدن انسان در داخل سلولهای ماکروفاژ زندگی کرده و تکثیر می یابد (1, 2) 30 گونه انگل لیشمانیای شناسایی شده که علائم بالینی ایجاد شده توسط گونه ها طیف وسیعی را شامل می شود که حدود10گونه از نظر پزشکی و دامپزشکی اهمیت دارند. (3, 4)
انگل لیشمانیا از شاخه تاژکداران، راسته کینتوپلاستیدا و خانواده تریپانوزوماتیده می باشد که دارای دو فاز قابل تشخیص در چرخه ی زندگی خود می باشد: فرم پروماستیگوت ، فلاژل دار و متحرک بوده به صورت اجسام دوکی تاژک دار به طول μ 25-15 و عرض μ 3-2 می باشد .این مرحله از انگل در روده پشه خاکی ناقل تکثیر یافته و سپس به قسمت فوقانی دستگاه گوارش پشه مهاجرت کرده و خود را به حلق و حفره دهانی می رساند (2, 5)
انگل هایی که توسط پشه در پوست تلقیح شده اند بوسیله ماکروفاژ بلعیده شده و از فرم پروماستیگوت به فرم آماستیگوت تبدیل و شروع به تکثیر می کنند. فرم آماستیگوت، غیر متحرک و حدودا μ 5-2 اندازه داشته و فاقد تاژک آزاد است . این شکل از انگل در داخل ماکروفاژهای میزبان پستاندار مستقر گردیده و ایجاد بیماری می کند (6) فرم آماستیگوت از تغییر فرم پروماستیگوت وارد شده به بدن میزبان مهره دار ، درون واکوئل پارازیتوفروس ماکروفاژ ایجاد می شود (7, 8)
تظاهرات این بیماری به سه شکل اصلی جلدی،احشایی و جلدی- مخاطی قابل مشاهده است که در ایران نوع جلدی و احشایی آن مشاهده شده است. لیشمانیوز جلدی در ایران به دو شکل خشک (شهری)و مرطوب (روستایی) دیده می شود . در نوع روستایی که در اثر لیشمانیا ماژور بوجود می آید جوندگان به عنوان مخزن مطرح هستند و ناقل اصلی بیماری پشه خاکی فلبوتوموس پاپاتاسی است اما در نوع شهری که عامل آن لیشمانیا تروپیکا است مخزن اصلی بیماری انسان و ناقل اصلی فلبوتوموس سرژانتی می باشد (9-11)
لیشمانیوز یکی از 6 بیماری مهم مناطق گرمسیری می باشد که در 88 کشور جهان در قاره های آسیا، اروپا، آفریقا و آمریکا دیده می شود(12, 13) لیشمانیوز جلدی به عنوان یکی از مشکلات عمده بهداشتی در بسیاری از کشورهای جهان از جمله ایران مطرح است. سالانه 1 تا 5/1 میلیون مورد جدید مبتلا به لیشمانیوز جلدی گزارش می گردد که حدود 90 % موارد در 8 کشور جهان ) افغانستان، برزیل،ایران، پرو، عربستان سعودی، سوریه، الجزایر و سودان) رخ می دهد (14, 15) لیشمانیوز جلدی در ایران، ناشی از لیشمانیا ماژور (ZCL) معضل بهداشتی جدی و رو به افزایش است که در مناطق روستایی 15 استان از 31 استان کشور به صورت اندمیک وجود دارد (16, 17) مهم ترین کانون های اندمیک بیماری، مناطق ترکمن صحرا و لطف آباد در شمال شرق ایران، ابردژ ورامین، اصفهان و یزد در مرکز ایران، فارس و سیستان بلوچستان در جنوب و جنوب شرق و ایلام وخوزستان در جنوب غربی کشور واقع شد ه اند لیشمانیوز جلدی با عامل لیشمانیا تروپیکا (ACL) در برخی از نقاط دنیا به خصوص در کانونهای اندمیک منطقه خاورمیانه شایع است. چرخه انتقال این گونه از انگل در مناطق مختلف، متفاوت بوده و به طور کلی به یک مخزن حیوانی نیاز نیست. برخی از مهم ترین کانونهای این بیماری در ایران، در استان های تهران، خراسان رضوی، فارس و کرمان واقع هستند (18-20) استان سیستان و بلوچستان با کشور پاکستان همسایه است و گزاراشات قبلی نشان داده است که هر دو نوع لیشمانیانیوز جلدی خشک و مرطوب در بعضی از مناطق مرزی پاکستان آلوده می باشد (21) مطالعات بسیاری در مورد همه گیرشناسی، ناقلین، مخازن و تعیین هویت انگل لیشمانیا و عوامل لیشمانیوز در نقاط مختلف کشور انجام شده است (22)
روش معمول برای شناسایی انگل لیشمانیا در آزمایشگاه ها لامهای رنگ آمیزی شده می باشد که این روش خیلی دقیق نیست و همچنین به وسیله ی آن نمی توان گونه انگل را شناسایی کرد و به همین خاطر در چند سال گذشته روش های مولکولی خیلی استفاده شده است، با روش های مولکولی می توان نوع گونه ی انگل لیشمانیا را حتی در حضور تعداد کم انگل مشخص کرد، از قسمت های مختلف DNA انگل لیشمانیا جهت کارهای مولکولی استفاده می شود.(23, 24) پروتئین های شوک حرارتی (HSP) از جمله پروتئین هایی هستند که در کارهای تحقیقاتی در مورد انگل لیشمانیا از آنها استفاده شده است.HSP در همه ارگانیسم های زنده از باکتری تا انسان وجود دارند و بر اساس وزن مولکولی نامگذاری می شوند. (25) بیان این پروتئین ها در شرایط استرس مانند گرما یا قرار گرفتن سلول در برابر مواد سمی مانند اتانول˓آرسنیک˓اشعه ماورابنفش...افزایش می یابد و از دناتوره شدن سایر پروتئین ها جلوگیری می کنند که این عمل از وظایف چاپرونها نیز می باشد.بهمین علت برخی از پروتئین های HSP را بعنوان چاپرون می شناسند. (26) بیان این پروتئین ها در شرایط غیر استرس زا نیز رخ می دهد و نقش نظارت بر سایر پروتئین های سلول را بر عهده دارند˓بدین صورت که پروتئین های قدیمی را به سمت پروتئوزوم برده و کمک می کند که پروتئین های تازه سنتز شده به درستی fold شوند. (27) .HSP70 از جمله پروتئین های HSP می باشد که دارای توالی های بسیار حفاظت شده ای است و در تحریک پاسخهای سیستم ایمنی از جمله ایمنی هومورال نقش چشمگیری دارند. (28) پروتئین های شوک حرارتی انواع مختلفی دارند که می توان به1 HSP70-2,HSP70-HSP70-3 اشاره کرد. تفاوت این پروتئین ها در عملکرد و یا ژنهایشان است. بعنوان مثال تفاوت HSP70-1 و HSP70-2در بخش ᾿3 ناحیه ترجمه نشده شان (3᾿-UTR) است.HSP70-1 در استرسهای اسمتیک نسبت به HSP70-3 بیشتر بیان می شود و HSP70-2 در اسپرماتوژنز بعنوان چاپرون پروتئینهای دخیل در میوز عمل می نماید. (29) ژنهای این پروتئین در لیشمانیا حفاظت شده و اختصاصی است و همین امر آنرا بعنوان هدفی مناسب برای کارهای مولکولی تعیین کرده است. (30)









با استفاده از نرم افزار CLCDNA در محیط insilico و با استفاده از ژن هایی که با فرمت Fasta که از GenBank دانلود کرده و به کمک آنزیم تعداد قطعات را در گونه های مختلف شناسایی می کنیم.
در ژن HSP در لیشمانیا میجر با استفاده از آنزیم برش دهنده سه برش و چهار قطعه با اندازه های 323- 183و178و70 جفت باز ایجاد می نماید.
و همچنین در لیشمانیا تروپیکا که با ژن HSP70 بررسی شده مشاهده شد که دو برش وسه قطعه با اندازه های 321و243و182 جفت باز ایجاد می نماید




Requena و همکاران در سال 2012در اسپانیا از طریق سکوانسینگ ناحیهuntranslated region(UTR) -᾿3در ژن HSP70-I در ساب جنس ویانیا و لیشمانیا به این نتیجه رسیدند که این ناحیه میتواند بعنوان مارکر مولکولی مناسب جهت تشخیص گونه های مختلف لیشمانیا به کار رود. (31)
Ramirez و همکاران در سال 2011 در کلمبیا با روش RT-PCR نواحی ترجمه نشده(UTR) هر دو کلاس از HSP70 در لیشمانیا برازیلنسیس را مشخص کردند و آنرا با همولوگشان در سایر گونه های جنس لیشمانیا مقایسه نمودند و مشخص شد کهUTR-II ᾿3 در لیشمانیا برازیلنسیس نسبت به UTR-I᾿3 دایورژن تر بوده و تنها %57-55 با سایر گونه های لیشمانیا مشابهت دارد. (32)
دودی و همکاران در سال 1390 در اصفهان و بم به بررسی پلی مورفیسم ژنتیکی لیشمانیا ماژور و لیشمانیا تروپیکا به کمک تکنیک RFLP-PCR پرداختند.آنها با سکانس نمونه های متعلق به محل ITS1 در DNA استخراج شده ˓ 4 الگوی متفاوت ژنوتیپ ˓(2 الگو برای لیشمانیا ماژور و 2 الگو برای لیشمانیا تروپیکا) تعیین کردند. (33)
Fraga و همکاران در سال 2010 قطعه bp1380از ژن HSP70 را که در منطقه کدینگ وجود داشت˓در 43 ایزوله مختلف از مناطق جغرافیایی گوناگون ژن مذکور را جدا نموده و توالی آنرا با سکوانسینگ مشخص کردند و از آن برای فیلوژنی لیشمانیا استفاده نمودند. (34)
Boite و همکاران در سال 2010 در برزیل توانستند با استفاده از ژن HSP70 و روش PCR-RFLP و دو آنزیم محدود کننده HaeIII و MboI پنج گونه لیشمانیای متعلق به زیر جنس ویانیا را شناسایی کنند. (35)
Silva و همکاران در سال 2009 در برزیل گونه هایی از لیشمانیا را که مرتبط با لیشمانیازیس انسانی بودند با استفاده از سکوانسینگ ژن HSP70 و روش PCR-RFLP شناسایی کردند. (36)
Garcia و همکاران در سال 2004 جهت تایپینگ لیشمانیای نئوتروپیکال از روش PCR-RFLP و ژن HSP70 استفاده کردند.آنها نتیجه گرفتند که HSP70 PCR دارای حساسیت %89-85 و اختصاصیت 100% است و هم چنین ژنهای HSP70 هدف مناسبی برای تایپینگ گونه های لیشمانیای نئوتروپیکال موجود در بافتهای میزبان هستند زیرا از تنوع ژنتیکی کمتری نسبت به ژنهای, gp63 ,ITS ,rDNA برخوردارند. (37)
لیشمانیوز از جمله بیماری های بومی کشور ما است که متاسفانه زندگی برخی از هموطنان را در ابعاد مختلف روحی، جسمی و مادی تحت تاثیر سوء قرار داده است بنابراین مطالعه و تلاش برای دستیابی به یک روش تشخیص سریع و آغاز درمان می تواند بخشی از مشکلات بیماران را برطرف سازد و باعث ارتقای سطح بهداشت و اقتصاد مردم مناطق درگیر گردد، انگلهای لیشمانیا از نظر شکل ظاهری قابل تفکیک نیستند و تا پیش از توسعه روش های جدید، شناسایی و تفکیک گونه های انگل بر علائم بالینی، اپیدمیولوژی بیماری، بررسی ناقلین، توانایی ایجاد بیماری در حیوانات آزمایشگاهی و رشد در محیط کشت، استوار بود که عمدتاً نیازمند صرف زمان و هزینه بالایی است (38) هم چنین از آنجا که اولین گام در برنامه ریزی جهت کنترل و مبارزه با بیماری، تعیین مشخصات دقیق عامل بیماری است، آگاهی از میزان آلودگی آن ها در هر منطقه ، شناسایی گونه ها و سویه های لیشمانیا در مخازن و آگاهی از تغییرات ژنتیکی آن ها می تواند نقش اساسی در برنامه ریزی، کنترل و پیشگیری از بیماری داشته باشد لذا شناسایی گونه انگل و در نهایت نوع بیماری در برنامه ریزی های بهداشتی اهمیت بسزایی دارد در همیین راستا ما برآنیم در این تحقیق با مشاهدات میکروسکوپی لامهای رنگ آمیزی شده با گیمسا و روش PCR به وجود آلودگی و حضور انگل پی برده سپس این روش ها را مورد مقایسه قرار دهیم و هم چنین گونه های لیشمانیا را با روش مولکولی در شهرستانهای چلبهار و کنارک مورد بررسی قرارداده زیرا تعیین هویت نوع انگل در انسان در شناسایی جنبه های اپیدمیولوژیک بیماری وارائه برنامه کنترل اهمیت زیادی دارد.
محل اول بکارگیری نتایج تحقیق
مشکل جاری که سیاست گزار با آن مواجه است کدام است؟
روش های موجود کدامها هستند؟
پیشنهاد اول نحوه کاربرد
محل دوم بکارگیری نتایج تحقیق
منافع و مضرات روشهای موجود کدامند؟
سوالات و / یا فرضیات پژوهش1- فراوانی انگل لیشمانیا با روش پارازیتولوژی چقدر است؟
2- فراوانی انگل لیشمانیا با روش PCR- RFLP در شهرستانهای چابهار و کنارک چقدر است؟
3- فراوانی گونه های انگل لیشمانیا با روش PCR- RFLP ، با هدف قرار دادن ژن HSP70 در شهرستانهای چابهار و کنارک چقدر است؟
هدف کلی طرحشناسایی گونه های لیشمانیوز جلدی با روش مولکولی ، با هدف قرار دادن ژن HSP70 در شهرستان چابهار و کنارک 1394
اهداف اختصاصی1- تعیین فراوانی انگل لیشمانیا با روش پارازیتولوژی
2- تعیین فراوانی انگل لیشمانیا با روش PCR- RFLP در شهرستانهای چابهار و کنارک
3- تعیین فراوانی گونه های انگل لیشمانیا با روش PCR- RFLP ، با هدف قرار دادن ژن HSP70 در شهرستانهای چابهار و کنارک
چرا پیام تحقیق شما حلال مشکل جاری است؟
پیشنهاد دوم نحوه کاربرد
محل سوم بکارگیری نتایج تحقیق
پیام تحقیق شما چه منافعی از نظر هزینه، کارایی و بهره وری برای مدیر دارد؟
اهداف كاربردی
سازمانها، مراکز و موسسات و سایر بهره برداران بالقوه دستاوردهای طرح1- استفاده از نتایج طرح در برنامه ریزی و کنترل بیماری لیشمانیازیس جلدی در شهرستانهای چابهار و کنارک.
2- معرفی روش های جدید مولکولی جهت تشخیص قطعی گونه های لیشمانیا در انسان و استفاده از این روش ها در مراکز دانشگاهی، تحقیقاتی و آزمایشگاه ها و مراکز بهداشتی درمانی کشور
تعریف واژه های تخصصیپروماستیگوت: فرم ﻓﻼژل دار و ﻣﺘﺤﺮک انگل ﺑـﻮده که ﺑـﻪ صورت اجسام دوکی تاژک دار به طول μ 25-15 و عرض μ 3-2 می باشد.(2)
آماستیگوت: فرم غیر متحرک انگل بوده که حدودا μ 5-2 اندازه داشته و فاقد تاژک آزاد است. (2)
لیشمانیازیس: لیشمانیازیس یکی از بیماریهای مشترک بین انسان و حیوان میباشدکه به سه شکل جلدی (سالک)،احشایی (کالازار ) وجلدی مخاطی بروزمی کند. (2)
واکنش زنجیره پلی مراز (PCR) :
واکنش زنجیره‎ای پلی‎مراز (PCR) که قطعه‎ای از DNA را با اندازه و سکانس خاصی آمپلی فای می‎کند که با استفاده از یک قطعه ملکول DNA ، موجب تولید میلیونها نسخه از یک توالی خاص DNA می گردد. این روش متکی بر چرخه حرارتی ، شامل چرخه هایی از اعمال حرارت و سردکردن واکنش برای ذوب و نسخه برداری آنزیمی مولکول DNA است. (39)
RFLP : بررسی محصول PCR از طریق آنزیم‎های محدودالاثر روشی بسیار مطلوب و نسبتاً سریع و ساده است. برای این کار با آنزیم‎های محدود اثر، محصول PCR (DNA) را به قطعاتی تقسیم کرده و قطعات مورد نظر را از طریق الکتروفورز در ژل مشاهده می‎کنند. با در نظر گرفتن محل اثر آنزیم‎های برش دهنده (محدود اثر) وجود یا عدم وجود قطعه مورد نظر مشخص می‎گردد .(23)
ACL : از آنجا که مخــــــزن لیشمانیا تروپیکا عمدتاً افراد مبـــــتلا می باشند، به نام نــــوع آنـــــتروپــونـتیک (Anthroponotic Cutaneous Leishmaniasis= ACL ) گفته می شود .(2)

ZCL : لیشمانیا ماژور به دلیل داشتن مخزن جونده به نام نوع زئونوتــــیک Zoonotic Cutaneous Leishmaniasis, ZCL) ) نیز نامیده می شود. (2)
لیشمانیا تروپیکا: لیشمانیوز جلدی نوع شهری بوده که به دلیل عدم وجود ترشح در ضایعه به نام نوع خشک نامیده می شود. (2)

لیشمانیا ماژور: لیشمانیوز جلدی نوع روستایی بوده که به دلیل وجود ترشح در ضایعه به نام نوع مرطوب نامیده می شود. (2)
روش مستقیم پارازیتولوژی: در این روش از اطراف زخم نمونه گیری کرده و پس از تهیه گسترش و رنگ آمیزی با گیمسا به دنبال جسم لشمن (Leishman body) می گردیم. (23)
HSP: پروتئین های شوک حرارتی ( Heat shock proteins ) فراوان ترین پروتئین سلولی هستند که در شرایط استرس به میزان بالایی بیان می شوند و فعالیت های ایمونولوژیکی بسیاری دارند و به عنوان ادجوانت قادرند ایمونوژنیسیته آنتی ژن های ضعیف را تقویت کرده و می توانند سلول های ارائه دهنده آنتی ژن را تحریک نمایند. (26, 40)
برای اجرای راه حل پیشنهادی شما چه موانع و حمایتهایی وجود دارند؟
پیشنهاد سوم نحوه کاربرد
محل چهارم بکارگیری نتایج تحقیق
نوع مطالعهتوصیفی- مقطعی
جامعه مورد مطالعه(معرفی مشارکت کنندگان)/ محیط پژوهش(معیارهای ورود و خروج ذکر شوند)بیماران مشکوک به لیشمانیوز جلدی(روستایی و شهری) شهرستانهای چابهار و کنارک که در سال 1394 به مراکز بهداشتی درمانی مراجعه نموده و تشخیص مشکوک بودن توسط پزشک مربوطه داده شده است.
پیشنهاد چهارم نحوه کاربرد
حجم نمونه و روش محاسبه آنبا توجه به میزان شیوع بیماری در منطقه مورد مطالعه، نمونه برداری در بازه زمانی یکسال به شکل پاسیو برنامه ریزی شده است، کلیه ی بیماران مشکوک به لیشمانیوز جلدی را مورد بررسی قرار داده تا در طول یکسال حداقل 50 نمونه مثبت بدست آید در صورت عدم دستیابی به تعداد نمونه مورد اشاره در بازه زمانی یکسال ، نمونه برداری یا بصورت اکتیو (فعال) و یا با اضافه نمودن زمان نمونه برداری تا تامین حداقل 50 نمونه صورت خواهد پذیرفت.
روش نمونه گیری(نحوه تخصیص تصادفی و همسانسازی در صورت لزوم ذکر شود)روش نمونه گیری به روش سر شماری می باشد و کلیه موارد مشکوک بیماری را که به مراکز بهداشتی و درمانی شهرهای چابهار و کنارک در استان سیستان و بلوچستان مراجعه نموده و پزشک مرکز مشکوک به بیماری لیشمانیوز جلدی شده و همچنین شرایط ورود به مطالعه را داشته باشد وارد مطالعه می شوند.
روش و ابزار جمع آوري داده ها / صحت و استحکام داده ها (پرسشنامه یا فرم اطلاعاتی ضمیمه شود)1.فرم اطلاعاتی ساده جهت شناسایی افراد مبتلا به سالک
2.روش میکروسکوپی تهیه ی لام از بافت مشکوک
3.روش مولکولی PCR – RFLP
روش اجرای طرح(با جزئیات بطور کامل شرح داده شود)در این مطالعه که به صورت توصیفی تحلیلی انجام خواهد شد، ابتدا اطلاعات مربوط به افراد مشکوک به لیشمانیوز جلدی از مراکز بهداشت و درمان شهرستان های چابهار و کنارک دریافت و ضمن مراجعات حضوری از ضایعات پوستی و زخم هایی که مشکوک به سالک می باشد، نمونه برداری صورت خواهد گرفت در مورد هر فرد، اطلاعات فردی، نوع زخم، مدت ابتلا به زخم، تعداد ضایعات، محل ضایعه، سابقه مسافرت به مناطق اندمیک و سابقه مصرف دارو ثبت خواهد شد. برای نمونه برداری، ابتدا سطح زخم با الکل 70 % ضدعفونی میشود.چنانچه زخم پوشیده از عفونت باکتریایی یا قارچی باشد، قسمت مورد نظر برای نمونه برداری از ضایعات عفونی پاک می شودو سپس به کمک لنست یکبار مصرف استریل، از لبه و حاشیه زخم در جهت مرکز شکافی در زیر ناحیه متورم ایجاد، سپس مقداری از سروزیته توسط لنست به سطح لام منتقل کرده و به خوبی پخش می کنیم. نمونه برداری طوری انجام می شود که حتی المقدور در نمونه خون وارد نشود. بلافاصله نام و شماره بیمار در کنار لام نوشته میشود. برای مشاهده میکروسکوپی و اسمیرهای تهیه شده از ضایعات بیمار با متانول 95 % به مدت 30 ثانیه فیکس کرده و سپس با رنگ گیمسا (رقت1:10 با آب مقطر (به مدت 20 تا 30 دقیقه رنگ آمیزی می کنیم.پس از رنگ آمیزی، لام ها با آب شسته و بعد از خشک شدن لام، آماستیگوت های انگل روی لام در زیر میکروسکوپ نوری با روغن ایمرسیون و درشت نمایی x1000 جستجو می کنیم.
آماده سازی نمونه برای کار مولکولار :
1. استخراج DNA با استفاده از کیت، طبق پروتکل آن انجام می دهیم.
2. غلظت DNA را با استفاده از روشهای اسپکتروفتومتری و کیفیت DNA را بعد از الکتروفورز بر روی ژل آگارز بررسی می کنیم
3. جهت انجام RFLP- PCR از DNA استخراج شده(1.5 میکرولیتر)، پرایمر اختصاصی و آنزیم های برش دهنده و Premix-PCR استفاده می گردد . تفاوت در اندازه (size variation) ایجاد شده به وسیله الکتروفورز بر روی ژل آگارز 2 درصد و رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید و مقایسه با lader marker تعیین خواهد گردید.
روش تجزیه، تحليل و توصیف داده‌ها (نمونه‌اي از جدول توخالي ضميمه شود و روش هاي آماري مورد استفاده به طور كامل توضيح داده شود)(کیفی و کمی)ابتدا اطلاعات بیماران را وارد کامپیوتر کرده و برای آنالیز داده ها از نرم افزار SPSS استفاده میکنیم و سپس با استناد به روش های آماری توصیفی (جداول توزیع فراوانی و رسم نمودار) داده ها تجزیه و تحلیل خواهند شد.
ملاحظات اخلاقی در این پژوهش کدهای اخلاقی زیر از دفترچه راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی رعایت شده است.
با کد های ( 1، 2، 3، 4، 5، 7، 10، 11، 12، 13، 14، 15، 16، 17، 18، 19، 20، 21، 22، 23، 25، 26، 27، 28، 29، 30 و 31)
همچنین در این پژوهش کدهای اخلاقی زیر از دفتر چه راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی در جمهوری اسلامی ایران
راهنمای عمومی با کد های (1، 2، 3، 4، 5، 6، 7، 8، 9، 10 ، 11 و 12)
محدودیتهای اجرائی طرح و پیش بینی جهت حل آنها- عدم همکاری بیمار
راه حل : توضیح دادن در مورد منافع این طرح و این که هیچ ضرری متوجه آنان نخواهد شد و اطلاعات آنها به طور محرمانه باقی خواهد ماند و نامشان به هیچ عنوان فاش نخواهد شد.
- دشوار بودن مسیرها
راه حل : در اختیار قرار گذاشتن ماشین در اختیار محقق توسط مرکز بهداشت شهرستانهای فوق با همکاری و هماهنگی معاونت دانشگاه علوم پزشکی زاهدان
- اسکان محقق
راه حل : در اختیار قرار دادن خوابگاه توسط مرکز بهداشت شهرستانهای فوق با همکاری و هماهنگی معاونت دانشگاه علوم پزشکی زاهدان
کلمات کلیدیلیشمانیازیس. لیشمانیوز جلدی، PCR - RFLP و HSP70
فهرست منابع و مراجع
1. Azizi H, Hejazi S, Boroujeni A, Jafari M, Taghizadeh N. Detection and identification of Leishmania isolates from patients with cutaneous leishmaniasis (CL) in Isfahan (central region of Iran) by PCR method. Archives of Razi Institute. 2013;68(2):153-8.

2. D J. Markell and Voges Medical Parasitology. St Louis: Sanders. 2006.

3. Bates PA. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. International journal for parasitology. 2007;37(10):1097-106.

4. Desjeux P. Leishmaniasis: public health aspects and control. Clinics in dermatology. 1996;14(5):417-23.

5. Handman E, Mitchell GF. Immunization with Leishmania receptor for macrophages protects mice against cutaneous leishmaniasis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1985;82(17):5910-4.

6. Vaeznia H, Dalimi A, Sadraei J, Pirstani M. Determination of Leishmania species causing cutaneous leishmaniasis in Mashhad by PCR-RFLP method. Archives of Razi. 2009;64(1):39-44.

7. Handman E. Cell biology of Leishmania. Advances in parasitology. 1999;44:1-39.

8. Guy RA, Belosevic M. Comparison of receptors required for entry of Leishmania major amastigotes into macrophages. Infection and immunity. 1993;61(4):1553-8.

9. Ardahali S, Rezaei H, Nadim A. Leishmania and leishmaniasis. Tehran: Tehran uneversity publication center. 1994.

10. Bates PA. Leishmania sand fly interaction: progress and challenges. Current opinion in microbiology. 2008;11(4):340-4.

11. Mohebali M, Fotouhi A, Hooshmand B, Zarei Z, Akhoundi B, Rahnema A, et al. Comparison of miltefosine and meglumine antimoniate for the treatment of zoonotic cutaneous leishmaniasis (ZCL) by a randomized clinical trial in Iran. Acta tropica. 2007;103(1):33-40.

12. Cupolillo E, Grimaldi G, Momen H, Beverley SM. Intergenic region typing (IRT): a rapid molecular approach to the characterization and evolution of Leishmania. Molecular and biochemical parasitology. 1995;73(1):145-55.

13. Edrissian GH. Visceral leishmaniasis in Iran and the role of serological tests in diagnosis and epidemiological studies. Parasitology for 21st Century ICOPA VIII, Izmir, Turkey: CAB International. 1996:63-78.

14. FA DY. Leishmaniasis. J Am Acad Dermatol 1997;37(1):40-139.
15. Mahnaz T, Katrin K, Amer A-J, Isabel M, Gabriele S, Safar F, et al. Leishmania major: genetic heterogeneity of Iranian isolates by single-strand conformation polymorphism and sequence analysis of ribosomal DNA internal transcribed spacer. Acta tropica. 2006;98(1):52-8.

16. Nadim A TBG FM, Heydari M, Abadi AA. Differentiation of Leishmania tropica major from Leishmania tropica minor by inoculation to laboratory animals. Iranian J Publ Health 1973;2(2):18-115.

17. Moin-Vaziri V, Depaquit J, Yaghoobi-Ershadi M-R, Oshaghi M-A, Derakhshandeh-Peykar P, Ferté H, et al. Intraspecific variation within Phlebotomus sergenti (Diptera: Psychodidae) based on mtDNA sequences in Islamic Republic of Iran. Acta tropica. 2007;102(1):29-37.

18. Nekouie H, Assmar M, Razavi M, Naddaf S. A study on Leishmania infection rate among Phlebotomus spp. collected from Abardejh district, Iran. Iranian Journal of Veterinary Research. 2006;7(4):77-81.

19. Mohebali M, Javadian E, Yaghoobi Ershadi M, Akhavan A, Hajjaran H, Abaei M. Characterization of Leishmania infection in rodents from endemic areas of the Islamic Republic of Iran. 2004.

20. Javadian E, Nadim A, Tahvildare-Bidruni G, Assefi V. Epidemiology of cutaneous leishmaniasis in Iran: B. Khorassan Part V: Report on a focus of zoonotic cutaneous leishmaniasis in Esferayen. Bulletin de la Societe de pathologie exotique et de ses filiales. 1975;69(2):140-3.

21. Parvizi P, Ready P. Nested PCRs and sequencing of nuclear ITS‐rDNA fragments detect three Leishmania species of gerbils in sandflies from Iranian foci of zoonotic cutaneous leishmaniasis. Tropical Medicine & International Health. 2008;13(9):1159-71.

22. فولادی بهمن شا, ابراهیم زاده عادل, هاشمی شهری سیدمحمد, مرادقلی حمیدرضا, سرابندی نو افسانه, فضایلی اصغر. مقایسه روش PCR مستقیم با روشهای میکروسکوپی و کشت in vitro برای تشخیص لیشمانیوز جلدی. مجله تحقیقات علوم پزشکی زاهدان (طبیب شرق). 1386;9(6):189-181.

23. Azani S, Rasi Y, Oshaghi M, Ershadi M, Mohebali M, Abaei M. Diagnosis and characterization of leishmania species in patients and rodents giemsa-stained slides by PCR-RFLP in damghan district, iran. Scientific Journal of Hamadan University of Medical Sciences and Health Services Winter. 2011;17(4):5-9.

24. Mirzaei A RS, Kazerooni P, Farahmand M, Parvizi P. Molecular detection and conventional identification of Leishmania species in reservoir hosts of zoonotic cutaneous leishmaniasis in Fars province, south of Iran. Iranian journal of parasitology. 2013;17(4):5-10.

25. Li Z, Srivastava P. Heat‐Shock Proteins. Current Protocols in Immunology. 2004:A. 1T. -A. T. 6.

26. Pauwels K, Van Molle I, Tommassen J, Van Gelder P. Chaperoning Anfinsen: the steric foldases. Molecular microbiology. 2007;64(4):917-22.

27. Benjamin IJ, McMillan DR. Stress (heat shock) proteins molecular chaperones in cardiovascular biology and disease. Circulation research. 1998;83(2):117-32.

28. Rico AI, Angel SO, Alonso C, Requena JM. Immunostimulatory properties of the Leishmania infantum heat shock proteins HSP70 and HSP83. Molecular immunology. 1999;36(17):1131-9.

29. Shim EH, Kim JI, Bang ES, Heo JS, Lee JS, Kim EY, et al. Targeted disruption of hsp70. 1 sensitizes to osmotic stress. EMBO reports. 2002;3(9):857-61.

30. Lee M AB, Holmes G,Van der Ploeg L. Structure and expression of the hsp70 gene family of Leishmania. Major.Nucleic Acid Res. Oct. 1988;16(20):9567-85.

31. Requena JM, Chicharro C, García L, Parrado R, Puerta CJ, Cañavate C. Sequence analysis of the 3′-untranslated region of HSP70 (type I) genes in the genus Leishmania: its usefulness as a molecular marker for species identification. Parasit Vectors. 2012;5:87.

32. Ramírez CA, Requena JM, Puerta CJ. Identification of the HSP70-II gene in Leishmania braziliensis HSP70 locus: genomic organization and UTRs characterization. Parasit Vectors. 2011;4:166.

33. Doodi M EG, Bozorgi M, Hejazi SH. Assaying genetic polymorphism of Leishmania major and Leishmania tropica with PCR-RFLP technique in two hyper endemic regions (Isfahan-Bam). (Text in Persian). 2011;14(4).

34. Montalvo A, Fraga J, Monzote L, Montano I, De Doncker S, Dujardin J, et al. Heat-shock protein 70 PCR-RFLP: a universal simple tool for Leishmania species discrimination in the New and Old World. Parasitology. 2010;137(08):1159-68.

35. Boite MC OT, et. al. Testing and validating PCR-RFLP of heat- shock protein 70 gene for further use as a universal tool for leishmania identification and for replacing MLEE. 2010.

36. da Silva LA, de Sousa CdS, da Graça GC, Porrozzi R, Cupolillo E. Sequence analysis and PCR-RFLP profiling of the hsp70 gene as a valuable tool for identifying Leishmania species associated with human leishmaniasis in Brazil. Infection, Genetics and Evolution. 2010;10(1):77-83.

37. Garcia L, Kindt A, Bermudez H, Llanos-Cuentas A, De Doncker S, Arevalo J, et al. Culture-independent species typing of neotropical Leishmania for clinical validation of a PCR-based assay targeting heat shock protein 70 genes. Journal of clinical microbiology. 2004;42(5):2294-7.

38. Nekouie H, Assmar M, Razavi M, Naddaf S. A study on Leishmania infection rate among Phlebotomus spp. collected from Abardejh district, Iran. Iranian J Vet. 2006;2006:7.

39. Tanabe K SN, Kaneko O, Saito-Ito A, Kimura M. A PCR method for molecular epidemiology of Plasmodium falciparum Msp-1. The Tokai journal of experimental and clinical medicine 1998;23(6):375-81.

40. Wang X-Y, Sun X, Chen X, Facciponte J, Repasky EA, Kane J, et al. Superior antitumor response induced by large stress protein chaperoned protein antigen compared with peptide antigen. The Journal of Immunology. 2010;184(11):6309-19.

پرسشنامه یا فرم اطلاعاتی
معرفی پژوهش/ اهداف پژوهش
(عین عبارت هدف پروپوزال را کپی نکنید. بلکه با جملاتی که برای مردم قابل فهم باشد (برای سواد حدود پنجم ابتدایی )هدف را برای شرکت کنندگان توضیح دهید.) در تمام این متن در صورتیکه شرکت کننده کودک یا فرد فاقد ظرفیت تصمیم گیری است باید مواردیکه منظور از "من"، فرد شرکت کننده بوده است به "کودک" یا "فرد تحت سرپرستی من" اصلاح شود و مواردیکه منظور از "من"، رضایت دهنده است به من به عنوان "ولی" یا "قیم قانونی" اصلاح شود.
خون گیری
(آیا طرح شما نیاز به خونگیری دارد یا خیر)
نحوه همکاری/ مزایا ی طرح
(در این بخش برای شرکت کنندگان به زبان ساده توضیح دهید که: چه مداخله ای بر روی آنها صورت میگیرد. چه اقدامات پاراکلینیکی بر روی آنها انجام میشود. چه نمونه ای و با چه حجمی از آنها میگیرید در این مدت چند نوبت مراجعه باید داشته باشند و به چه فواصلی چه اقداماتی را در پیگیری آنها انجام میدهید. (حتی میتوانید سود بالقوه ای که شرکت کنندگان میتوانند از شرکت در این پژوهش ببرند بنویسید. این سود میتواند شرح احتمال درمان یا تشخیص بهتر بیماریشان، دریافت خدمات سلامت رایگان و یا پرداخت مشوق مالی در ازای جبران همکاریشان باشد)
عوارض جانبی
(منظور عوارض و میزان احتمال بروز آنها در این مطالعه است)
جبران عوارض احتمالی
(برای آنکه شرکت کننده بتواند ارزیابی مناسبی از سود و زیان شرکت در پژوهش شما داشته باشد لازم است بتواند سود و زیان مداخلات معمول و مداخلات این پژوهش را مقایسه کند. به عنوان مثال میزان موفقیت و میزان عوارض هریک را مقایسه کند.) - او باید بداند كه اگر در حين و بعد از انجام پژوهش هم هر مشكلي اعم از جسمي و روحي به علت شرکت در اين پژوهش برایش پيش آمد درمان عوارض، و هزينه‌هاي آن و غرامت مربوطه بر عهده مجري خواهد بود.
هزینه های مربوط به انجام طرح تحقیقاتی
(تمام مداخلات پژوهشی باید برای بیمار رایگان باشد و بیمار بداند شامل چه مواردی هستند. )
روش های جایگزین
در صورت عدم تمایل به شرکت در مطالعه چه روش های درمانی برای بیمار ارائه خواهد شد
محرمانه بودن
بیمار باید بداندکه دست اندر كاران اين پژوهش، كليه اطلاعات مربوط به او را نزد خود به صورت محرمانه نگه‌داشته و فقط اجازه دارند نتايج كلي و گروهي اين پژوهش را بدون ذکر نام و مشخصات بیمار منتشر كنند. و كميته اخلاق در پژوهش با هدف نظارت بر رعایت حقوق وی مي‌تواند به اطلاعات ایشان دسترسي داشته باشد.
پاسخگویی به پرسش ها
در این بخش نام و اطلاعات دسترسی فردی از عوامل پژوهش را که بتواند اطلاعات صحیح و کافی در اختیار شرکت کنندگان قرار دهند و در مورد عوارض و نگرانیها راهنمایی لازم را ارائه دهند ذکر شود
حق نپذیرفتن یا انصراف
بیمار باید بداند که شرکت اودر اين پژوهش کاملاً داوطلبانه است و مجبور به شرکت در اين پژوهش نيست و در صورت عدم شرکت از مراقبت‌هاي معمول تشخيصي و درماني محروم نخواهد شد او باید بداند كه حتي پس از موافقت با شركت در پژوهش مي‌تواند هر وقت كه بخواهد، پس از اطلاع به مجري، از پژوهش خارج شود و خروج اواز پژوهش باعث محرومیت از دریافت خدمات درمانی معمول برای اونخواهد شد.
رضایت
او باید بداند که اگر اشکال يا اعتراضي نسبت به دست اندركاران يا روند پژوهش دارد مي تواند با كميته اخلاق در پژوهش دانشگاه تماس گرفته و مشکل خود را به صورت شفاهي يا كتبي مطرح نمايد. در انتهای فرم قید گردد : اينجانب موارد فوق‌الذکر را خواندم و فهميدم و بر اساس آن رضايت آگاهانه خود را براي شركت در اين پژوهش اعلام مي‌کنم. اينجانب ……………… خود را ملزم به اجراي تعهدات مربوط به مجري در مفاد فوق دانسته و متعهد مي‌گردم در تأمين حقوق و ايمني شركت كننده در اين پژوهش تلاش نمايم

پیوست ها
hide/show

نام فایل تاریخ درج فایل اندازه فایل دانلود
55913895801.pdf1393/11/27279001دانلود
58913910407.pdf1393/11/27345448دانلود
66513860304.pdf1393/11/27210158دانلود
propozal.doc1393/11/27547840دانلود
aslah methodology.doc1393/12/09612864دانلود
aslah shora.doc1393/12/20665088دانلود
eslah methodology.final.doc1394/01/19612864دانلود
nahaee2.doc1394/01/24710656دانلود