مطالعه برخی بیومارکرهای رشد سلولی و آپوپتوز و هیستومورفولوژی کبد به منظور بررسی موارد سرطان هپاتوسلولار ناشی از HBV : یک مطالعه ایمونوهیستوشیمی، استریولوژی، واکنش QRT-PCR، و الکترون میکروسکوپی.

Study of cell growth and apoptosis biomarkers and histomorphology of the liver for the evaluation of HBV-related hepatocellular carcinoma: An immunohistochemical study, Stereology, QRT-PCR, and electron microscopy.


چاپ صفحه 		پژوهان
صفحه نخست سامانه		 مجری و همکاران
مجری و همکاران		 اطلاعات تفضیلی
اطلاعات تفضیلی		 دانلود
دانلود 		علوم پزشکی زاهدان
علوم پزشکی زاهدان

مجریان: زهرا حیدری , بیتا مودی

کلمات کلیدی:

اطلاعات کلی طرح
hide/show

کد طرح 7262
عنوان فارسی طرح مطالعه برخی بیومارکرهای رشد سلولی و آپوپتوز و هیستومورفولوژی کبد به منظور بررسی موارد سرطان هپاتوسلولار ناشی از HBV : یک مطالعه ایمونوهیستوشیمی، استریولوژی، واکنش QRT-PCR، و الکترون میکروسکوپی.
عنوان لاتین طرح Study of cell growth and apoptosis biomarkers and histomorphology of the liver for the evaluation of HBV-related hepatocellular carcinoma: An immunohistochemical study, Stereology, QRT-PCR, and electron microscopy.
نوع طرح بنیادی-کاربردی
محل اجرای طرح مرکز تحقیقات بیماریهای عفونی و گرمسیری
رسته مطالعاتی بنیادی- کاربردی
دانشکده/مرکز دانشکده پزشکی زاهدان
زمان اجرا -روز 930

اطلاعات مجری و همکاران
hide/show

نام و نام‌خانوادگی سمت در طرح نوع همکاری درجه‌تحصیلی پست الکترونیک
زهرا حیدریاستاد راهنمای اول پایان نامه دانشجویینظارت بر اجرای طرحدکترای تخصصی histology_iri@yahoo.com
حمیدرضا محمودزاده ثاقباستاد راهنمای دوم پایان نامه دانشجویینظارت بر اجرای طرحدکترای تخصصی histology@ymail.com
محمد هاشمیمشاور دکترا - PHDmhd.hashemi@gmail.com
سید موید علویانمشاورهمکاری در اجرای طرح editor@hepatmon.com
مهری نیک بینمشاورهمکاری در اجرای طرح nikbin_mehri@yahoo.com
شهناز سالیمشاورهمکاری در اجرای طرح Dr.shsali@gmail.com
بیتا مودیمجری دکترای تخصصی bita.moudi@yahoo.com

اطلاعات تفضیلی
hide/show

عنوان متن
خلاصه طرح به فارسی مطالعه برخی بیومارکرهای رشد سلولی و آپوپتوز و هیستومورفولوژی کبد به منظور بررسی موارد سرطان هپاتوسلولار ناشی از HBV : یک مطالعه ایمونوهیستوشیمی، استریولوژی، واکنش QRT-PCR، و الکترون میکروسکوپی.
خلاصه طرح به لاتینStudy of cell growth and apoptosis biomarkers and histomorphology of the liver for the evaluation of HBV-related hepatocellular carcinoma: An immunohistochemical study, Stereology, QRT-PCR, and electron microscopy.
بيان مسئله تحقيق/اهمیت پژوهشهپاتیت به دسته گسترده ای از اختلالات بالینی- پاتولوژیکی و اختلالات بیوشیمیایی اطلاق می شود که از تخریب کبد به علت عوامل ویروسی، سمی، دارویی، بیماریها و یا تهاجم سیستم ایمنی به کبد بوجود می آیند. این بیماری از لحاظ بالینی به دو صورت حاد و مزمن بروز می کند. داروهایی نظیر متیل دوپا، ایزونیازید و آمیودارون و بیماریهایی نظیر ویلسون از علل ایجاد هپاتیت هستند. یکی از انواع هپاتیت، نوع ویرال است و تاکنون 6 ویروس هپاتیت شامل E، D، C، B، A و G شناخته شده اند. (1،2) بر اساس برآورد سازمان بهداشت جهانی WHO حدود 2 میلیارد نفر از جمعیت جهان شواهد سرولوژیکی ابتلا به عفونت با ویروس هپاتیت B [Hepatitis B Virus (HBV)] را دارند که حدود 400-360 میلیون نفر آنان به عفونت مزمن HBV مبتلا می باشند] ناقل مزمن: (Chronic Hepatitis B Virus Carrier)[. 15 تا 40 درصد ناقلین مزمن در معرض عوارض درازمدت بیماری شامل سیروز یا نارسایی کبدی، کارسینوم هپاتوسلولار (HCC) و مرگ قرار دارند. سالیانه حدود 500000-700000 مورد مرگ ناشی از HBV گزارش می شود(3،4).
میزان شیوع افراد ناقل ویروس HBV بین 1/0 تا 20 درصد است، این شدت اختلاف ناقلین HBV بیشتر به سن ابتلا بستگی دارد، بر مبنای سن زمان کسب عفونت HBV سرانجام عفونت افراد متفاوت می باشد. عفونت ممکن است بدون علائم بالینی یا هپاتیت بالینی تظاهر نموده و یا به صورت عفونت مزمن (ناقل مزمن) درآید که ناقل مزمن مهمترین منبع حفظ و بقاء ویروس و انتقال به دیگران می باشد. حدود 1 درصد عفونت حاد دوران نوزادی، 10 درصد عفونت حاد کودکان 1-5 ساله و 30 درصد عفونت حاد کودکان بزرگتر بصورت هپاتیت بالینی تظاهر می نماید(3،4). مزمن شدن عفونت HBV افراد با سن زمان کسب عفونت رابطه معکوس دارد بطوریکه عفونت بیش از 90 درصد نوزادان و شیرخواران، 25-50 درصد کودکان 1-5 ساله و 6-10 درصد کودکان بزرگتر و بالغین مزمن می گردد. زمان کسب عفونت نسبت قابل توجهی از بزرگسالان، از عوارض مزمن هپاتیت B دوران کودکی آنان است لذا پیشگیری از کسب عفونت HBV در دوران نوزادی و اوایل کودکی مناسب ترین استراتژی پیشگیری از عفونت هپاتیت B و عوارض ناشی از آن در بزرگسالی می باشد(3-5).
انسان تنها میزبان ویروس فوق العاده مسری HBV می باشد. ویروس مقاوم به عوامل محیطی در خون و ترشحات بدن انسان وجود داشته و از طریق تزریقات یا تماس مخاطی با ترشحات آلوده انتقال میابد. راههای عمده انتقال عفونت شامل: انتقال عفونت از مادر آلوده به جنین و نوزادش (انتقال عمودی)، تماس طولانی مدت مادر و شیرخوار پس از زایمان (انتقال افقی)، تزریق خون و ترکیبات آلوده، تماس جنسی، تماس نزدیک و طولانی مدت با ناقل مزمن می باشد. بر مبنای نسبت جمعیت ناقلین مزمن یک منطقه یا کشور، آلودگی نواحی به مناطق با آلودگی بالا، متوسط و کم تقسیم می شوند. حدود 60 درصد جمعیت جهان در کشورهای هایپرآندمیک (Hyper Endemicity) شامل چین، تایوان، اندونزی و تعدادی از کشورهای آسیایی-آفریقایی زندگی می کنند و حدود 8 درصد جمعیت ناقل مزمن ویروس می باشند(3،4).
آمریکای شمالی، اروپای شمالی و بعضی کشورهای مناطق مختلف جغرافیایی جزو مناطق با آلودگی کم (Low Endemicity ) می باشند. در این مناطق کمتر از 2 درصد جمعیت ناقل مزمن ویروس هستند(3،4).
ایران جزو کشورهای با آلودگی خفیف تا متوسط ( International Endemicity) است که شیوع سرمی عفونت HBV 35 درصد و نسبت جمعیت ناقل مزمن 5-7/1 درصد است(6-8).
منشاء و زمان کسب عفونت نیمی از افراد ایرانی آلوده به HBV در دوران نوزادی و از مادران ناقل مزمن بوده (9) و حدود 56-51 درصد بیماران سیروتیک ایرانی شواهد عفونت مزمن HBV را دارند(10).
اگرچه در ایران گزارشات و آمار موارد عفونت و بیماری HBV نمایه واقعی شیوع و بروزعفونت نمی باشد ولی مطالعات متعددی جهت برآورد شیوع HBV در گروه های جمعیتی مختلف و در مناطق گوناگون کشور انجام شده است(6-8و11).
واکسن بسیار موثر HBV از اوایل دهه 1980 وارد بازار مصرف گردید.در جوامعی که واکسیناسیون فعال همگانی بر علیه HBV، در کودکان و گروه های پر خطر انجام شد اپیدمیولوژی عفونت HBV تغییر و شواهد مبنی بر کاهش موارد عفونت مزمن و عوارض وابسته به آن نمایان گشت(3،4). جمهوری اسلامی ایران پس از پذیرش توصیه WHO (12) و بکارگیری آن از سال 1993، واکسیناسیون رایگان همگانی نوزادان و شیر خواران و واکسیناسیون داوطلبانه و رایگان پرسنل بهداشتی-درمانی و گروه های پرخطردر کسب عفونت HBV را در دستور کار خویش قرار داده و در حال حاضر نیزبا پوشش مناسب (>94 درصد) در نوزادان و شیرخواران ادامه دارد(9).
HBV ذره ای کروی با اندازه 22 نانومتر و یک نوع ویروس از گروه هپادنا ویروس هاست که DNA آن به صورت حلقوی و دو رشته ای ناقص حاوی2/3 کیلوباز است و چهار ناحیه S,C,X,P جهت بیان ژن دارد(13و14)
اتصال ویروس به غشاء سلول کبدی از طریق پروتئین سطحی Pre-S انجام میشود(15). بعد از اتصال به سلول کبدی DNA تبدیل به یک حلقه بسته و دو رشته ای کامل میشود که تحت عنوان covalently closed circular DNA (cccDNA) نامیده شده و این تبدیل بوسیله آنزیم DNA پلیمراز میزبان انجام می شود(16).
ویروس هپاتیت B استراتژی تکثیری شبیه به رتروویروس ها دارد (نسخه برداری معکوس از RNA به DNA ). به همین دلیل ریشه کنی عفونت ویروس هپاتیت B به خاطر DNA بادوام، مدور بسته و کوالانسی (cccDNA )که در هسته هپاتوسیت ها استقرار یافته است، مشکل می باشد. DNA ویروس HBV در ژنوم میزبان جا می گیرد. پروتئین های ویروسی با اهمیت از منظر بالینی شامل پروتئین پوششی، آنتی ژن سطحی هپاتیت B (HBsAg یا Hepatitis B surface Antigen )، پروتئین ساختاری نوکلئوکپسیدی هسته ای Hepatitis B core Antigen) یا HBcAg) وآنتی ژن e (HBeAg یا Hepatitis B e Antigen ) هستند. HBeAg یک پروتئین نوکلئوکپسیدی محلول و نشانه ی تکثیر ویروسی فعال است و همراه با سطوح سرمی DNA ویروس HBV یک صد هزار تا یک میلیون واحد بین المللی در میلی لیتر یا بیشتر است. HBsAg شناساگر عفونت با ویروس هپاتیت B می باشد و آنتی بادی بر علیه آنتی ژن سطحی دلالت بر بهبودی است(17). ناقلین بدون علامت بزرگترین گروه عفونت مزمن HBV را تشکیل می دهند. ناقل مزمن HBV به مواردی اطلاق می شود که شاخص سرولوژیک HBsAg در خون آنها حداقل 6 ماه پایدار باشد(126). ناقل غیر فعال HBsAg با عدم وجود HBeAg و وجود anti-HBe ، سطح کم یا غیر قابل شناسایی HBV DNA ،سطح طبیعی آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) و فیبروز خفیف، عدم وجود یا وجود ضایعات اندک نکروتیک و التهابی و یا حتی هیستولوژی طبیعی کبد در بیوپسی مشخص می شود. 40-15 درصد ناقلین دچار عوارض عفونت مزمن می شوند(127). گرچه بیشتر ناقلین مزمن سالها آلوده باقی می مانند و عفونت تا آخر عمر شایع است اما در 2-1 درصد ناقلین مزمن عفونت فعال خاتمه یافته و HBsAg منفی می شود. ناقلین HBsAg از 1/0 تا 20 درصد در جمعیت های مختلف جهان فرق می کنند. میزان بروز ناقل HBsAg به میزان بروز و سن عفونت اولیه و سایر عوامل میزبانی و ویروسی بستگی دارد.در افراد ساکن نواحی با شیوع بالا، خطر ایجاد سیروز و HCC بالاتر است و درمان این بیماران با اثبات تکثیر فعال ویروس و هپاتیت مزمن باید صورت گیرد چون پاک سازی خودبخود ندرتا اتفاق می افتد(126). با شناسایی شاخص های فعالیت ویروس از جمله HBeAg و همچنین تست های کبدی در افراد ناقل قبل از مزمن شدن کامل بیماری و ایجاد علائم نارسایی ممکن است بتوان در جلوگیری از پیشرفت بیماری و درمان هپاتیت B موفقیت نسبی بدست آورد. HBeAg به عنوان شاخص تکثیر فعال ویروس HBV و عفونت زایی آن معمولا با شاخص های تکثیری دیگر ویروس مثل DNA و DNA پلیمراز ویروس در سرم همراه می باشد. تقریبا در تمام موارد فعال بیماری HBeAg مثبت می شود مگر در موتانت های precore که در عین منفی بودن HBeAg فرد در مرحله تکثیری ویروس و HBV DNA مثبت هستند(127). برای هر دو نوع هپاتیت B مزمن HBeAg مثبت و منفی سطح HBV DNA با سطح آسیب کبدی و خطر پیشرفت بیماری ارتباط دارد. از میان افراد HBeAg منفی تعدادی دچار عفونت با انواع جهش یافته ویروس هپاتیت هستند. در این نوع شانس حملات دوره ای تشدید علایم و افزایش ترانس آمینازها در آن بیشتر است(126). تست های آزمایشگاهی برای اثبات وجود هپاتیت ویروسی شامل ALT به دلیل اختصاصی تر بودن برای پارانشیم کبد و سپس AST و ALP می باشد.برای بررسی بیماران مبتلا به هپاتیت مزمن ویروسی و تعیین شدت فعالیت بیماری باید از تستی استفاده کرد که ویژگی بالاتری داشته باشد. افزایش میزان آمینوترانسفرازها در هپاتیت مزمن B نسبتا کم است اما ممکن است بین 100 تا 1000 واحد در نوسان باشد. در بیماران با هپاتیت مزمن B و فعالیت آمینوترانسفراز طبیعی در عدم حضور HBeAg آزمایشات سریال در طول زمان برای تشخیص ما بین ناقل غیر فعال و حالت مزمن HBeAg منفی که فعالیت نکروزی التهابی ویروسی نوسانی دارند نیاز است(128).
امکان پیشرفت عفونت مزمن HBV به سیروز و نارسایی کبدی و یا کارسینوم هپاتوسلولارطی چند دهه وجود دارد بطوریکه حدود نیمی از موارد سیروز و بیش از نیمی از موارد هپاتوسلولار کارسینوم در سطح جهان ناشی از عارضه طولانی مدت عفونت مزمن HBV می باشد(3). هپاتوسلولار کارسینوم یا HCC پنجمین گونه شایع از تومورهای بدخیم و سومین علت عمده مرگ و میر مرتبط با سرطان است(18و19). بنابراین، تشخیص زود هنگام برای بهبود میزان بقای بیماران بسیار مهم است. نسبت ابتلا به هپاتوسل کارسینوما در بیماران مزمن عفونت HBV ، 25 تا 35 برابر افراد غیر آلوده به HBV است و در کسانی که آلوده به هر دو ویروس HBV و HCV می باشند احتمال سرطان کبد 130 برابر بیشتر از افراد غیر آلوده است. میزان مرگ و میر سالانه از بیماری های حاصله از HBV در دنیا 2/1 میلیون نفر می باشد. (20)
گر چه مکانیسم های مولکولی بروز HCC تا حد زیادی مشخص نیست، بسیاری از فاکتورهای آسیب شناختی، ژنتیکی و مولکولی که منجر به سرطان هپاتوسلولارها می گردد شناسایی شده اند. کشت های اولیه این ویروس در هپاتوسیت های کبد اردک و دارکوب صورت گرفت و مشاهده شد این پرندگان به علت کارسینومای کبدی (HCC) به دنبال HBV تلف می شدند. در این حیوانات هپاتیت های مزمن B و انهدام سلول کبدی موجب ترانسفورماسیون هپاتوسیت ها می شود و انتگراسیون HBV-DNA به DNA هپاتوسیت ها و ناپایدار شدن HBV-DNA در مقابل پرتئین های HBX که دارای فعالیت ترانس آکتیواتور بوده و در نهایت موجب بالا بردن رشد ژن ها می شود تکثیر فنوتیپ های تکثیر شونده HBV را بالا برده و در نهایت موجب جهش و موتاسیون در قسمت هسته می شود که یک عامل خطر برای بروز هپاتوسل کارسینوما می باشد. تغییر شکل التهاب مزمن کبدی به فیبروز کبد به مقدار زیادی خطر هپاتوسل کارسینوما را افزایش می دهد به طوری که 75 تا 85 درصد این تومورها در سیروز کبدی تظاهر می نماید(21).
در پیشرفت بیماری در هپاتیت مزمن B عواملی مثل سن بیمار، مصرف سیگار، الکل و مصرف غذاهای حاوی آفلاتوکسین و هربالیسم موثر است. فعال شدن تکثیر ویروس HBV از طریق مکانیسم های کارسینوژن ممکن است موجب آغاز ترانسفورماسیون بدخیمی گردد. این سیر به طرف بدخیمی از طریق قرار گرفتن DNA ویروس در ژنهای مهار کننده تومور و یا با انتگراسیون DNA ویروس موجب افزایش پروتئین ترانس اکتیواتور آنتی ژن X ویروس B شده و ترانسفورماسیون به طرف بدخیمی تظاهر می نماید(22).
مطالعات متعدد نشان داده که فراوانی آنتی ژن e در بیماران هپاتوسل کارسینوما در کمترین مقدار، در میان بیماران هپاتیت مزمن بالاترین و در بیماران سیروتیک در حد وسط می باشد(22). ریسک هپاتوسل کارسینوما در مردان HBsAg مثبت و HBeAg مثبت 60 برابر نسبت به افراد غیر آلوده بالاتر است(23). در کسانی که HBV-DNA آنها مثبت است به طور چشمگیری ابتلا به HCC بالاتر است. نقش آنتی ژن e در چرخه زندگی HBV مورد بحث است. در حیوانات وجود آنتی ژن e برای تایید هپاتیت مزمن ضروری است. بروز کانسر کبد بدنبال هپاتیت مزمن B یک روند چند فاکتوری لازم دارد: تغییرات التهابی مزمن یک محیط شدیدا کانسروژن برای هپاتوسیت ها می سازد و تولید سایتوکاین های التهابی و تغییرات اکسیژنی می توانند موتاسیون های کروموزومی تولید نمایند. بعلاوه کبد یک ارگان سم زدا بوده و سموم ایجاد شده یا از محیط انسان و یا سموم حاصله از متابولیسم مواد را سم زدایی می نماید و این عوامل یک موتان DNA سلول کبدی می باشند(23). سیستم ایمنی موجب مرگ هپاتوسیت های آلوده به HBV می شود و در مقابل تعداد زیادی هپاتوسیت در کبد ساخته می شود این تبادل سلولی صد تا هزار برابر بیشتر از حالت طبیعی کبد می باشد. هپاتوسیت های پرولیفره موجب تجمع عوامل موتاژن در کبد می شود و سرانجام ترانسفورماسیون پدیدار می شود. بسیاری از تغییرات ژنتیکی می توانند موجب تغییرات کارسینوماتوز باشند و مجموعه این تغییرات در کبد، ضایعات کبدی را در مراحل مختلف موجب می شود(23). هپاتوتوکسین های محیطی مثل الکل و آفلاتوکسین موجب افزایش بروز کانسر کبد می شوند و بسیاری از تغییرات راجعه در جریان آلودگی به HBV مزمن می تواند در بروز کانسر کبد نقش داشته باشند(24و25)
دوره پیشرفت هپاتوسلولار کارسینوم (HCC) به لحاظ کلینیکی بسیار سریع است، میزان پاسخ به درمان های دارویی ضعیف بوده و پیش آگهی ضعیفی دارد(26). عوامل خطر اصلی برای HCC عبارتند از: عفونت هپاتیت B (HBV) و یا C (HCV) ، بیماری کبدی ناشی ازالکل (ALD)، بیماری کبد چرب غیر الکلی (NAFLD)، سیروز اولیه صفراوی ، قرار گرفتن در معرض مواد سرطان زای محیطی به خصوص آفلاتوکسین و بیماری های متابولیکی با منشا ژنتیکی(33-27) چاقی نیز به عنوان یک عامل خطر مستقل برای پیشرفت HCC در بیماران مبتلا به سیروز الکلی شناسایی شده است(34). در واقع، سیروز ناشی از هپاتیت B و C عمده ترین عامل خطر بروز HCC در نظر گرفته شده زیرا بسیاری از بیماران مبتلا به عفونت مزمن هپاتیت برای یک دوره زمانی طولانی بدون علامت باقی می مانند و ناگهان با عارضه پیشرفته سیروز کبدی مواجه می شوند(35و36) عدم وجود نشانگرهای پیش بینی کننده مناسب، منجر به بروز غیر قابل پیش بینی و تهاجمی سیروز کبدی در بیماران مبتلا به عفونت مزمن هپاتیت B شده و این مسئله زمینه تشخیص دیر هنگام HCC، پیشرفت بیماری و همچنین پیش آگهی ضعیف را فراهم کرده است. در حال حاضر، به لحاظ بالینی آلفا فتوپروتئین (AFP) شایع ترین نشانگر بدخیمی های اولیه کبد است که عمدتا در ترکیب با اکوگرافی کبدی برای تشخیص HCC در بیماران مبتلا به سیروز به کار می رود. با این وجود در برخی حالات بالا رفتن میزان AFP موقتی است و در مواردی هم در صورت بروز نکروز بدون تبدیل به HCC مقدار AFP افزایش میابد(37).
از آنجا که تشخیص زود هنگام HCC در بهبود و بقای بیماران HBV بسیار مهم است، شناسایی مارکرهای بیولوژیکی جدید و قابل اعتماد جهت مدیریت مناسب و صحیح در بروز HCC ، عود و متاستاز این بدخیمی ضروری است. همزمان با پیشرفت سرطان کبد، یکی از دلایل اصلی بالا رفتن نرخ مرگ و میر در بیماران مبتلا به HCC فقدان گزینه های درمانی موثر است، به ویژه برای کسانی که مبتلا به بیماری پیشرفته هستند. اگر چه در برخی از بیماران مبتلا به HCC جراحی می تواند منجر به کنترل طولانی مدت در مراحل اولیه پس از تشخیص شود اما نرخ عود مجدد همچنان بالا است (حدود 50٪ در3 سال)(38). علاوه بر این، با توجه به ماهیت بدون علامت بودنHCC در مراحل اولیه، عدم آگاهی و وجود استراتژی های غربالگری ضعیف ، حدود 80 درصد از این بیماران معمولا با بیماری پیشرفته و یا غیرقابل برگشت به پزشک مراجعه می کنند(39). این بیماران به طور کلی پیش آگهی بسیار ضعیفی دارند و درمان هایی مانند شیمی درمانی، پرتو درمانی، ایمونوتراپی یا هورمون درمانی، عمدتا به عنوان تسکین دهنده با میزان بقای نسبی 5 ساله (تنها در 7 درصد بیماران) استفاده می شود(40) و این امر نیاز به روش های نوآورانه جهت تشخیص، پیش آگهی و درمان سرطان کبد را برجسته می سازد. در این زمینه، الگوهای مالتی فاکتوریال شامل نشانگرهای متعدد سرولوژیکی و ایمونوهیستوشیمی جهت تشخیص HCC، عود و متاستاز، نه تنها برای تشخیص و پیش آگهی، بلکه برای مدیریت بالینی بیماران HCC به عنوان یک ابزار مفید به نظر می رسند. این نشانگرها نه تنها در مبحث پیش آگهی و یا عود بیماری مد نظر هستند بلکه در اتخاذ روش درمانی مناسب و اجرای مداخلات درمانی نیز مثمر ثمر می باشند.
در حال حاضر، تشخیص HCC عمدتا بر اساس ارزیابی هیستوپاتولوژیک بافت کبد، همراه با محاسبه آزمایشگاهی شاخص هایی از جمله شاخص آسیب کبدی (آلانین آمینوترانسفراز و آسپارتات آمینوترانسفراز)، شاخص سنتز کبدی )آلبومین، پروترومبین، بیلی روبین)، شاخص کلستاز(آلکالن فسفاتاز و گاما گلوتامیل ترانس پپتیداز) و در نهایت، ردیابی نشانگرهای تومور و تجزیه و تحلیل ابزاری، از جمله سونوگرافی کبد، توموگرافی کامپیوتری و رزونانس مغناطیسی هسته ای (NMR) انجام می شود. برخی از نشانگرهای تشخیصی تومور HCC، مانند آلفا فتوپروتئین (AFP) و مشتقات کربوهیدراته آن (AFP-L3) و ترکیب دکربوکسی پروترومبین (DCP) در حال حاضر به منظور تعیین میزان پیشرفت تومور و غربالگری سرطان در مراحل اولیه استفاده می شوند(41). سایر بیومارکرها مانند بعضی از فاکتورهای رشد (VEGF,TGFβ1,EGF,EGFR) نیز برای تشخیص و همچنین محاسبه میزان پیشرفت HCC استفاده می شود(44-42). با این وجود، هرکدام از نشانگرهای موجود به تنهایی برای پیش بینی بیماری ضعیف عمل می کنند. در حال حاضر کاربرد بیومارکرهای سرولوژیکی و نشانگرهای ایمونوهیستوشیمی برای HCC به تنهایی چندان مفید نیست. بنابراین، کشف و اعتبار سنجی نشانگرهای زیستی ویژه برای HCC بسیار ضروری است و البته باید در نظر داشت که این نشانگرها باید تا حد زیادی منجر به کاهش نتایج منفی کاذب و در نتیجه جلوگیری از تشخیص نادرست گردد.
آلفافتوپروتئین (AFP)، یک گلیکوپروتئین به وزن 70 کیلودالتون است که توسط سلول های جنینی کبدی در ناحیه کیسه زرده و روده جنین سنتز می شود. در دوران جنینی AFP در هپاتوسیت ها و سلول های اندودرم کیسه زرده بیان شده و پس از تولد و با رسیدن به بلوغ سطح بیان این پروتئین کمتر می شود. مقدار AFP هنگام بازسازی هپاتوسیت ها، هپاتوکارسینوژنز و کارسینوم های جنینی زیاد می شود. عملکرد بیولوژیکی این پروتئین در جنین و کارسینوژنز و در بافت های بالغ بدرستی مشخص نیست اما بدلیل شباهت ساختاری AFP با آلبومین، عملکردی به عنوان حامل لیگاندهای متعدد از قبیل بیلی روبین، استروئیدها، اسیدهای چرب و انواع داروها مطرح شده است. ابتدایی ترین ارزیابی سرولوژیک برای تشخیص و پیگیری بیماران HCC یر روی AFP انجام می شود.AFP که یک پروتئین جنینی در ارتباط با توموراست، خالص سازی، کلون و تعیین توالی شده و مدتهاست که به عنوان یک استاندارد طلایی و نشانگر تومور در تشخیص های بالینی استفاده می شود. حساسیت تست اندازه گیری AFP در سرم معادل 65-41 درصد و ویژگی آن 94-80 درصدگزارش شده است(کات آو معادل 20 نانوگرم/میلی لیتر)(45). این پروتئین در موارد زیر استفاده می شود: 1) غربالگری و تشخیص هپاتوکارسینوم
در بیماران مستعد ابتلا به HCC همزمان با انجام سونوگرافی کبد 2) نشانگر تعیین کننده میزان پیشرفت تومور 3) ارزیابی میزان پاسخ به درمان در بیماران HCC، به عنوان یک شاخص پیش آگهی 4) تعیین فاز HCC (47و46).
غلظت AFP در سرم بیماران HCC زیاد می شود اما این افزایش همیشگی نیست. ممکن است در ابتدا میزان AFP در مراحل اولیه HCC زیاد شده و سپس کم شود یا حتی ممکن است پیش از گسترش بیماری به مقادیر نرمال برسد(48). همچنین در صورت بروز عفونت هپاتیت ویروسی مزمن و یا حاد و نیز در بیماران سیروتیک مبتلا به HCV مقدار AFP افزایش میابد. به طور کلی، چنانچه به طور مداوم غلظت AFP سرم بیش از 500 نانوگرم / میلی لیتر باقی بماند نشان دهنده HCC است و غلظت های پایین تر که تنها بصورت گذرا و موقت است اغلب در بیماری های خوش خیم کبد قابل مشاهده است. وجود ریسک فاکتورهای HCC ازقبیل بروز سیروز کبدی همراه با افزایش غلظت AFP تایید کننده گسترش HCC است(49). با این وجود نمی توان با ارزیابی غلظت AFP در سرم، اندازه تومور یا مرحله بروز آن و میزان پیشرفت بیماری را شناسایی کرد، در این راستا تنوع قومیت نیز تاثیرگذار است. در برخی موارد مبتلا به HCC افزایش AFP هرگز دیده نمی شود(50).
گلایپیکان 3 (GPC3) نوعی پروتئوگلیکان از خانواده هپاران سولفات است که برهمکنش آن با فاکتورهای رشد منجر به تنظیم رشد سلول، تکامل، تمایز و مهاجرت آنها می شود. این پروتئین از طریق زوائد لنگرمانند گلیکوزیل فسفاتیدیل اینوزیتول خود به غشاء سلول متصل می شود. میزان بیان mRNA پروتئین GPC3 در بافت توموری HCC در مقایسه با بافت کبد سالم و کبد بیماران مبتلا به ضایعات کبدی خوش خیم بیشتر است. بیان GPC3 در سرم افراد HCC نیز (چه در سطح پروتئین و چه در سطح mRNA) بسیار بیشتر از افراد سالم و مبتلایان به ضایعات خوش خیم است به نحوی که در 53-40 درصد بیماران HCC (تست AFP,DCP سرمی مثبت) و 33 درصد بیماران HCC (تست AFP,DCP سرمی منفی) قابل مشاهده است (51و52) و موجب تحریک رشد و گسترش HCC از طریق تنظیم مسیر پیام رسانی Wnt می شود(53). مطالعات نشان داده ناحیه N –ترمینال GPC3 محلول (sGPC3) موجب افزایش حساسیت این پروتئین (72 %) در مقایسه با AFP (50 %) جهت تشخیص HCC می شود(54). در محیط in vitro و in vivo ، sGPC3 که فاقد ناحیه GPI است، با حذف چندین فاکتور رشد تومورزا از سطح سلول های HCC از قبیل Wnts، فاکتور رشد کبدی (HGF) و فاکتور رشد اندوتلیال عروقی (VEGF)، رشد و گسترش HCC را مهار می کند(55). هیچگونه ارتباطی میان سطح بیان GPC3 اندازه تومور، فاز و همچنین غلظت AFP مشاهده نشده است. حساسیت و ویژگی تشخیصی این پروتئین برای HCC به ترتیب 77 و 96 درصد است(56). با توجه به این نتایج GPC3 می تواند مارکر قدرتمندی برای تشخیص HCC باشد.
پروتئین شوک حرارتی 70 (HSP70) یک ترکیب بسیار حفاظت شده درپاسخ به استرس است. نقش این پروتئین نگهداری و حفاظت سلول ها و تحریک آنها برای تعمیر آسیب های ناشی از انواع محرک هاست. HSP70 تحت شرایط فیزیولوژیکی خاص و شرایط استرس زا از قبیل مواجهه با کارسینوژن ها بیان می شود. مطالعات ایمونوهیستوشیمی نشان می دهد میزان بروز HSP70 در بافت کبد HCC 56.3 درصد است(57). میزان رنگ پذیری سلول ها نسبت به HSP70 با اندازه تومور، گسترش ورید پورتال و میزان پیشرفت تومور بستگی دارد. در هپاتوکارسینوم های تهیه شده در محیط کشت، افزایش بیان HSP70 منجر به تحریک رشد تومور و بروز متاستاز شده است(58). ممکن است HSP70 به عنوان نشانگر تشخیصی HCC به کار رود. بیان این پروتئین در 282 نفر از 392 فرد مبتلا به HCC (71.9درصد) مشاهده شده در حالیکه در میان 115نمونه کبدی غیر نئوپلاستیک فقط در 14 مورد بیان HSP70 مشاهده شد (P<0.001) (59). حساسیت و ویژگی این پروتئین در تشخیص HCC به ترتیب 57.5 و 85 درصد است(60). بیان HSP70 با میزان تمایز و آپوپتوز سلول های تومور نیز مرتبط است. این ترکیب از طریق تثبیت سیکلین D1 موجب تحریک رشد سلول های تومور و با مهار مسیر p53 موجب سرکوب آپوپتوز سلول های تومور می شود(61و62) و بدین ترتیب HSP70 می تواند مارکر قوی برای تشخیص HCC باشد.
گلوتامین سنتتاز (GS) آنزیمی است که با تبدیل گلوتامین به گلوتامات و آمونیاک نقش کلیدی در متابولیسم نیتروژن دارد. این آنزیم در نواحی مرکز لوبولار کبد بیان می شود(63). گلوتامین اصلی ترین منبع انرژی سلول های تومور است. بررسی های ایمونوهیستوشیمی نشان داده است در سلول هایی که میزان پروتئین های حاوی اوبی کوئیتین افزایش یافته تجمع GS نیز زیاد است، همچنین با شروع یک ضایعه پیش سرطانی در کبد و تبدیل آن به HCC به تدریج مقدار GS نیز افزایش میابد(64). GS عمدتا در هپاتوسیت های اطراف سیاهرگ های ترمینال کبدی بیان می شود. در موارد سیروتیک، نواحی مثبت GS کمتر از 10 درصد است و معمولا سطوح رنگ آمیزی شده بالاتر از 10 درصد را سطح بیان مناسب GS برای تشخیص HCC گزارش کرده اند(65).
مطالعات زیادی در رابطه با ژن پروتئین P53 و کارسینوم های کبدی در انسان و حیوان انجام شده است. P53 یک ژن سرکوبگر تومور است(66). این ژن کد کننده فسفوپروتئین های هسته ای است که تمایز و تکامل طبیعی سلول ها، تعمیر DNA و مرگ برنامه ریزی شده سلول (آپوپتوز) را کنترل می کنند(67و68). پروتئین P53 طبیعی نیمه عمر کوتاهی دارد و میزان بیان آن بسیار کم است، این مسئله مانع تشخیص آن توسط روش های ایمونوهیستوشیمی در شرایط عادی می شود(69). با این وجود مواجهه سلول با دسته ای از فاکتورهای استرس زا منجر به افزایش سنتز و پایداری گونه طبیعی پروتئین P53 و یا حتی افزایش تولید گونه جهش یافته آن با نیمه عمر طولانی تر شده و این رخداد تشخیص پروتئین به روش ایمونوهیستوشیمی را آسان می سازد(66-70). جهش P53 در افراد مبتلا به HCC بسیار مرسوم و در نواحی مختلف جغرافیایی متفاوت است(10 تا 60 درصد). جهش در P53 با اندازه تومور، فاز تومور و سن بیمار ارتباط دارد(71-75). در برخی موارد مبتلا به HCC نیز سطح بیان P53 بدون بروز هیچگونه جهشی در ژن آن افزایش میابد(73و76).
آرژیناز یکی از آنزیم های چرخه متابولیسم اوره است که دارای دو ایزوفرم می باشد. آرژیناز 2 ایزوفرم فعال در کلیه ها و پانکراس است و میزان بیان آن در کبد بسیار ناچیز است(77و78). آرژیناز 1 (Arg-1) یک متالوآنزیم دو هسته ای حاوی منگنز است که طی چرخه متابولیسم اوره، هیدرولیز آرژنین به اورنیتین و اوره را کاتالیز می کند. مطالعات ایمونوهیستوشیمی نشان می دهد Arg-1 با ویژگی بسیار بالا در بافت طبیعی کبد بیان می شود(79) و عمدتا در هپاتوسیت های پری پورتال تجمع میابد(80). مطالعات اخیر نشان دهنده کاهش بیان این آنزیم در ضایعات سیروتیک و HCC است(81و82) مطالعات انجام شده نشان می دهد Arg-1 یک مارکر با حساسیت و ویژگی مناسب برای شناسایی و تشخیص انواع ضایعات خوش خیم و یا بدخیم هپاتوسیت هاست(83و84).
تکثیر سلولی نقش مهمی در مراحل مختلف روند سرطان ایفا می کنند. بررسی حضور پروتئین های مربوط به چرخه سلولی ممکن است اطلاعات مهمی در مورد رفتار بیولوژیکی یک تومور نشان دهد(85). یکی از رایج ترین نشانگرهای ارزیابی میزان تکثیر سلولی پروتئین Ki-67 است که یک آنتی ژن هسته ای مرتبط با تکثیر سلول است. تجزیه و تحلیل چرخه سلولی نشان داده که آنتی ژن Ki-67 در سلول طی مراحل G1، S و G1-M بیان می شود، اما در مرحله G0 از چرخه سلولی بیان نمی شود(86و87). بیان Ki-67 در HCC ارتباط نزدیکی با میزان رشد تومور دارد (88) و یک ابزار ارزشمند در درک کارسینوم سلول کبدی است. ارزیابی Ki67 در بحث شاخص تکثیر کبدی به عنوان یک ابزار مفید برای تجزیه و تحلیل بازسازی کبد و سرطان، شناسایی بیماران سیروتیک مستعد ابتلا به HCC ، افتراق و تشخیص بین بافت کبد نرمال، بازسازی شده و کبد نئوپلاستیک و پیش بینی بقا بیماران HCC معرفی شده است(89و90).
آنتی بادی هپاتوسیت پارافین 1 (Hep Par1) یک آنتی بادی مونوکلونال جدید است و در تشخیص کربامیل فسفاتاز که آنزیم کاتالیز کننده چرخه اوره است استفاده می شود. برخی مطالعات نیز بیان کرده اند اپی توپی که توسط HepPar-1 شناسایی می شود یک جزء غشایی میتوکندری سلول های کبدی است و به نظر نمی رسد در میتوکندری دیگر بافت های طبیعی وجود داشته باشد(91و92). Hep Par1 با هپاتوسیت های طبیعی و نئوپلاستیک واکنش می دهد و منجر به رنگ پذیری مشخص گرانول های سیتوپلاسمی سلولهای کبدی می شود. اخیرا این مارکر جهت تشخیص HCC مورد توجه قرار گرفته است(93). در طول دهه گذشته، HepPar-1، به طور فزاینده ای به عنوان یک نشانگر مثبت برای افتراق هپاتوسیت ها معرفی شده است(94-98). Hep Par1 یک آنتی ژن جنینی و یا مرتبط با تومور نیست زیرا هم در بافت کبد سالم جنین و هم در کبد سالم بالغ بروز دارد. در برخی موارد HCC کاهش بیان همراه با افتراق پایین هپاتوسیت ها گزارش شده است(99). در مطالعاتی که بر روی افراد مبتلا به HCC انجام شده مشخص شده است کهHep Par1 در 82 تا 100 درصد بالغین مبتلا به HCC بیان می شود(99-102) و ویژگی معادل 90 درصد و حساسیتی برابر با 75 تا 90 درصد برای آن محاسبه شده است (99 و 103و91و92و104-108).
کبد بزرگترین غده بدن بوده و وظیفه اش ذخیره مواد غذایی دریافت شده از گوارش و تغییر مواد غذایی به مواد شیمیایی برای ذخیره در بدن است و هرگونه تغییر در مسیرها و چرخه های متابولیسم سلولی در بافت کبد قابل شناسایی و ردیابی است. یافته های هیستولوژیک هپاتیت ویروسی و کارسینوم کبدی HCC عبارتند از:
1 ـ بهم خوردن نظم لوبول های کبدی
2 ـ دژنراسیون ائوزینوفیلی و حالت بالونی
3 ـ نکروز لوبول های کبدی
4 ـ انفیلتراسیون سلول های منونوکلئار در پارانشیم کبدی و پورت
5 ـ درجات متغیری از کولستاز
6- سیروز کبدی، فیبروز کبدی
بهم خوردن نظم لوبول ها به حالتی اطلاق می گردد که وضعیت طبیعی نظم طناب های سینوزوئیدی، بهم خورده و همراه با دژنراسیون و رژنراسیون و یامرگ سلولهای کبدی است. سلول های کبدی دو نوع دژنراسیون نشان می دهند: دژنراسیون بالونی (که در آن سلول ها متورّم شده و سیتوپلاسم، رقیق می شود) و دژنراسیون ائوزینوفیلیک (که در آن سلول ها چروکیده شده و رنگ قرمز پیدا کرده و بیشتر زاویه دار میشوند). نتیجه این دژنراسیون ائوزینوفیلی، تشکیل هیالین بادی آزاد می باشد. هپاتوسیت ها ممکن است حالت کدر پیدا کنند و مرز آنها محو شده و با واکنش التهابی مواجه گردند. سلول های کوپفر، بزرگ شده و افزایش می یابند. نواحی انفیلتراسیون سلول های لنفوسیت هم در پارانشیم و هم در تریاد پورت، شایع است ولی سلول های پلی مرفونوکلئار، زیاد نیستند و تعداد کمی پلاسماسل و ائوزینوفیل نیز یافت می شود. در صورتی‌که تعداد زیادی پلاسماسل یافت گردد حاکی از وجود هپاتیت مزمن خواهد بود. افزایش شدید سلول های ائوزینوفیل، می تواندناشی از اعتیاد داروئی و یا هپاتیت داروئی باشد.کولستاز که با رنگ گرفتن هپاتوسیت ها با صفرا و یا انسداد صفراوی، مشخص می شود، ممکن است در نمونه های بیوپسی کبد دیده شود و با میزان افزایش بیلیروبین، رابطه مستقیم دارد. در هپاتیت ویروسی ، نکروز سلولی به صورت فوکال و نقطه ای میباشد. اشکال شدید هپاتیت، ممکن است همراه با تجمع و یا نکروز پل مانند بین نواحی پرتال و یا از زون پرتال به رگ مرکزی و یا نکروز چند لوبولی و یا نکروز وسیع باشد. نکروز پل مانند، در خلال هپاتیت ویروسی، بطور جدی این احتمال را مطرح می کند که بیماری ممکن است به طرف سیروز نکروتیک برود. نکروز چند لوبولی یا وسیع، در رابطه با هپاتیت شدید یافت می شود.(1)
روش های بافت شناسی بدلیل استناد پزشکی قانع کننده شان یکی از موثرترین ابزارها در تشخیص بافت های طبیعی و غیر طبیعی می باشد. سونوگرافی کبد و سی تی اسکن شکم، گاهی برای رد تومور در کبد و یا شرایط دیگر مانند سنگ کیسه صفرا و یا تومورهای عامل انسداد مجاری استفاده می شود. این آزمایشات همچنین می تواند اطلاعات مهم بصری در مورد کبد مانند اندازه، شکل، زخم و داده های مهم آناتومی بدن انسان فراهم کند. سی تی اسکن کبد برای تشخیص صدمات ناشی از ضربه به کبد بسیار مفید است. با آگاهی اﺯ ساختاﺭ کارکرد ﻄبیعی کبد می‌توان بیماری‌های کبد و تظاهر بالینی آنها را درک کرد.توجه به آناتومی کبد، مجاری صفراوی و هپاتوسیت‌ها برای فهم تظاهرات بالینی بیماری‌های کبدی لازم است. خون رسانی دوگانه به کبد که منحصر به کبد است وشامل سیستم وریدی پورت می‌شود کبد را به مشابه یک صافی در سر راه خون وریدی احشای شکمی در آورده‌است. این امر باعث می‌شود که کبد به طور ثانویه به تعدادی از بیماری‌های خارج کبدی مبتلا شود و مکان نسبتاٌ شایعی برای متاستاز تومرها باشد. به علاوه توجه به آناتومی کبد جهت درک تظاهرات بالینی مهم هیپرتانسیون پورت که از عوارض شایع بیماری‌های مزمن کبدی است و بر اثر تغییر شکل عروق ریز داخل کبدی در نتیجه ایجاد اسکار وبازسازی مجدد به وجود می‌آید بسیار با اهمیت است . در این موارد شواهدی همچون بزرگ شدن طحال و خون ریزی گوارشی و تجمع مایع آسیت در حفره شکمی و نشانه‌های آنسفالوپاتی پورت سیستمیک وجود دارد. سلولهای کبدی بسیاری از ترکیبات بالقوه سمی درونزاد و برونزاد را از طریق اکسیداسیون احیا و کونژوگاسیون توسط آنزیمهای متعدد شبکه آندوپلاسمی تغییر می‌دهند. طی کونژوگاسیون مواد اولیه با تبدیل کرن مواد غیر محلول در آب به محلول در آب عموماٌ دفع کبدی آنها را تسهیل می‌کند. بنابر این تعجب اور نیست که بیماری‌های پارانشیمی کبد ممکن است سبب هایپربیلی روبینمی و یرقان شوند. دیگرخصوصیت بیولوژی سلولی هپاتوسیتها که در بروز بیماری‌ها نقش دارد استعداد کبد برای تکثیر و بازسازی است. گرچه در پارانشیم طبیعی کبد اشکال میتوزی ناچیزی مشاهده می‌شود باز سازی سریع که شامل تکثیر و هیپرتروفی سلولی است به دنبال برداشتن تجربی بخشی از کبد حیوانات و آدمی مشاهده می‌شود(129).
بهترین روش مطالعه ساختار و مورفولوژی سلول استفاده از روش های میکروسکپی است. در میکروسکوپ الکترونی گذاره (TEM=Transmission EM) با استفاده از امواج الکترونی و ایجاد توان تفکیک بسیار زیاد، پرتوی از الکترون ها به وسیلۀ یک تفنگ الکترونی بر روی یک نمونۀ نازک، هدایت و متمرکز می شوند. TEM می تواند ذرات با قطر 001/0 میکرون را به صورت متمایز نشان دهد(130و131و110). در بررسی حاضر قصد داریم تا اثرات هیستوپاتولوژیک ناشی از HBV و HCC را هم از دیدگاه میکروسکوپ نوری و هم میکروسکوپ الکترونی بر روی بافت های کبدی به صورت توام ارزیابی کنیم، در ضمن با مورفومتری اجزا و ارگانل های بافتی کبد سعی خواهد شد تغییرات ساختاری ارگانل ها مورد ارزیابی و مقایسه قرار گیرد. در این عرصه قصد داریم تغییرات فراساختاری ایجاد شده در هپاتوسیت ها از جمله تغییرات میکروویلی ها، غشا سلول، فضای دیس، هسته هپاتوسیت ها، میتوکندری ها، شبکه آندوپلاسمی خشن و کانالیکول های صفراوی را مورد بررسی قرار دهیم.
در آزمایشگاه های هیستوپاتولوژی به منظور بوجود آوردن امکان تشخیص های بافت شناسی یا آسیب شناسی، مقاطع بافتی را تهیه می کنند. مراحل تهیه نمونه شامل ثابت کردن، آب گیری، قالب گیری، برش برداری (میکروتومی)، رنگ آمیزی و آزمایش میکروسکپی می باشد. ارزیابی دقیق یافته های هیستولوژیک ناشی از HBV و HCC در فرایند تشخیص و مطالعه روند طبیعی بیماری در مبتلایان به HBV مستعد ابتلا به HCC بسیار مهم است. آزمون های شیمیایی متعددی برای اندازه گیری پارامترهای مرتبط با هپاتیت و سرطان وجود دارد. با اینکه این آزمون ها خوب هستند اما در بسیاری از موارد به حجم زیادی از نمونه نیاز است. آزمون های هیستولوژیک روال متعارف دیگری است که در تشخیص و پیگیری روند بیماری موثر است. هرچند دیدگاه این مسیر مبتنی بریافته های کیفی است. ارزیابی دقیق و کمی یافته های هیستولوژیک ناشی از HBV و HCC در بررسی پاتولوژیک و کلینیکال و تشخیص بیماران بسیار مفید خواهد بود(1).
علم استریولوژی به منظور کسب و تجزیه و تحلیل اطلاعات کمی، بر اساس مشاهده مقاطع دو بعدی بافت ها یا تصویر میکروسکوپی آن در فضای سه بعدی به کار می رود. استریولوژی با تکیه بر دانش ریاضی و آمار از تصاویر دو بعدی، اطلاعات سه بعدی استخراج می کند. هدف استریولوژی به دست آوردن اشکال سه بعدی، موقعیت در فضا، حجم و نسبت های حجمی، مساحت سطوح انحنا دار، انحنای سطوح، طول خطوط انحنا دار، اندازه اندامک ها و تعداد ذرات در واحد حجم از طریق بررسی مقاطع می باشد(110و111). بر اساس مطالعات انجام شده تا کنون بررسی استریولوژیک در مورد تغییرات بافت کبد در بیماران مبتلا به HBV مستعد ابتلا به هپاتوسلولار کارسینوم (HCC) در مراحل اولیه بروز HCC صورت نگرفته است، بنابراین نیاز به مطالعه در این حیطه احساس می شود.
ایمونوهیستوشیمی ابزاری توسعه یافته برای بررسی حضور و لوکالیزه کردن بیومارکرهای نشانگر در مقاطع بافتی در سطح پروتئین است. ایمونوهیستوشیمی بیومارکرها اغلب به همراه تکنیک های Polymerase Chain Reaction(PCR) جهت درک نقش بیولوژیکی این نشانگرها در بافت های مبتلا به کار می رود. با استفاده از ابزار ایمونوهیستوشیمی و تکنیک های PCR می توان انواع ضایعات کبدی پیشرفته را از سرطان اولیه کبد (HCC) متمایز کرد، مشخص کردن منشا سلول تومورناشی از متاستاز از HCC، شناسایی مارکرهای پیش آگهی HCC، و طبقه بندی انواع ضایعات هپاتوسلولار نیز توسط این تکنیک ها امکانپذیر است و با پیشرفت هایی که اخیرا در روند شناسایی نشانگرهای ایمونوهیستوشیمی و تکنیک های مولکولی ایجاد شده می توان داده های مفیدی در سطوح ایمونوهیستوشیمی و مولکولی پدید آورد و اقدام به تشخیص و اتخاذ روند درمانی مناسب نمود. با توجه به فواید بیومارکرهای مورد نظر، AFP، GPC3، GS، Hep Par1 ، Arg1 ، HSP70، KI67 و P53 در زمینه تشخیص HCC و با استفاده از ایمونوهیستوشیمی و ابزارهای مولکولی، شواهد امر نشان می دهد استفاده از هر یک از این مارکرها به تنهایی نمی تواند در امر تشخیص به موقع بیماری چندان موثر واقع شوند بنابراین امروزه استفاده از پنل های مالتی مارکر در فرایند تشخیص بیماری بسیار مورد توجه است زیرا نتایج حاصل از چنین الگوهایی منجر به کاهش میزان خطا، افزایش حساسیت و ویژگی آزمون ها به هنگام تشخیص، یافتن بیماران واقعی و کاهش نتایج منفی کاذب می شود. به منظور افزایش دقت تشخیص، یک پانل حاوی سه نشانگر در نمونه HCC توسط Di Tommaso در سال 2007 مورد آزمایش قرار گرفت. آزمونی که این گروه انتخاب کردند حاوی سه بیومارکر GPC3، GS و HSP70 بود. با استفاده از تکنیک های ایمونوهسیتوشیمی و تکنیک های PCR(RT-PCR) حساسیت و ویژگی این آزمون (برای دو مارکر) به ترتیب 70 و 100 درصد گزارش شد. با استفاده از این پانل 3 مارکری، فقط در مقاطع بافتی 11 نفر از 50 بیمار مبتلا به ضایعات دیسپلاستیک بدخیم کبدی (HGDNs) رنگ آمیزی با یک نشانگر بروز یافت در حالیکه در سایر نمونه ها هیچ کدام از دو مارکر دیگر بروز نداشتند. دقت این پنل برای تشخیص افراد مبتلا به HCC گرید یک، در صورت استفاده از هر سه بیومارکر 57 درصد، دو بیومارکر 72.9 درصد و ویژگی 100 درصد برای هر دو حالت گزارش شده است(112و113).
به تازگی، گروه دی توماسو یک پانل 4مارکری (GPC3، GS، HSP70 و CHC ) را همزمان با معرفی یک نشانگر جدید به اسم زنجیره سنگین کلاترین (CHC) در تشخیص HCC به کار برده است. با این الگو دقت آزمون با استفاده از حداقل 2 مارکر در تشخیص ضایعات HCC بزرگ و ضایعات HCC کوچک به ترتیب 97 و 84.3 درصد اعلام شد(114).
مطالعات اپیدمیولوژی نشان می دهد که عفونت مزمن HBV از عوامل عمده بروز HCC می باشد(115و116). شیوع واقعی ابتلا به سرطان کبد در ایران هنوز ناشناخته است اما 80 درصد از موارد مبتلا به این سرطان دارای هپاتیت B می باشند(117و118). سالانه 662000 مرگ به علت ابتلا به سرطان کبد در جهان گزارش می شود. میزان ابتلا به سرطان کبد در شمال آمریکا و اروپای غربی زیر 10 مورد در هر 100000 نفر و در آفریقا و آسیا بین 50-150 مورد در هر 100000 نفر می باشد(119-121). نتایج تحقیقات نشان می دهد که میزان مرگ و میر حاصل از سرطان کبد در ایران در طول سالیان اخیر افزایش داشته است. ایران در منطقه خاورمیانه قرار گرفته است. ناحیه ای که در آن اکثر موارد مبتلا به سرطان کبد در مراحل متوسط یا پیشرفته شناسایی می شوند(122). بالا بودن شیوع موارد سرطان کبد در منطقه خاورمیانه بدلیل شیوع هپاتیت B در این مناطق است(123). مطالعه ای که اخیرا در جنوب ایران انجام شده است نشان می دهد که علت اصلی ابتلا به سرطان کبد هپاتیت B می باشد(124). همچنین برآورد می شود که در ایران حدود 1.5 میلیون نفر به هپاتیت B مبتلا هستند که از این تعداد بیش از 15 تا 40 درصد در معرض ابتلا به سیروز کبدی یا سرطان کبد می باشند(125) و نیز از داده ها چنین بر می آید که میزان ابتلا به سرطان کبد با افزایش سن، افزایش می یابد(124).
نظر به اهمیت این سرطان کشنده در دنیا و با در نظر گرفتن میزان مرگ و میر این سرطان و با توجه به عدم وجود برنامه های غربالگری، تشخیص زودهنگام بیماری، افزایش بروز این سرطان و پایین بودن بقای بیماران مبتلا به دلیل تشخیص بیماری در سطوح پیشرفته این سرطان، قصد داریم در این تحقیق با کمک تکنیک های ایمونوهیستوشیمی ، PCR ، استریولوژی، میکروسکوپ الکترونی و استفاده از یک پانل چند مارکری (8 مارکر)، الگوریتم جدیدی در تشخیص و پیش آگهی بیماران HBV مستعد ابتلا به HCC ارائه دهیم.
نتیجه پژوهشهای پزشکی دردرجه اول روی سلامت جامعه تاثیر گذاشته و نقش بسزایی در همه فعالیت های انسانی دارد. ازجمله مهمترین جنبه های پزشکی تفسیر مناسب و درست داده ها است اما تصمیم گیری درپزشکی توسط کارشناسان خیلی مشکل می باشد زیرا پردازش انبوهی ازداده ها کار دشواری است. دراینجا تشخیص دارای نقش بسیارمهمی می باشد، این اولین مرحله از مجموعه اقدامات درمانی است. خطا دراین سطح می تواند عواقب چشمگیری داشته باشد. یکی از مشکلات اساسی مربوط به بیماران مبتلا به هپاتوسلولار کارسینوما ناشی از HBV عدم تشخیص صحیح این بیماری است که در نتیجه این اشتباه درتشخیص و یا عدم تشخیص در مراحل ابتدایی، فرد حتی ممکن است به عوارضی همچون مرگ دچار شود. برای تشخیص سریع و صحیح بیماری‌ لازم است که بیماری‌ بر اساس یک الگوی از پیش تعیین شده مشخص شود. در این پژوهش سعی بر آن است که نحوه رسیدن به تشخیص صحیح بیماری‌ HCC، با توجه به بیومارکرهای رشد سلولی و آپوپتوز و هیستومورفولوژی کبد، به صورت الگوریتمی نشان داده شود.
در این راستا هرکدام از بیومارکرهای مورد نظر (AFP، GPC3، GS، Hep Par1، Arg1، HSP70، KI67 و P53) به عنوان یک عامل مستقل در شناسایی بیماری و عامل پیش آگهی بیماری و توصیف کننده میزان بقا در تجزیه و تحلیل چند متغیره طی یک پانل حاوی نشانگر های متعدد انتخاب شده می توانند گامی موثر در شناسایی زودهنگام بیماران HCC در مراحل اولیه ابتلا بردارند.
سوالات و / یا فرضیات پژوهش• میزان بیان ژن بیومارکرهای آلفافتوپروتئین( AFP )، گلایپیکان 3 (GPC3)، گلوتامین سنتتاز(GS)، آرژیناز 1 (Arg1)، پروتئین HSP70، پروتئین KI67 و پروتئین P53 در بافت کبد مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم متفاوت است.
• میزان بروز ایمونوهیستوشیمیایی بیومارکرهای آلفافتوپروتئین( AFP )، گلایپیکان 3 (GPC3)، گلوتامین سنتتاز(GS)، هپاتوسیت پارافین1 (Hep Par1)، آرژیناز 1 (Arg1)، پروتئین HSP70، پروتئین KI67 و پروتئین P53 در بافت کبد مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم متفاوت است.
• حجم هپاتوسیت ها در بافت کبد مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم متفاوت است.
• تعداد هپاتوسیت ها در واحد حجم بافت کبد در مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم متفاوت است.
• دانسیته حجمی بافت فیبروزی در مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم متفاوت است.
• تعداد سلول های کوپفر در واحد حجم بافت کبد در مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم متفاوت است.
• دانسیته حجمی بافت همبند فضای پورت در مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم متفاوت است.
• فراساختار میتوکندری ها در هپاتوسیت های مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم چگونه است؟
• فراساختار فضای دیس در مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم چگونه است؟
• فراساختار شبکه آندوپلاسمی خشن در مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم چگونه است؟
• فراساختار هسته در هپاتوسیت های مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم چگونه است؟
هدف کلی طرحبررسی بیومارکرهای رشد سلولی و آپوپتوز و هیستومورفولوژی کبد به منظور شناسایی موارد سرطان هپاتوسلولار ناشی از HBV : یک مطالعه ایمونوهیستوشیمی، استریولوژی، واکنش QRT-PCR، و الکترون میکروسکوپی .
اهداف اختصاصی• تعیین و مقایسه میزان بیان ژن بیومارکر آلفافتوپروتئین( AFP) در بافت کبد مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم.
• تعیین و مقایسه میزان بیان ژن بیومارکر گلایپیکان 3 (GPC3) در بافت کبد مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم.
• تعیین و مقایسه میزان بیان ژن بیومارکر گلوتامین سنتتاز(GS) در بافت کبد مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم.
• تعیین و مقایسه میزان بیان ژن بیومارکر آرژیناز 1 (Arg1) در بافت کبد مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم.
• تعیین و مقایسه میزان بیان ژن بیومارکر پروتئین HSP70 در بافت کبد مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم.
• تعیین و مقایسه میزان بیان ژن بیومارکر پروتئین KI67 در بافت کبد مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم.
• تعیین و مقایسه میزان بیان ژن بیومارکر پروتئین P53 در بافت کبد مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم.
• تعیین و مقایسه میزان بروز ایمونوهیستوشیمیایی بیومارکر آلفافتوپروتئین( AFP ) در بافت کبد مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم.
• تعیین و مقایسه میزان بروز ایمونوهیستوشیمیایی بیومارکر گلایپیکان 3 (GPC3) در بافت کبد مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم.
• تعیین و مقایسه میزان بروز ایمونوهیستوشیمیایی بیومارکر گلوتامین سنتتاز(GS) در بافت کبد مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم.
• تعیین و مقایسه میزان بروز ایمونوهیستوشیمیایی هپاتوسیت پارافین1 (Hep Par1) در بافت کبد مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم.
• تعیین و مقایسه میزان بروز ایمونوهیستوشیمیایی بیومارکر آرژیناز 1 (Arg1) در بافت کبد مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم.
• تعیین و مقایسه میزان بروز ایمونوهیستوشیمیایی بیومارکر پروتئین HSP70 در بافت کبد مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم.
• تعیین و مقایسه میزان بروز ایمونوهیستوشیمیایی بیومارکر پروتئین KI67 در بافت کبد مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم.
• تعیین و مقایسه میزان بروز ایمونوهیستوشیمیایی بیومارکر پروتئین P53 در بافت کبد مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم.
• تعیین و مقایسه حجم هپاتوسیت ها در بافت کبد مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم.
• تعیین و مقایسه تعداد هپاتوسیت ها در واحد حجم بافت کبد در مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم.
• تعیین و مقایسه دانسیته حجمی بافت فیبروزی در مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم.
• تعیین و مقایسه تعداد سلول های کوپفر در واحد حجم بافت کبد در مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم.
• تعیین و مقایسه دانسیته حجمی بافت همبند فضای پورت در مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم.
• تعیین و مقایسه تغییرات فراساختاری میتوکندری ها در بافت کبد مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم.
• تعیین و مقایسه دانسیته تغییرات فراساختاری فضای دیس در مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم.
• تعیین و مقایسه تغییرات فراساختاری شبکه آندوپلاسمی خشن در مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم.
• تعیین و مقایسه تغییرات فراساختاری هسته در بافت کبد مبتلایان به عفونت مزمن HBV، HCC، HBV+HCC و سالم.
سازمانها، مراکز و موسسات و سایر بهره برداران بالقوه دستاوردهای طرحکاهش هزینه های تشخیص و درمان بیماران مبتلا به هپاتوسل کارسینوما- موسسات آموزشی، پژوهشی و درمانی- دانشگاه علوم پزشکی زاهدان- مرکز تحقیقات بیماریهای گوارش و کبد- مرکز تحقیقات سیاستگذاری سلامت
تعریف واژه های تخصصی• ویروس هپاتیت B: Hepatitis B Virus (HBV )
• سرطان اولیه سلول های کبدی (HCC)، Hepatocellular carcinoma
• واکنش زنجیره ای پلیمراز ترانس کریپتاز معکوس کمی (QRT-PCR)،(RT-PCR)quantification reverse transcription polymerase chain reaction :یکی از انواع روش های واکنش زنجیره ای پلیمراز است که برای شناسایی میزان بیان RNA استفاده می شود.
• استریولوژی (Stereology) ارائه تفسیر کمی و اطلاعات سه بعدی از بررسی مقاطع دو بعدی مواد یا بافت است.
• ایمونوهیستوشیمی (IHC : immunohistochemistry) روند تشخیص آنتی ژن (برای مثال پروتئینها) در سلول های یک مقطع بافتی توسط اصل اتصال آنتی بادی خاص به آنتی ژن در بافت های بیولوژیکی است.
• میکروسکوپ الکترونی عبوری یا TEM نوعی میکروسکوپ الکترونی است که قابلیت عکس‌برداری از ریزساختار مواد با بزرگنمایی 1000 تا 1000000 برابر با قدرت تفکیکی در حد کوچک‌تر از ۱ نانومتر را دارد. میکروسکوپ الکترونی عبوری همچنین توانایی آنالیز عنصری، تعیین ساختار و جهت کریستالی اجزایی به کوچکی ۳۰ نانومتر را به صورت کیفی و کمی دارد.
نوع مطالعهموردی-شاهدی (Case- Control)
جامعه مورد مطالعه(معرفی مشارکت کنندگان)/ محیط پژوهش(معیارهای ورود و خروج ذکر شوند)بیماران مبتلا به هپاتیت مزمن B و هپاتوسل کارسینوم مراجعه کننده به بیمارستان شهید لبافی نژاد تهران، بیمارستان سوم شعبان تهران و مرکز تحقیقات گوارش و کبد دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله الاعظم (عج) و بیمارستان های دانشگاه علوم پزشکی شیراز (گروه مورد )
معیارهای ورود: ابتلا به هپاتیت B، ابتلا به هپاتوسل کارسینوم، ابتلا به HBV + HCC
معیارهای خروج: افراد سیگاری، زنان باردار، بیماران دیابت نوع یک و دو، بیماران قلبی عروقی و کلیوی، HIV ، HCV ، افراد واجد ضایعات سرطانی خوش خیم و یا بدخیم در سایر ارگان ها.
افراد مراجعه کننده به بیمارستان شهید لبافی نژاد تهران، بیمارستان سوم شعبان تهران و مرکز تحقیقات گوارش و کبد دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله الاعظم (عج) و دانشگاه علوم پزشکی شیراز که به منظور نمونه برداری کبد مراجعه می کنند و سلامت آنها به لحاظ ابتلا به HBV و HCC توسط پزشکان متخصص تائید گردد و معیارهای خروج را نیز نداشته باشند در گروه کنترل قرار خواهند گرفت .
حجم نمونه و روش محاسبه آنامکان پیشرفت عفونت مزمن HBV به سیروز و کارسینوم هپاتوسلولار بسیار بالاست. بطوریکه حدود نیمی از موارد سیروز و بیش از نیمی از موارد هپاتوسلولار کارسینوم در سطح جهان ناشی از عارضه طولانی مدت عفونت مزمن HBV می باشد(3). نسبت ابتلا به هپاتوسل کارسینوما در بیماران مزمن عفونت HBV ، 25 تا 35 برابر افراد غیر آلوده به HBV است و در کسانی که آلوده به هر دو ویروس HBV و HCV می باشند احتمال سرطان کبد 130 برابر بیشتر از افراد غیر آلوده است. (20) علت اصلی شیوع HCC در کشور ما، موارد زیاد مبتلایان به عفونت با HBV و HCV می باشد. ایران جزو کشورهای با آلودگی خفیف تا متوسط ( International Endemicity) است که شیوع سرمی عفونت HBV 35 درصد و نسبت جمعیت ناقل مزمن 5-7/1 درصد است(6-8) و حدود 56-51 درصد بیماران سیروتیک ایرانی شواهد عفونت مزمن HBV را دارند(10). با توجه به شیوع متوسط هپاتوسلولار کانسر در ایران (109) و با استفاده از فرمول تعیین حجم نمونه برای داده های زوجی اسمی (132)و همچنین با توجه به حجم نمونه سایر مقالات، حجم نمونه برای افراد مبتلا به HBV برابر 25 و گروه کنترل نیز به تعداد 25 در نظر گرفته شده است. همچنین کلیه بیماران با تشخیص نهایی ابتلا به HCC و HBV+HCC که در طی دوره اجرای این طرح به بیمارستان های شهید لبافی نژاد تهران، سوم شعبان تهران و دانشگاه علوم پزشکی شیراز مراجعه خواهند کرد مورد بررسی قرار خواهند گرفت.



در عمل به جای از برآورد آن یعنی P استفاده می شود که از مطالعات مشابه بدست می آید.
روش نمونه گیری(نحوه تخصیص تصادفی و همسانسازی در صورت لزوم ذکر شود)نمونه های مورد نظر از بین افراد مبتلا به HBV و HCC که شاخص های ورود به مطالعه را داشته باشند انتخاب می شوند. گروه کنترل از بین افرادی که به دلالیل مختلف نیاز به نمونه برداری کبد دارند و مطالعه بافت شناسی کبد آنها را نرمال گزارش می کند با توجه به شرایط ورود و عدم داشتن شرایط خروج، با همسان سازی سن و جنس به مطالعه وارد خواهند شد.
روش و ابزار جمع آوري داده ها / صحت و استحکام داده ها (پرسشنامه یا فرم اطلاعاتی ضمیمه شود)فرم اطلاعاتی ضمیمه 1
پس از انجام آزمایش های مولکولی بر روی نمونه RNA استخراج شده از بافت، با روش RT-PCR میزان بیان بیومارکرهای مورد نظر تعیین می گردد.
برای بررسی تغییرات بافت شناسی و فراساختمان کبد از روش های استریولوژیک و میکروسکوپ الکترونی و برای بررسی میزان بیان هر بیومارکر در این بافت از تکنیک ایمونوهیستوشیمی استفاده خواهد شد.
روش اجرای طرح(با جزئیات بطور کامل شرح داده شود)در این مطالعه نمونه برداری بافت کبد گروه کنترل از بین افرادی که بدلالیل مختلف نیاز به نمونه برداری کبد دارند و مطالعه بافت شناسی کبد آنها را نرمال گزارش می کند، به روش سوزنی انجام خواهد شد.
بیماران مبتلا به HBV مزمن که HBsAg و یا HBV DNA آنها مثبت است و بیماران مبتلا به HCC به تنهایی و یا HBV+HCC که به تشخیص پزشک معالج نیاز به نمونه برداری بافت کبد دارند انتخاب خواهند شد.
شرکت کنندگان با پر کردن فرم رضایتنامه، رضایت آگاهانه کتبی خود را مبنی بر شرکت در این پژوهش اعلام می نمایند. همه بیمارانی که از نظر آزمایش HBsAg به روش ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ) و HBV DNA مثبت باشند و نیز آنهایی که در ارزیابی های هیستوپاتولوژیک بافت کبد، محاسبه آزمایشگاهی شاخص آسیب کبدی (آلانین آمینوترانسفراز و آسپارتات آمینوترانسفراز)، شاخص سنتز کبدی )آلبومین، پروترومبین، بیلی روبین)، شاخص کلستاز(آلکالن فسفاتاز و گاما گلوتامیل ترانس پپتیداز)، سونوگرافی کبد، توموگرافی کامپیوتری و رزونانس مغناطیسی هسته ای (NMR) ابتلا به HCC در آنها محرض شده است و نیاز به نمونه برداری دارند به عنوان گروه های مورد انتخاب می شوند.
پس از برداشتن نمونه های سوزنی بیوپسی کبد این نمونه به سه قسمت تقسیم خواهد شد.
بخشی از هر نمونه کبد در محلول فرمالین 10 درصد (V / V) تثبیت شده و سپس بلاک های پارافین هر نمونه تهیه و جهت انجام مشاهدات هیستوپاتولوژی معمول و ارزیابی های ایمونوهیستوشیمی استفاده خواهد شد.
بخشی از هر نمونه کبد بلافاصله به محیط نیتروژن مایع منتقل و پس از آن تا زمان انجام آزمایش های مولکولی و RT-PCR در دمای-80 درجه سانتی گراد نگهداری می شود.
بخش دیگری از هر نمونه بیوپسی در محلول 2.5٪ گلوتارآلدئید تثبیت و تا زمان انجام بررسی های فراساختاری توسط میکروسکوپ الکترونی در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری خواهد شد.
استخراج RNA تام ژنومی با استفاده از کیت استخراج RNA انجام می شود. با استفاده ازدستگاه اسپکتروفوتومتر نسبت جذب نوری 280/260 اندازه گرفته و نمونه هایی که بهترین خلوص را دارند(2>280/260 OD >1.8 )در 80- درجه سانتیگراد جهت استفاده در فرایند QRT-PCR فریز می شوند. برای تعیین میزان بیان RNA هر بیومارکر از روش QRT-PCR (Quantification Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) یا واکنش زنجیره ای پلیمراز ترانس کریپتاز معکوس کمی استفاده خواهد شد. در این روش پس از طراحی و تهیه پرایمرها و پروب های مناسب جهت تکثیر RNA و تولید CDNA مناسب و تکثیر آن برای هر بیومارکر، واکنش پلیمریزاسیون با استفاده از مواد اولیه خریداری شده از شرکت های معتبر و با استفاده از دستگاه Real Time انجام خواهد شد.
جهت بررسی استریولوژیک و ایمونوهیستوشیمیایی بیوپسی کبد اقدامات ذیل بر روی نمونه ها انجام خواهد شد: آماده سازی نمونه های بافتی، قالب گیری نمونه ها، برش گیری، رنگ آمیزی تری کروم ماسون، رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین، محاسبه حجم هپاتوسیت ها، محاسبه تعداد هپاتوسیت ها در واحد حجم بافت کبد، محاسبه دانسیته حجمی بافت فیبروزی، محاسبه تعداد سلول های کوپفر در واحد حجم بافت کبد، محاسبه دانسیته حجمی بافت همبند فضای پورت و بررسی میزان بیان بیومارکرها در بافت با استفاده از تکنیک ایمونوهیستوشیمی بر اساس دستورالعمل کیت های مربوطه.
پس از جداسازی بافت از بدن و محروم شدن آن از تغذیه خونی، برای حفظ حالت عادی سلول ها و جلوگیری از اتولیز یا خودخواری، مراحل مختلفی به شرح ذیل انجام می گیرد:
1-تهیه بافت که شامل ثابت کردن است. نمونه های جامد با غوطه ور شدن در حجمی از محلول که حداقل 10 بار بیشتر از حجم نمونه باشد، تثبیت می شود. تثبیت به مدت حداقل یک تا دو هفته در حرارت اتاق انجام خواهد شد. این فرایند موجب حفظ سلول ها و اجسام خارج سلولی شده به نحوی که حداقل تغییرات ممکن در ساختار و ترکیب شیمیایی بافت بوجود آید و همچنین موجب سفت شدن بافت و تسهیل در برش دادن آن می گردد.
2-آماده سازی بافت ها که شامل آب گیری، شفاف سازی و آغشتگی است (پاساژ). عمل قالب گیری در نفوذ پارافین مومی شکل به بافت ها که سختی لازم برای برش بافت را فراهم می سازد، دخالت می کند. چون بافت ها حاوی آب هستند و پارافین مومی شکل در آب نامحلول است، دهیدراتاسیون با استفاده از درجات صعودی اتانول و تا رسیدن به الکل مطلق انجام می گیرد. آب گیری با نفوذ یک عامل شفاف کننده مانند زایلن به داخل بافت تعقیب می شود و بالاخره بافت در پارافین ذوب شده قرار داده شده و زمانی که بافت کاملا از پارافین اشباع شد آماده قالب گیری است. این مراحل توسط دستگاه پاساژ بافت و به طور خودکار انجام می گیرد و مدت زمان تهیه بافت 16 ساعت طول میکشد. قالب گیری، روش قرار دادن بافت نفوذ یافته و آغشته شده به پارافین است که طی آن نمونه در پارافین مذاب قرار داده می شود. اطراف پارافین توسط یک قالب سخت احاطه شده و پارافین مذاب و نمونه درون آن در حرارت اتاق منجمد می شود. عمل قالب گیری بافت ها را برای بریده شدن توسط میکروتوم آماده می سازد. از پارافین دارای نقطه ذوب بالاتر از 65-58 درجه سانتی گراد برای قالب گیری استفاده خواهد شد.
3-تهیه مقاطع که شامل عمل میکروتومی، چسباندن مقاطع و برداشتن رنگ دانه ها و رسوب های شیمیایی است. پس از میزان شدن قالب بر روی میکروتوم (شامل آرایش قالب یا Trimming – چسباندن قالب پارافین به پایه قالب و میزان کردن قالب) برش گیری مقاطع با ضخامت 5-4 میکرون شروع می شود. مقاطع بر روی لام قرار داده شده و به مراحل بعدی جهت رنگ آمیزی منتقل می شوند.
4-رنگ آمیزی و چسباندن که شامل پارافین زدایی، آبدهی، رنگ آمیزی، آب گیری، شفاف سازی و چسباندن است. محلول های مورد نیاز و روش رنگ آمیزی بافت ها با توجه به پروتکل های مربوطه انجام خواهد شد.
ایمونوهیستوشیمی فرآیندی برای مکان‌یابی پروتئین‌ها در سلول های یک بافت است. در این روش با استفاده ازآنتی‌بادی‌ها ، آنتی ژن های سلولی شناسایی می‌شود. پیشرفت‌های چشمگیری در سال‌های اخیر در این شیوه انجام گرفته‌است و در حال حاضر به عنوان یکی از روش‌های تشخیصی مهم جای خود را باز کرده‌است. اساس این روش، قرار دادن برش‎های بافتی تحت تأثیر آنتی بادی‎های خاص برای تشخیص یک سری پروتئین خاص می‎باشد. پروتئین‎های مورد نظر از طریق اتصال آنتی بادی‎ها به یک سوبسترای رنگی شناسایی و حتی تعیین مقدار می‎شوند. به این صورت که محل قرار گیری این مواد ایمونولوژیک دقیقا شناسایی شده و با استفاده از آنتی بادی مناسب به همراه عمل کنژوگاسیون توسط مارکر اختصاصی در کنار محلول های رنگ آمیزی بر روی نمونه های مقاطع تهیه شده انجام می گردد. پس از انجام رنگ آمیزی کانون های کمپلکس (Ag-Ab) به صورت رنگی مشخص می گردد. این کانون های رنگی دلیل بر وجود پروتئین های مورد نظر بوده و ارزش تشخیصی بسیار بالایی دارد. در مرحله آماده سازی بافت ابتدا فیکس و سپس قالب گیری و برش بافتی انجام میشود . از فرمالین به عنوان فیکساتور و از پارافین به منظور قالب گیری استفاده میشود. سپس نمونه را به ضخامت ۵ میکرومتر برش میدهیم. برخی از آنتی ژن ها با فرمالین واکنش متقاطع داده و در طی عمل فیکس کردن پوشیده میشوند بنابر این بعد از فیکس بافتی ابتدا باید پروسه ای تحت عنوانUnmasking Ag انجام شود برای این منظور میتوان از حرارت بالا در محلولهای خاص مثل سیترات با PH=6 و یا از هضم آنزیمی توسط آنزیم هایی مانند کیناز ها استفاده نمود که بر حسب نوع آنتی ژن مورد بررسی روشهای فوق را انتخاب میکنیم. گاهی در اثر استفاده از آنتی بادیهای ناخالص و یا واکنش های غیر اختصاصی زمینه به صورت غیر اختصاصی رنگ گرفته و باعث ایجاد نتایج مثبت کاذب میشود برای جلوگیری از این حالت باید با استفاده محلولهای بلوک کننده این واکنشها مثل سرم نرمال جلوی این اتفاق را گرفت. همچنین در تهیه آنتی بادی ها باید نهایت دقت در جهت تهیه آنتی بادی های خالص به عمل آید. در طی روند ایمونو هیستوشیمی از آنزیمهایی مانند ایمونوپراکسیداز،آلکالن فسفاتاز و یا کمپلکس هایی مانند بیوتین-آویدین استفاده میشود، برخی بافتها به صورت ذاتی دارای فعالیت پراکسیدازی هستند در این موارد باید قیل از انکوبه کردن بافت با آنتی بادی اولیه از پراکسید هیدروژن برای حذف این آنزیم استفاده نمود و در مواردیکه از آنزیم آلکالن فسفاتاز استفاده میشود با استفاده از سوبسترای levamisol این آنزیم را بلوک کرد. بافت کلیه و کبد در حالت عادی حاوی بیوتین هستند در این موارد اگر قصد استفاده از کمپلکس بیوتین-آویدین را داشته باشیم باید با استفاده از آویدین غیر کنژوگه قبل از شروع مراحل کار بیوتین بافت را حذف کرد.
در استریولوژی، محاسبات با استفاده از شبکه ای از خطوط، مربع ها یا دوایری که بر تصاویر منطبق شده است صورت می گیرد. یک صفحه شیشه ای که روی آن یک الگوی خاص برای محاسبه با ظرافت بسیار قلم کاری شده است در بخش چشمی میکروسکوپ قرار داده می شود. الگوی مربوطه توسط میکروسکوپ نقاشی در مسیر بینایی منعکس شده و یا اینکه لام را با استفاده از پرژکتور روی ورقه کاغذی که الگوی مورد نظر روی آن ترسیم شده می اندازیم. گرید های مورد استفاده در استریولوژی این طرح از نوع گرید های نقطه ای خواهد بود. این گریدها مربعی بوده و مجموعه ای از فضاهای بین نقطه ای گرید DX می باشد. چهار عامل شکل، اندازه، توزیع و نحوه قرار گیری فضایی نباید شمارش را تحت تاثیر قرار دهد. برای شمارش هر مقطع از شبکه نقاط استفاده می کنیم. نقاط برخورد کرده با مقطع مورد نظر را شمارش می کنیم. نقطه فاقد بعد است ازاینرو به جای نقطه از شبکه علامت های مثبت (+) استفاده می شود. به صورت قراردادی نقطه ای بدون بعد را به قسمتی از علامت نسبت می دهیم. بدین منظور گوشه بالا و سمت راست علامت + را به نقطه مورد نظر نسبت داده و تمام قسمت هایی از مقطع مورد نظر که با گوشه بالا و سمت راست برخورد می کند را شمارش می کنیم. برخورد شبکه علامات + با مقطع مورد نظر بایستی تصادفی باشد. در مرحله بعد فاصله اطراف هر علامت در دو جهت X و Y اندازه گیری می شود (DX و DY) قلمرو اطراف هر نقطه را محاسبه می کنیم.

با ضرب کردن a(p) در تعداد نقاط برخورد با تصویر، مساحت آن بدست می آید. برای بدست آوردن حجم باید فاصله مقاطع را نیز در مجموع حاصل ضرب مساحت تمام مقاطع ضرب کرد.

با توجه به اینکه تصاویر از طریق پروژکت کردن تصویر بر روی یک صفحه ایجاد می شود باید بزرگ نمایی را نیز منظور کرد. پس رابطه حجم به صورت زیر استفاده می شود:

در این رابطه M بزرگ نمایی تصویر است. با استفاده از رابطه فوق حجم مقاطع و اجزای مورد نظر را با شمارش نقاط محاسبه می کنیم. به منظور تخمین دانسیته حجم مجموع نقاط برخورد کرده با جزء را بر مجموع تمام نقاط برخورد کرده با فضای هر مقطع اصلی تقسیم می کنیم.

در فرمول فوق m تعداد میدان های مورد آزمایش بوده و آنچه بدست می آید یک نسبت است.
نمونه های بافت قبل از اینکه با میکروسکوپ الکترونی بررسی شوند تثبیت شده و به لایه های نازک برش داده می شوند. برای اینکه نمونه ها تا حد امکان نزدیک به حالت زنده حفظ شوند، این فرایند باید با سرعت انجام شود. آماده سازی مناسب نمونه برای بدست آوردن تصاویر با کیفیت ضروری است. فرایند آماده سازی نمونه، تمام مولفه های ساختاری بافت را حفظ می کند. محلول های شیمیایی بافت را ثابت کرده و تمام فرایندهای حیاتی را متوقف می کنند. مواد نگهدارنده اضافی حذف شده و آب نمونه گرفته می شود. بافت پردازش شده و در یک محیط نگهدارنده قرار داده می شود تا محیط سخت شود. در این زمان بافت برای برش دادن آماده است. برش دادن نیاز به اولترامیکروتوم با یک شیشه یا چاقوی الماس دارد. برش های ضخیم زیر میکروسکوپ نوری بررسی می شوند تا از درست بودن مراحل ثابت کردن و پردازش اطمینان حاصل شود.برش های نازک زیر میکروسکوپ الکترونی بررسی می شوند. برای برش های ضخیم و نازک از رنگ های متفاوت استفاده می شود. آبی تولوئیدین اغلب برای رنگ آمیزی بخش های ضخیم استفاده شده و باعث می شود ساختارها زیر میکروسکوپ نوری قابل مشاهده باشند. برش های باریک برای میکروسکوپ الکترونی نیاز به رنگ آمیزی دارند که حاوی فلزهای سنگین (مانند نمک های اورانیوم) باشند و تعامل با الکترون ها را افزایش دهد. قبل از رنگ آمیزی برش های نازک روی یک شبکه سیمی (معمولا از جنس مس، نیکل یا طلا) قرار داده می شود. این شبکه مشابه اسلایدی است که در یک میکروسکوپ نوری استفاده می شود.
آماده سازی نمونه برای TEM را می توان به هشت مرحله اصلی تقسیم کرد: 1-فیکساسیون اولیه 2-شستشو 3-فیکساسیون ثانویه 4-آبگیری 5-نفوذپذیری با حلال 6-نفوذپذیری با رزین 7-قالب گیری 8-پختن رزین.
جهت آماده سازی نمونه میکروسکوپ الکترونی انتقالی (TEM)، نمونه ها برای انجام ثبوت اولیه در محلول گلوتارآلدئید 5/2 درصد در دمای 4 درجه سانتی گراد قرار داده شده، در مرحله شستشو برای خارج نمودن محلول گلوتارآلدئید از بافت، نمونه ها توسط بافر فسفات 1/0 مولار شستشو داده می شوند. به منظور ثبوت ثانویه، نمونه ها در محلول تتراکسیداسمیوم 1 درصد و در بافر فسفات 1/0 مولار قرار داده می شوند.سپس شستشو با بافر فسفات 1/0 مولار انجام می گیرد. در مرحله آب گیری برای خارج نمودن آب بافت، نمونه ها از غلظت های رو به افزایش اتانول عبور داده می شوند. در مرحله آغشتگی با رزین نمونه های آب گیری شده به تدریج و طی چند مرحله توسط مونومرهای پلاستیکی مایع جایگزین خواهند شد. در مرحله بعد قالب گیری نمونه ها انجام می گیرد به طوریکه در هر قالب یک نمونه قرار داده و رزین در قالب ها ریخته می شود. سپس برای پلیمریزاسیون رزین و تهیه بلوک، قالب ها در آون 60 درجه به مدت 24 ساعت قرار داده می شوند. پس از پلیمریزاسیون، بلوک های تهیه شده از قالب خارج و با استفاده از تیغ در زیر استریومیکروسکوپ اصلاح می شوند، در مرحله برش گیری توسط اولترامیکروتوم برش هایی به ضخامت 50 نانومتر تهیه شده (به رنگ نقره ای) و روی گرید منتقل می شوند. سپس برای رنگ آمیزی گریدها از سیترات سرب و اورانیل استات استفاده شده و پس از رنگ آمیزی مقاطع روی گریدها و خشک شدن آنها، نمونه ها برای مشاهده و بررسی با میکروسکوپ الکترونی TEM منتقل می شوند. نمونه با بزرگنمایی های متفاوت بررسی و از مناطق مختلف مقاطع عکسبرداری خواهد شد.
روش تجزیه، تحليل و توصیف داده‌ها (نمونه‌اي از جدول توخالي ضميمه شود و روش هاي آماري مورد استفاده به طور كامل توضيح داده شود)(کیفی و کمی)برای تعیین وجود یا عدم وجود تفاوت معنی دار در میانگین دو گروه مستقل از آزمون t مستقل استفاده خواهیم کرد(Independent student t test). یکی از نکات مهم در انجام این آزمون پیروی داده ها از توزیع نرمال می باشد و به همین منظور و برای اثبات تبعیت داده ها از توزیع نرمال ابتدا آزمون کولموگروف-اسمیرونوف (one sample Kolmogorov–Smirnov test) انجام خواهد پذیرفت.همچنین هنگام مقایسه دو گروه ممکن است واریانس دو جامعه ای که نمونه ها از آن انتخاب شده اند با یکدیگر برابر باشند و یا برابر نباشند. در هر یک از این دو حالت روش محاسبه t و درجه آزادی F اندکی با یکدیگر متفاوتند. برای تشخیص هریک از این دو حالت از یکدیگر آزمون Levene test به منظور بررسی همسانی واریانس ها مورد استفاده قرار خواهد گرفت. آنالیز واریانس یک طرفه ANOVA و تست Tokeys posthoc برای مقایسه میانگین ها و تفاوت گروه های آزمایشی مورد استفاده قرار می گیرد. جهت مقایسه متغیرهای کیفی از تست کای اسکوئر و متغیرهای کمی از آزمون ANOVA و تست های نان پارامتریک استفاده خواهد شد. به منظور مقایسه و آنالیز متغیرهای وابسته ای که بیش از دو حالت دارند نیز از مدل رگرسیون لجستیک Multinomial Logistic Regression استفاده خواهد شد. در نهایت نتایج به صورت
گزارش می شود. برای آنالیز تمام داده ها و انجام تست های آماری از نرم افزار SPSS ویرایش 20 بهره خواهیم برد. هنگامیکه 05/0P≤ شود تفاوت ها معنی دار فرض خواهند شد.
نمونه ای از جداول توخالی ضمیمه می باشد (ضمیمه 2)
ملاحظات اخلاقی کدهای 1،2،3،4،5،10،11،12،13،15،16،17،18،19،25،28،29،30،31 مصوب کمیته کشوری اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی که در دفترچه راهنمای عمومی اخلاق در پژوهشهای دارای آزمودنی انسانی در جمهوری اسلامی ایران، دربردارندهی اصول و مقررات اخلاقی‎ مطرح و در سال 1392 در 31 بند تصویب شده است در این طرح رعایت می شود. تمامی بیماران تحت مطالعه آگاهانه و برای مقاصد علمی اقدام به دادن نمونه خواهند کرد. شرکت در این طرح هیچ گونه هزینه ای برای بیماران ندارد و نام و مشخصات بیماران گزارش نخواهد شد.
1-هدف اصلی هر پژوهشباید ارتقای سلامت انسانها توأم با رعایت کرامت و حقوق ایشان باشد.
2-در پژوهش بر آزمودنی انسانی، سلامت و ایمنی فرد فرد آزمودنی‎ها در طول و بعد از اجرای پژوهش، بر تمامی مصالح دیگر اولویت دارد. هر پژوهشی که بر روی آزمودنی انسانی انجام میگیرد، باید توسط افرادی طراحی و اجرا شود که تخصص و مهارت بالینی لازم و مرتبط را داشته باشند. در کارآزماییهای بالینی بر روی بیماران یا داوطلبهای سالم نظارت پزشک دارای مهارت و دانش متناسب الزامی است.
3-پژوهش بر انسان فقط در صورتی توجیهپذیر است که منافع بالقوهی آن برای هر فرد آزمودنی بیشتر از خطرهای آن باشد. در پژوهشهای دارای ماهیت غیر درمانی، سطح آسیبی که آزمودنی در معرض آن قرار میگیرد نباید بیشتر از آنچه باشد که مردم عادی در زندگی روزمرهی خود با آن مواجه میشوند. حصول اطمینان از این امر برعهدهی طراحان، مجریان و همکاران پژوهش و تمامی شوراهای بررسی یا پایشکنندهی پژوهش از جمله کمیتهی اخلاق در پژوهش است.
4-مواردی از قبیل سرعت، سهولت کار، راحتی پژوهشگر، هزینهی پایینتر و/ یا صرفاً عملی بودن آن به هیچ وجه نباید موجب قرار دادن آزمودنی در معرض خطر یا زیان افزوده یا تحمیل هر گونه محدودیت اختیار اضافی به وی شود.
5-قبل از آغاز هر پژوهش پزشکی ، باید اقدامات اولیه جهت به حداقل رساندن زیان احتمالی وارده به آزمودنیها و تامین سلامت آنها انجام گیرد.
10-هر پژوهشی باید بر اساس و منطبق بر یک طرحنامه (پروپوزال) به انجام برسد. در کارآزماییهای بالینی باید علاوه بر طرح نامه، دستورالعمل (پروتکل) نیز تهیه و ارائه شود. طرحنامه و دستورالعمل باید شامل تمامی اجزای ضروری باشد. از جمله بخش ملاحظات اخلاقی، اطلاعات مربوط به بودجه، حمایت کنندهها، وابستگیهای سازمانی، موارد تعارض منافع بالقوهی دیگر، مشوقهای شرکت کنندگان، پیش بینی درمان و یا جبران خسارت افراد آسیب دیده در پژوهش .در مواردی که لازم است رضایتنامهی آگاهانه بهصورت کتبی اخذ شود، فرم رضایتنامه باید تدوین و به طرحنامه پیوست شده باشد. پیش از تصویب یا تأیید طرحنامه از سوی کمیتهی مستقل اخلاق در پژوهش، نباید اجرای پژوهش شروع شود.
11-کمیتهی اخلاق در پژوهش علاوه بر بررسی و تصویب طرحنامه و دستورالعمل، این حق را دارد که طرحها را در حین و بعد از اجرا را از نظر رعایت ملاحظات اخلاقی مورد پایش قرار دهد. اطلاعات و مدارکی که برای پایش از سوی کمیتهی اخلاق درخواست میشود، باید از سوی پژوهشگران در اختیار این کمیته گذاشته شود.
12-انتخاب آزمودنیهای بالقوه از میان جمعیت بیماران یا هر گروه جمعیتی دیگر، باید منصفانه باشد، بهنحوی که توزیع بارها (خطرات یا هزینهها) و منافع شرکت در پژوهش، در آن جمعیت و کل جامعه، تبعیضآمیز نباشد.
13-کسب رضایت آگاهانه و آزادانه در هر پژوهشی که بر روی آزمودنی انسانی اجرا میشود، الزامی است. این رضایت باید به شکل کتبی باشد. در مواردی که اخذ رضایت آگاهانهی کتبی غیر ممکن یا قابل صرفنظر باشد، باید موضوع با ذکر دلایل به کمیتهی اخلاق منتقل شود. در صورت تأیید کمیتهی اخلاق، اخذ رضایت کتبی قابل تعویق یا تبدیل به رضایت شفاهی یا ضمنی خواهد بود.
15-پژوهشگر باید از آگاهانه بودن رضایت اخذشده اطمینان حاصل کند. برای این منظور، در تمامی پژوهشهای پزشکی، اعم از درمانی و غیردرمانی، پژوهشگر موظف است فرد در نظر گرفته شده بهعنوان آزمودنی را از تمامی اطلاعاتی که میتوانند در تصمیمگیری او مؤثر باشند، بهنحو مناسبی آگاه سازد. این اطلاعات مشتملند بر: عنوان و اهداف پژوهش، طول مدت پژوهش، روشی که قرار است بهکار گرفته شود (شامل احتمال تخصیص تصادفی به گروهمورد یا شاهد)، منابع تأمین بودجه، هر گونه تعارض منافع احتمالی، وابستگی سازمانی پژوهشگر، و فواید و زیانهایی که انتظار میرود مطالعه در بر داشته باشد. همچنین، هر آزمودنی باید بداند که میتواند هر لحظه که بخواهد از مطالعه خارج شود و باید دربارهی خطرات و زیانهای بالقوهی ناشی از ترک زودرس پژوهش آگاه و پشتیبانی شود. پژوهشگر همچنین باید به تمامی سؤالات و دغدغههای این افراد، با حوصله و دقت پاسخ بدهد. این موارد باید در رضایتنامهی آگاهانه منعکس شود.
16-پژوهشگر باید از آزادانه بودن رضایت اخذ شده اطمینان حاصل کند. رفتارهایی که به هر نحوی متضمن تهدید، اغوا، فریب و یا اجبار باشد موجب ابطال رضایت آزمودنی میشود. به فرد باید فرصت کافی برای مشاوره با افرادی که مایل باشد – نظیر اعضای فامیل یا پزشک خانواده - داده شود. همچنین، در پژوهشهایی که پژوهشگر مقام سازمانی بالاتری نسبت به آزمودنی داشته باشد، دلایل این شیوهی جذب آزمودنی، باید توسط کمیتهی اخلاق تأیید شود، در این موارد شخص ثالث و معتمدی باید رضایت را دریافت کند.
17-پژوهشگر ارشد مسؤول مستقیم ارائهی اطلاعات کافی و به زبان قابل فهم برای آزمودنی ، اطمینان از درک اطلاعات ارائه شده، و اخذ رضایت آگاهانه است. در مواردی که بنا بهدلیلی، نظیر زیاد بودن تعداد آزمودنیها، این اطلاعرسانی از طریق شخص دیگری انجام میگیرد، این پژوهشگر ارشد است که مسؤول انتخاب فردی آگاه و مناسب برای این کار و حصول اطمینان از تأمین شرایط مذکور در این بند است.
18-در پژوهشهایی که از مواد بدنی (شامل بافتها و مایعات بدن انسان) یا دادههایی استفاده میشود که هویت صاحبان آنها معلوم یا قابل کشف و ردیابی است، باید برای جمعآوری، تحلیل، ذخیره‎سازی و /یا استفادهی مجدد از آنها رضایت آگاهانه گرفته شود. در مواردی که اخذ رضایت غیرممکن باشد یا اعتبار پژوهش را خدشهدار کند، میتوان در صورت بررسی مورد و تصویب کمیتهی اخلاق ، از دادهها یا مواد بدنی ذخیره شده، بدون اخذ رضایت آگاهانه استفاده کرد.
19-عدم قبول شرکت در پژوهش، یا ادامه ندادن به همکاری، نباید هیچگونه تأثیری بر خدمات درمانی که در همان مؤسسه – نظیر بیمارستان – به فرد ارائه میشود، داشته باشد. این موضوع باید در فرایند اخذ رضایت آگاهانه، به آزمودنی اطلاع داده شود.
25-پژوهشگر مسؤول رعایت اصل رازداری و حفظ اسرار آزمودنیها و اتخاذ تدابیر مناسب برای جلوگیری از انتشار آن است. همچنین، پژوهشگر موظف است که از رعایت حریم خصوصی آزمودنیها در طول پژوهش اطمینان حاصل کند. هرگونه انتشار دادهها یا اطلاعات بهدست آمده از بیماران باید بر اساس رضایت آگاهانه انجام گیرد.
28-پژوهشگران موظفند که نتایج پژوهشهای خود را صادقانه ، دقیق، و کامل منتشر کنند. نتایج، اعم از منفی یا مثبت، و نیز منابع تأمین بودجه، وابستگی سازمانی، و تعارض منافع – در صورت وجود – باید کاملاً آشکارسازی شوند. پژوهشگران نباید در هنگام عقد قرارداد انجام پژوهش، هیچ گونه شرطی را مبنی بر حذف یا عدم انتشار یافتههایی که از نظر حمایت کنندهی پژوهش مطلوب نیست، بپذیرند.
29-نحوهی گزارش نتایج پژوهش باید ضامن حقوق مادی و معنوی تمامی اشخاص مرتبط با پژوهش، از جمله خود پژوهشگر یا پژوهشگران، آزمودنیها و مؤسسهی حمایت کنندهی پژوهش باشد.
30-گزارشها و مقالات حاصل از پژوهشهایی که مفاد این راهنما را نقض کردهاند، نباید برای انتشار پذیرفته شوند.
31-روش پژوهش نباید با ارزشهای احتماعی، فرهنگی و دینی جامعه در تناقض باشد.
همچنین کدهای 1،2،3،4،5،6،7،8،9،10،11،12مصوب کمیته کشوری اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی که در دفترچه راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی مربوط به بخش عمومی تصویب شده است در این طرح رعایت می گردد.
1-پژوهشگر باید به این امر مهم توجه داشته باشد که بافتها و اعضای مورد استفاده، دارای منشأ انسانیاند و کرامت انسانی اقتضا میکند که جمعآوری، نگهداری، استفاده و نابودسازی آنها توأم با رعایت ملاحظات و شؤون مرتبط باشد.
2-از اجزای بدنی دارای منشأ انسانی باید تنها در پژوهشهایی استفاده شود که اهداف ارزشمندی را در راستای مبارزه با بیماریها و ارتقای سلامت انسانها دنبال میکنند.
3-تمامی پژوهشها بر روی عضو و بافت انسانی، پیش از اجرا، باید مورد تأیید کمیتهی اخلاق در پژوهش مرتبط قرار گیرد. کمیتهی اخلاق در پژوهش حق دارد که در تمامی مراحل پژوهش بر آن نظارت داشته باشد. پژوهشگران باید در این زمینه با کمیتهی اخلاق در پژوهش همکاری کنند.
4-رضایت آگاهانهی فرد دهندهی عضو یا بافت، یا جانشین قانونی او، شرط اساسی در تأیید اخلاقی هر پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی است. رضایتنامه باید با رعایت تمامی اصول مرتبط تهیه و هنگام ارسال طرحنامه برای تصویب، به آن پیوست شده باشد.
5-در مواردی که اخذ رضایت آگاهانه از دهندهی نمونهی ذخیرهشده یا جانشین قانونی او امکانپذیر نباشد، بهشرط وجود رضایت کلی اولیه بر استفادهی پژوهشی، در صورت تأیید کمیتهی اخلاق در پژوهش میتوان از آن نمونه برای پژوهش استفاده کرد. در چنین مواردی باید از نمونههایی استفاده شود که به نحو برگشتناپذیر بینام شده باشد.
6-تمامی اطلاعاتی که از صاحبان عضو یا بافت مورد پژوهش، جمعآوری و ثبت میشود، راز حرفهای تلقی میشود؛ از این رو، تمامی اصول و ملاحظات مربوط به رازداری و حفظ حریم شخصی، باید در مورد آنها مراعات شود.
7-مرکز انجام دهندهی پژوهش بر روی عضو و بافت باید مهارت و امکانات لازم برای حفظ رازداری را داشته باشد؛ در غیر این صورت، اطلاعات باید به شکل بینام و غیرقابل ردیابی ثبت و ذخیره شود.
8-پژوهشگر باید از اعضاء و بافتهایی که به منظور پژوهش در اختیار او قرار میگیرد استفادهی بهینه کرده، از هدر رفتن آنها جلوگیری کند
9-پژوهشگر موظف است که تمهیدات لازم ایمنی، از جمله آزمونهای غربالگری و وسایل محافظتکننده را برای جلوگیری از انتقال آلودگی از اجزای بدنی مورد استفاده به هر فرد دیگر، اعم از پژوهشگران، آزمودنیها یا سایر افرادی که در فرایند پژوهش با این مواد سروکار خواهند داشت، پیشبینی و تأمین کند.
10-پژوهش بر روی عضو و بافت ممکن است به ایجاد روشها و محصولاتی منجر شود که به استفادهی تجاری از آنها بینجامد. حقوق مالکیت معنوی نتایج حاصل از اینگونه پژوهشها باید مورد تأیید و حمایت قرار گیرد. احتمال استفادهی تجاری از نتایج پژوهش و اشخاصی که احتمالاً از آن منتفع خواهند شد باید در رضایتنامهآورده شود.
11-زمان، نحوه و میزان اطلاع آزمودنیها از نتایج پژوهش باید در رضایتنامه آورده شود. در هر حال، آزمودنی یا نمایندهی قانونی او باید به تمامی اطلاعاتی که در طول پژوهش دربارهی او بهدست میآید، دسترسی داشته باشد.
12-در صورت کمبود بافت یا عضو، باید استفادههای درمانی بر استفادههای پژوهشی اولویت داده شود.
محدودیتهای اجرائی طرح و پیش بینی جهت حل آنهامشکلات مربوط به تهیه مواد اولیه و تجهیزات آزمایشگاهی مورد نیاز
کلمات کلیدیهپاتیت مزمن B (HBV)، هپاتوسلولار کارسینوما (HCC)، ایمونوهیستوشیمی، استریولوژی
Chronic Hepatitis B, Hepatocellular carcinoma, Immunohistochemistry, Stereology
فهرست منابع و مراجع1) Dan L. Longo, Editor, Anthony S. Fauci, Editor, Dennis L. Kasper, Editor, Stephen L. Hauser, Editor, J. Larry Jameson, Editor, Joseph Loscalzo, Editor. Liver and Biliary Tract Disease. In: Harrison's principles of internal medicine. 18th edition.
2) http://www.aasld.org/
3) World Health Organization. Hepatitis B vaccines. WKLY Epidemiol Rec 2004;79 ,253-264.
4) Shepard CW, Simard EP, Finelli L, Fiore AE, Bell BP. Hepatitis B virus infection: epidemiology and vaccination. Epidemiol Rev 2006;28:112-125.
5) Hyams KC. Risks of chronicity following acute hepatitis B virus infection: a review. Clin Infect Dis 1995; 20:992-1000.
6) Merat S, Malekzadeh R, Rezvan H, Khalilian M. Hepatitis B in Iran. Arch Iranian Med 2000; 3: 192-201.
7) Alizadeh AH, Ranjbar M, Ansari S, MirArab A, Alavian SM, Mohammad K, et al. Seroprevalence of hepatitis B in Nahavand, Islamic Republic of Iran. East Mediterr Health J 2006;12(5):528-537.
8) Alavian SM, Fallahian F, Lankarani KB. The changing epidemiology of viral hepatitis B in Iran. J Gastrointestin Liver Dis 2007;16(4):403-406.
9) Zali MR, Mohammad K, Noorbala AA, Noorimayer B, Shahraz S. Rate of hepatitis B
seropositivity following mass vaccination in the Islamic Republic of Iran. East Mediterr Health J 2005;11(1-2):62-67.
10) Shamszad M, Farzadegan H. Hepatitis B related cirrhosis and hepatocellular carcinoma in Iran. J Iran Med Council 1982;8:228-233.
11) Saffar M.J, Jooyan A.R, Mahdavi M.R, Khalilian AR. Seroprevalence of hepatitis A, B, and C and hepatitis B vaccination status among health care workers in Sari-Iran, 2003. J Mazand Univ Med Sci 2005; 15 (47): 67-77.
12) Expanded programme on immunization. Global advisary group-part 1. WKLY Epidemiol Rec 1992;67:11-50.
13) Lee W. Hepatitis B Virus Infection. N Engl J Med 1997; 337:1733-1745.
14) Ganem D, Schneiden RJ. Hepadnaviridae: the Viruses and Their Replicatin .In Knipe Dm,Howely Pm, Griffin DE, Lamb RE, et al.eds.Fields Virology. Philadelphia: Lippincott-Raven;2001 .p. 2923-69.
15) Klingmuller U, Schallen H. Hepadnavirus Infection rRequires Interaction Between the Viral Pres Doman and A Specific Hepatocellular Rreceptor. J Viral 1993; 67:7414-7422.
16) Kach H, Schlicht HJ. Analysis of the Earliest Steps of Hepadnaviral Replications: Genomic Repair After Infectious Entry into Hepatocyte Doesnot Depend on Viral Polymerases Activity. J Viral.1993; 67:4867-74.
17) Seeger C, Ganem D, Varmus HE. Biochemical and genetic evidence for the hepatitis B virus replication strategy. Science 1986; 232(4749): 477-84.
18) J. Ferlay, F. Bray, and D. M. Pisani, Globocon 2000: Cancer Incidence Mortality and Prevalence Worldwide Version 1.0,no.5, IARC Press, Lyon, France, 2001
19) D.M.Parkin,F.Bray,J.Ferlay,andP.Pisani,“Globalcancer statistics, 2002,” CA–A Cancer Journal for Clinicians, vol. 55,pp. 74–108, 2005
20) Yun-Fan Liaw, M.D., Joseph, J.Y. Sung, M.D., Wan Cheng Chow. M.D., Lamivudine for Patients with Chronic Hepatitis B, and Advanced Liver Dis N.E.J.M, vol 351, NO.15, Oct 7, 2004, P=1521-31.
21) Jack R.Wands, M.D. Prevention of Hepatocellular Carcinoma, N.E.J.M, oct.7, 2004, vol 351, No. 15, P=1567-70.
22) Maureen M, Jones M.D, Deirdre, A, Kelly, M.D Jacek Mizersky, M.D et al, Clinical Trial of Lamivudine in Children With Chronic Hepatitis B, NEJM, May 30, 2002, vol 346 P, 1706-13.
23) Hawai-L Yang, M.sc, Sheng-Nan Lu, M.D.PhD Yun-FanLiaw, M.D. et al, Hep B e Antigen and the Risk of Hepatocellular Carcinoma, N.E.J.M, July 18, 2002, vol 347. No.3, P=168-174.
24) P, Marcellin M.D. George K.K. Lau M.D., Ferruccio Bonino, M.D et al, Peginterferon alfa-2-aalone, Lamivudine alone and the two in combination in Patients with HBeAg Negative Chronic hep. B, N.E.J.M, Sep 16, 2004, vol 351, P=1206-17.
25) Stephanos. J. Hadziannis, Dimitrios Vassilo-Paulos, Hepatitis B e Antigen-Negative Chronic Hep B, Hepatology vol34, No.4, 2001, P=617-23
26) Colombo, M. (2003). Malignant neoplasm of the liver. In: Schiff's Disease of the Liver, E.R. Schiff, M.F. Sorrell & W.C. Maddrey, (Eds.), Lippincott William & Wilkins, pp.1377-404, ISBN 978-0-7817-6040-9, Philadelphia. 27) Chuang, S.C., La Vecchia, C. & Boffetta, P. (2009). Liver cancer: descriptive epidemiology and risk factors other than HBV and HCV infection. Cancer Letters, Vol.286, No.1,(December 2009), pp. 9-14, ISSN 0304-3835.
28) Di Bisceglie AM. (1995). Hepatitis C and hepatocellular carcinoma. Seminars in Liver Disease, Vol.15, No.1, (February 1995), pp. 64-69, ISSN 0272-8087.
29) Kato, Y., Nakata, K., Omagari, K. Furukawa, R., Kusumoto, Y., Mori, I,, Tajima, H., Tanioka,H., Yano, M. & Nagataki, S. (1994). Risk of hepatocellular carcinoma in patients with cirrhosis in Japan. Analysis of infectious hepatitis viruses. Cancer, Vol.74, No.8, (October 1994), pp. 2234-8, ISSN 0008-543X.
30) Malaguarnera, L., Rosa, M.D., Zambito, A.M., dell’Ombra, N., Marco, R.D. & Malaguarnera, M. (2006). Potential role of chitotriosidase gene in non-alcoholic fatty liver disease evolution. The American Journal of Gastroenterology, Vol.101, No.9, (September 2006),pp. 2060–2069, ISSN 0002-9270.
31) Malaguarnera, M., Di Rosa, M., Nicoletti, F. & Malaguarnera, L. (2009). Molecular mechanisms involved in NAFLD progression. Journal of Molecular Medicine, Vol.87, No.7, (July 2009), pp. 679–695. ISSN 0946-2716.
32) Seitz, H.K. & Becker, P. (2007). Alcohol metabolism and cancer risk. Alcohol Research &Health, Vol.30, No.1, (December 2007), pp. 38-41 44-47, ISSN 1535-7414.
33) Takano, S., Yokosuka, O., Imazeki, F., Tagawa, M. & Omata, M. (1995). Incidence of hepatocellular carcinoma in chronic hepatitis B and C: a prospective study of 251 patients. Hepatology, Vol.21, No.3, (march 1995), pp. 650-655, ISSN 0270-9139.
34) Nair, S., Mason, A., Eason, J., Loss, G. & Perrillo, R.P. (2002). Is obesity an independent risk factor for hepatocellular carcinoma in cirrhosis? Hepatology, Vol.36, No.1, (July2002), pp. 150-155, ISSN 0270-9139.
35) Yano, M., Kumada, H., Kage, M. Ikeda, K., Shimamatsu, K., Inoue, O., Hashimoto, E., Lefkowitch, J.H., Ludwig, J., Okuda, K. (1996). The long-term pathological evolution of chronic hepatitis C. Hepatology, Vol.23, No.6, (June 1996), pp. 13341340, ISSN 0270-9139.
36) Poynard, T., Bedossa, P. & Opolon, P. (1997). Natural history of liver fibrosis progression in patients with chronic hepatitis C. The OBSVIRC, METAVIR, CLINIVIR, and
DOSVIRC groups. Lancet, Vol.349, No.9055, (March 1997), pp. 825-832, ISSN 01406736.
37) Liaw, Y.F., Tai, D.I., Chen, T.J., Chu, C.M. & Huang, M.J. (1986). Alpha-fetoprotein changes in the course of chronic hepatitis: relation to bridging hepatic necrosis and hepatocellular carcinoma. Liver, Vol.6, No.3, (June 1986), pp. 133–137, ISSN 01069543.
38) Mulcahy, M.F. (2005) Management of hepatocellular cancer. Current Treatment Options in Oncology, Vol.6, No.5, (September 2005), pp. 423–435, ISSN 1527-2729.
39) Thomas, M.B. & Abbruzzese, J.L. (2005). Opportunities for targeted therapies in hepatocellular carcinoma. Journal of Clinical Oncology, Vol.23, No.31, (November 2005), pp. 8093–8108, ISSN 0732-183X.
40) Bosch, F.X., Ribes, J., Diaz, M. & Cleries, R. (2004). Primary liver cancer: worldwide incidence and trends. Gastroenterology, Vol.127, No. 5 Suppl.1, (November 2004), pp. S5–S16, ISSN 0016-5085.
41) Marrero, J.A., Kudo, M. & Bronowicki, J.P. (2010). The Challenge of Prognosis and Staging for Hepatocellular Carcinoma. The Oncologist, Vol.15, No.11 suppl 4, (November 2010), pp. 23–33, ISSN 1083-7159.
42) Malaguarnera, G., Giordano, M., Paladina, I., Berretta, M., Cappellani, A. & Malaguarnera, M. (2010). Serum markers of hepatocellular carcinoma. Digestive Diseases and Sciences, Vol.55, No.10, (October 2010), pp. 2744-55, ISSN 0163-2116.
43) Mann, C.D., Neal, C.P., Garcea, G., Manson, M.M., Dennison, A.R. & Berry, D.P. (2007). Prognostic molecular markers in hepatocellular carcinoma: a systematic review. European Journal of Cancer, Vol.43, No.6, (April 2007), pp. 979-92. ISSN 0959-8049.
44) Qin, L.X. & Tang, Z.Y. (2004). Recent progress in predictive biomarkers for metastatic recurrence of human hepatocellular carcinoma: a review of the literature. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology, Vol.130, No.9, (September 2004), pp. 497–513, ISSN 0171-5216.
45) Debruyne EN and Delanghe JR: Diagnosing and monitoring hepatocellular carcinoma with alpha-fetoprotein: new aspects and applications. Clin Chim Acta 395: 19-26, 2008.
46) Mizejewski, G.J. (2002). Biological role of alpha-fetoprotein in cancer: prospects for anticancer therapy. Expert Review of Anticancer Therapy, Vol.2, No.6, (December 2002), pp. 709–735, ISSN 1473-7140.
47) Terentiev, A.A. & Moldogazieva, N.T. (2006). Structural and functional mapping of alphafetoprotein. Biochemistry(Moscow),Vol.71,No.2, (February2006),pp.120–132,ISSN 0006-2979
48) D. S. Chen, J. L. Sung, and J. C. Sheu, “Serum α-fetoprotein in the early stage of human hepatocellular carcinoma,” Gastroenterology, vol. 86, no. 6, pp. 1404–1409, 1984.
49) J. T. Wu, “Serum alpha-fetoprotein and its lectin reactivity in liver diseases: a review,” Annals of Clinical and Laboratory Science, vol. 20, no. 2, pp. 98–105, 1990.
50) D. S. Chen, J. L. Sung, and J. C. Sheu, “Serum α-fetoprotein in the early stage of human hepatocellular carcinoma,” Gastroenterology, vol. 86, no. 6, pp. 1404–1409, 1984.
51) M. Capurro, I. R. Wanless, M. Sherman et al., “Glypican-3: a novel serum and histochemical marker for hepatocellular carcinoma,” Gastroenterology, vol. 125, no. 1, pp. 89–97, 2003.
52) T. Nakatsura, Y. Yoshitake, S. Senju et al., “Glypican-3, overexpressed specifically in human hepatocellular carcinoma, is anoveltumormarker,”Biochemical and Biophysical ResearchCommunications, vol. 306, no. 1, pp. 16–25, 2003.
53) Zittermann SI, Capurro MI, Shi W and Filmus J: Glypican-3 promotes the growth of hepatocellular carcinoma by stimulating canonical Wnt signaling. Cancer Res 65: 6245-6254, 2005.
54) H. Shirakawa, H. Suzuki, M. Shimomura et al., “Glypican-3 expression is correlated with poor prognosis in hepatocellularcarcinoma,” Cancer Science, vol. 100, no. 8, pp. 1403–1407,
2009.
55) Zittermann SI, Capurro MI, Shi W and Filmus J: SolubleGlypican 3 inhibits the growth of hepatocellular carcinomain vitro and in vivo. Int J Cancer 126: 1291-1301, 2010.
56) Shirakawa H, Kumnuma T, Nishimura Y, et al: Glypican-3 is a useful diagnostic marker for a component of hepatocellular carcinoma in human liver cancer. Int J Oncol 34: 649-656, 2009.
57) Joo M, Chi JG and Lee H: Expressions of HSP70 and HSP27 in hepatocellular carcinoma. J Korean Med Sci 20: 829-834, 2005.
58) Luk JM, Lam CT, Siu AF, et al: Proteomic profiling of hepatocellular carcinoma In Chinese cohort reveals heat-shock proteins (Hsp27, Hsp70, GRP78) up-regulation and their associated prognostic values. Proteomics 6:1049-1057,2006.
59) Shin E, Ryu HS, Kim SH, Jung H, Jang JJ and Lee K: The clinicopathological significance of heat shock protein 70 and glutamine synthetase expression in hepatocellular carcinoma. J Hepatobiliary Pancreat Sci 18: 544-550, 2011.
60) Tremosini S, Forner A, Boix L, et al: Prospective validation of an immunohistochemical panel (glypican 3, heat shock protein 70 and glutamine synthetase) in liver biopsies for diagnosis of very early hepatocellular carcinoma. Gut 61: 1481-1487, 2012.
61) Diehl JA, Yang W, Rimerman RA, Xiao H and Emili A: Hsc70 regulates accumulation of cyclin D1 and cyclin D1-dependent protein kinase. Mol Cell Biol 23: 1764-1774, 2003.
62) Calderwood SK, Khaleque MA, Sawyer DB and Ciocca DR: Heat shock proteins in cancer: chaperones of tumorigenesis. Trends Biochem Sci 31: 164-172, 2006.
63) Gebhardt R, Baldysiak-Figiel A, Krugel V, et al. Hepatocellular expression of glutamine synthetase: an indicator of morphogen actions as master regulators of zonation in adult liver. Prog Histochem Cytochem. 2007;41:201–266.
64) Osada T, Sakamoto M, Nagawa H, Yamamoto J, Matsuno Y, Iwamatsu A, et al. Acquisition of glutamine synthetase expression in human hepatocarcinogenesis: relation to disease recurrence and possible regulation by ubiquitin-dependent proteolysis. Cancer (Phila) 1999;85(4):819–31.
65) Cadoret A, Ovejero C, Terris B, Souil E, Lévy L, Lamers WH, Kitajewski J, et al. New targets of beta-catenin signaling in the liver are involved in the glutamine metabolism. Oncogene 2002; 21(54):8293–301.
66) Tabor E. The role of tumor suppressor genes in the development of hepatocellular carcinoma. In: Okuda K, Tabor E, eds. Liver Cancer. New York: Churchill Living- stone, 1997: 89–95.
67) Cox LS, Lane DP. Tumor suppressors, kinases and clumps: how p53 regulates the cell cycle in response to DNA damage. Bioassays 1995; 17: 501–508.
68) Jacks T, Weinberg RA. Cell cycle control and its watchman. Nature 1996; 381: 643–644.
69) Porter PL, Gown A, Kramp SG et al. Widespread p53 overexpression in human malignant tumors: an immunohistochemical study using methacarn-fixed, embedded tissue. Am J Pathol 1992; 140: 145–153.
70) Livni N, Eid A, Ilan Y et al. p53 expression in patients with cirrhosis with and without hepatocellular carcinoma. Cancer 1995; 75: 2420–2426.
71) Qin G, Su J, Ning Y et al. p53 expression in patients with hepatocellular carcinoma from the high incidence area of Guangxi, Southern China. Cancer Left 1997; 121: 203–210.
72) Skopelitou A, Hadjiyannakis M, Alexopoulou V et al. p53 expression in hepatocellular carcinoma in Greece. Correlation with epidemiological and histopathological data. Pathol Res Pract 1996; 192: 1100–1106.
73) Bourdon JC, d’Errico A, Paterlini P et al. P53 protein accumulation in European hepatocellular carcinoma is not always dependent on p53 gene mutation. Gastroenterology 1995; 108: 1176–1182.
74) Tannapfel A, Wasner M, Krause K et al. Expression of p53 and its relation to histopathology and prognosis in hepatocellular carcinoma. J Natl Cancer Inst 1999; 91: 1154– 1158.
75) Jaskiewitcz K, Banach L, Izycka E. Hepatocellular carcinoma in young patients: histology, cellular differentiation, HBV infection and oncoprotein p53. Anticancer Res 1995; 15: 2723–2725.
76) Kang YK, Kim CJ, Kim HO et al. P53 mutation and overexpression in hepatocellular carcinoma and dysplastic nodules in the liver. Virchows Arch 1998; 423: 27–32.
77) Yan BC, Gong C, Song J, Krausz T, Tretiakova M, Hyjek E, Al-Ahmadie H, Alves V, Xiao SY, Anders RA, Hart JA: Arginase-1: a new immunohistochemical marker of hepatocytes and hepatocellular neoplasms. Am J Surg Pathol 2010, 34(8):1147–1154.
78) Choi S, Park C, Ahn M, Lee JH, Shin T: Immunohistochemical study of arginase 1 and 2 in various tissues of rats. Acta Histochem 2012,114(5):487–494.
79) Multhaupt H, Fritz P, Schumacher K. Immunohistochemical localisation of arginase in human liver using monoclonal antibodies against human liver arginase. Histochemistry. 1987; 87:465–470.
80) Sekine S, Ogawa R, Mcmanus MT, et al. Dicer is required for proper liver zonation. J Pathol.2009; 219:365–372.
81) Chrzanowska A, Gajewska B, Baranczyk-Kuzma A. Arginase isoenzymes in human cirrhotic liver. Acta Biochim Pol. 2009; 56:465–469.
82) Chrzanowska A, Krawczyk M, Baranczyk-Kuzma A. Changes in arginase isoenzymes pattern in human hepatocellular carcinoma. Biochem Biophys Res Commun. 2008; 377:337–340.
83) Yan BC, Gong C, Song J, et al. Arginase-1: a new immunohistochemical marker of hepatocytes and hepatocellular neoplasms. Am J Surg Pathol. 2010;34:11471154.
84) Taylor SL, Haque S. Hepatobiliary pathology. Curr Opin Gastroenterol. 2011;27:248-255.
85) Mazen A. Ghanem, Theo H. Van der Kwast, Mondastri K.Sudaryo,Rejiv B. Mathoera, Marry M. van den Heuvel,Abdel-Alim M. Al-Doray,Rien M. Nijman, and Gert J. van Steenbrugge. MIB-1 (KI-67) Proliferation Index and Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p27Kip1Protein Expression in Nephroblastoma. Clinical Cancer Research 2004; 10: 591–597.
86) Li JQ, Zhang CQ, Zhang YQ, Yuan YF, Chen MS, Li GH. Immunohistochemical study of PCNA and p53 in primary liver aancer - an implication for prognosis and treatment. J Exp Clin Cancer Res 1996; 15: 77-80.
87) Ng IO, Chung LP, Tsang SW et al. P53 gene mutation spectrum in hepatocellular carcinomas in Hong Kong Chinese. Oncogene 1994;9: 985-990.
88) Hsu HC, Tseng HJ, Lai PL, Lee PH, Peng SY. Expression of p53 Gene in 184 unifocal hepatocellular carcinomas: association with tumor growth and invasiveness. Cancer Res 1993; 53: 4691-4694.
89) Tarao K, Shimizu A, Ohkawa S, Harada M, Ito Y, Tamai S,Kuni: Development of hepatocellular carcinoma associated increases in DNA synthesis in the surrounding cirrhosis. Gastroenterology. 1992; 103:595-600.
90) Ojanguren I, Ariza A, Llatjos M, Castella´ E, Mate JI, NavasPalacios: Proliferating cell nuclear antigen expression in normal, regenerative, and neoplastic liver: a fine-needle aspiration. Human Pathol.1993; 24: 905- 908.
91) Wennerberg AE, Nalesnik MA, Coleman WB. Hepatocyte paraffin1: a monoclonal antibody that reacts with hepatocytes and can be used for differential diagnosis of hepatic tumors. Am J Path 1993; 143:1050–1054.
92) Fasano M, Theise ND, Nalesnik M, et al. Immunohistochemical evaluation of hepatoblastomas with use of the hepatocyte-specificmarker, hepatocyte paraffin 1, and the polyclonal anti-carcinoembryonic antigen. Mod Pathol 1998;11:934–938.
93) Wennerberg AE, Nalesnik MA, Coleman WB. Hepatocyte paraffin1:A monoclonal antibody that reacts with hepatocytes and can be used for differential diagnosis of hepatic tumours. Am J Pathol. 1993;143: 1050-4.
94) Kakar S, Gown AM, Goodman ZD, Ferrell LD: Best practices in diagnostic immunohistochemistry: hepatocellular carcinoma versus metastatic neoplasms. Arch Pathol Lab Med 2007, 131:1648–1654.
95) Chu PG, Ishizawa S, Wu E, Weiss LM: Hepatocyte antigen as a marker of hepatocellular carcinoma: an immunohistochemical comparison to carcinoembryonic antigen, CD10, and alpha-fetoprotein. Am J Surg Pathol 2002, 26:978–988.
96) Wang L, Vuolo M, Suhrland MJ, Schlesinger K: HepPar1, MOC-, pCEA, mCEA and CD10 for distinguishing hepatocellular carcinoma vs. metastatic adenocarcinoma in liver fine needle aspirates. Acta Cytol 2006, 50:257–262.
97) Fan Z, van de Rijn M, Montgomery K, Rouse RV: Hep par 1 antibody stain for the differential diagnosis of hepatocellular carcinoma: 676 tumors tested using tissue microarrays and conventional tissue sections. Mod Pathol 2003, 16:137–144.
98) Leong AS, Sormunen RT, Tsui WM, Liew CT: Hep Par 1 and selected antibodies in the immunohistological distinction of hepatocellular carcinoma from cholangiocarcinoma, combined tumours and metastatic carcinoma. Histopathology 1998, 33:318–324.
99) Minervini MI, Demetris AJ, Lee RG, et al. Utilization of hepatocytespecific antibody in the immunocytochemical evaluation of liver tumors. Mod Pathol. 1997;10:686–692.
100) Murakata LA, Ishak KG, Nzeako UC. Clear cell carcinoma of the liver: a comparative immunohistochemical study with renal clear cell carcinoma.Mod Pathol. 2000;13:874–881.
101) Wu PC, Fang JW, Lau VK, et al. Classification of hepatocellular carcinoma according to hepatocellular and biliary differentiation markers. Clinical and biological implications. Am J Pathol. 1996;149:1167–1175.
102) Leong AS, Sormunen RT, Tsui WM, et al. Hep Par 1 and selected antibodies in the immunohistological distinction of hepatocellular carcinoma from cholangiocarcinoma, combined tumours and metastatic carcinoma. Histopathology. 1998;33:318–324.
103) Leong AS, Sormunen RT, Tsui WM, Liew CT. Hep Par 1 and selected antibodies in the immunohistological distinction of hepatocellular carcinoma from cholangiocarcinoma, combined tumors and metastatic carcinoma. Histopathology 1998;33:318–324.
104) Zimmerman RL, Burke MA, Young NA, Solomides CC, Bibbo M. Diagnostic value of hepatocyte paraffin 1 antibody to discriminate hepatocellular carcinoma from metastatic carcinoma in fine-needle aspiration biopsies of the liver. Cancer 2001;93:288–291.
105) Minervini MI, Demetris AJ, Lee RG, et al. Utilization of hepato- cyte-specific antibody in the immunocytochemical evaluation of liver tumors. Mod Pathol 1997;10:686–692.
106) Murakata LA, Ishak KG, Nzeako UC. Clear cell carcinoma of the liver: a comparative immunohistochemical study with renal clear cell carcinoma. Mod Pathol 2000;13:874–881.
107) Wu PC, Fang JW, Lau VK, et al. Classification of hepatocellular carcinoma according to hepatocellular and biliary differentiation markers. Clinical and biological implications. Am J Path 1996;149:1167–1175.
108) Kumagai I, Masuda T, Sato S, Ishiwaka K. Immunoreactivity to monoclonal antibody, Hep Par 1, in human hepatocellular carcinomas according to histopathological grade and histologic pattern. Hepatology Research 2001;20:312–319.
109) Freddie Bray, Jian-Song Ren, Eric Masuyer and Jacques Ferlay. Global estimates of cancer prevalence for 27 sites in the adult population in 2008. International Journal of Cancer,2013, 132, 1133–1145.
110)موگهی م, ثاقب ح, حیدری ز. روش های کاربردی و واژه شناسی تخصصی هیستوتکنیک، استریولوژی و مورفومتری.ویرایش سوم. تهران: دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی درمانی تهران معاونت پژوهشی،اداره چاپ و انتشارات;1391.
111) Mandarim-De-Lacerda CA. Stereological tools in biomedical research. AnAcad Bras Cienc. 2003;75(4):469-86.
112) Di Tommaso L, Destro A, Seok JY, et al. The application of markers (HSP70 GPC3 and GS) in liver biopsies is useful for detection of hepatocellular carcinoma. J Hepatol 2009; 50:746−54.
113) Di Tommaso L, Franchi G, Park YN, et al. Diagnostic value of HSP70, glypican 3, and glutamine synthetase in hepatocellular nodules in cirrhosis. Hepatology 2007; 45:725−34.
114) Di Tommaso L, Destro A, Fabbris V, et al. Diagnostic Accuracy of Clathrin Heavy Chain Staining in a Marker Panel for the Diagnosis of Small Hepatocellular Carcinoma. Hepatology 2011; 53:1549−57.
115) Kao J.H. and Chen D.S. Global control of hepatitis B virus infection. Lancet Infect Dis; 2002; 2, 395–403.
116) Baruch S. Blumberg. The curiosities of hepatitis B Virus prevention, sex ratio, and demography. The Proceedings of the American Thoracic Society; 2006; 3, 14-20.
117) Merat S, Malekzadeh R, Rezvan H, Khatibian M. Hepatitis B in Iran. Arch Iranian Med 2000;3:192-201.
118) Shamszad M, Farzadegan H. Hepatitis B related cirrhosis and hepatocellular carcinoma in Iran. J Irn Med Council 1982;8:238.
119) Deuffic S, Poynard T, Buffat L, Valleron AJ. Trends in primary liver cancer. Lancet 1998;351:214.
120) El-Serag HB, Mason AC. Rising incidence of hepatocellular carcinoma in the United States. N Engl J Med 1999;340:745-50.
121) -Law MG, Roberts SK, Dore GJ, Kaldor JM. Primary hepatocellular carcinoma in Australia, 1978-1997: increasing incidence and mortality. Med J Australia. 2000;173:403.
122) Siddique I, El-Naga HA, Memon A, Thalib L, Hasan F, Al-Nakib B. CLIP score as a prognostic indicator for hepatocellular carcinoma: experience with patients in the Middle East. Eur J Gastroenterol Hepatol 2004;16:675-80.
123) Koriech OM, Al-Kuhaymi R. Profile of cancer in Riyadh armed forces hospital. Head Neck 1994;497:10.
124) Hajiani E, Masjedizadeh R, Hashemi J, Azmi M, Rajabi T. Risk factors for hepatocellular carcinoma in Southern Iran. Saudi Med J 2005;26:974-7.
125) MoayedAlavian S, Hajarizadeh B, Ahmadzad-Asl M, Kabir A, BagheriLankarani K. Hepatitis B Virus infection in Iran. Hepatitis 2008;2008:28194.
126) Koziel M, Thio CH. Hepatitis B virus & hepatitis D virus. In: Mandell G, Bennet J, Dolin R. Principles and practices of infections disease. 7th ed. USA: Churchil Livingstone; 2010: 2059-2081.
127) Sharma SK, Saini N, Chwla Y. Hepatitis B virus: inactive carriers. Virol J 2005; 2: 82.
128) Dienstag J. Chronic hepatitis. In: Fauci A, Braunwald E, Kasper D, editors. Harrison’s principles of Internal Medicine. 17Th ed. USA: MC Graw Hill; 2008: 1955-1969.
129) Vinay Kumar, MBBS, MD, FRCPath, Abul K. Abbas, MBBS and Jon Aster, MD. Liver, Gallbladder, and Biliary Tract. In: Robbins Basic Pathology, 9th Edition, Philadelphia, PA : Elsevier Saunders;2013.
130) نوری موگهی سید محمد حسین، محمودزاده ثاقب حمیدرضا، حیدری زهرا، حسن مروتی. ضروریات استریولوژی کاربردی، انتشارات دانشگاه علوم پزشکی تهران1389.
131) نوری موگهی سید محمد حسین، محمودزاده ثاقب حمیدرضا، حیدری زهرا: روش های کاربردی و واژه شناسی تخصصی هیستوتکنیک، استریولوژی و مورفومتری،چاپ سوم ویرایش سوم. انتشارات دانشگاه علوم پزشکی تهران،1388.
132) سادات هاشمی سیدمهدی، قربانی راهب، کاوه یی بهروز. تعیین حجم نمونه در مطالعات جور شده. مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی سمنان، 1385، 1، 8، 55-62.


پرسشنامه یا فرم اطلاعاتی

پیوست ها
hide/show

نام فایل تاریخ درج فایل اندازه فایل دانلود
proposal.doc1394/01/151044992دانلود
proposal-ESLAH SHODE.doc1394/01/181061888دانلود
emza1.jpg1394/01/22407304دانلود
emza2.jpg1394/01/22572329دانلود
emza3.jpg1394/01/22493101دانلود
emza4.jpg1394/01/22304261دانلود
javabe davari.docx1394/04/1359105دانلود
proposal nahaee.doc1394/04/131030144دانلود
proposal nahaee2.doc1394/05/031028608دانلود
proposal nahaee3.doc1394/05/031031168دانلود