اثر درمان لیزر کم توان بر سلولهای فیبروبلاست لثه ای انسان

Effect of low level laser therapy on human gingival fibroblasts


چاپ صفحه 		پژوهان
صفحه نخست سامانه		 مجری و همکاران
مجری و همکاران		 اطلاعات تفضیلی
اطلاعات تفضیلی		 دانلود
دانلود 		علوم پزشکی زاهدان
علوم پزشکی زاهدان

مجریان:

کلمات کلیدی:

اطلاعات کلی طرح
hide/show

کد طرح 7347
عنوان فارسی طرح اثر درمان لیزر کم توان بر سلولهای فیبروبلاست لثه ای انسان
عنوان لاتین طرح Effect of low level laser therapy on human gingival fibroblasts
نوع طرح بنیادی-کاربردی
محل اجرای طرح دانشکده دندانپزشکی
رسته مطالعاتی مطالعه تجربی (Experimental)(مطالعه کمی)
دانشکده/مرکز دانشکده دندانپزشکی زاهدان
زمان اجرا -روز 180

اطلاعات مجری و همکاران
hide/show

نام و نام‌خانوادگی سمت در طرح نوع همکاری درجه‌تحصیلی پست الکترونیک
محمدایوب ریگی لادزمجری اول دکترای تخصصی dr.rigi@gmail.com
لیلا غلامیمجری دوم دندانپزشک متخصصl.gholami@hotmail.com
مهناز شهرکی پورمشاورمشاور آمارکارشناسی ارشدmahnaz@gmail.com

اطلاعات تفضیلی
hide/show

عنوان متن
خلاصه طرح به فارسی اثر درمان لیزر کم توان بر سلولهای فیبروبلاست لثه ای انسان
خلاصه طرح به لاتینEffect of low level laser therapy on human gingival fibroblasts
بيان مسئله تحقيق/اهمیت پژوهش
استفاده از لیزر کم توان به عنوان یک روش درمانی با اثرات بیولوژیک اولین بار توسط Mesterو همکاران در ١٩٦٨ پیشنهاد شد.١ در مورد اثرات تابش لیزری در دوزهای پایین در تغییر عملکرد سلولی مکانیزم های از جمله تحریک مولکولهای چرخه سلولی ، میتوکندری و تشدید تشکیل گرادیان پروتون الکترومکانیکی غشایی میتوکندری پیشنهاد می گردد. همچنین تاثیراتی در افزایش آزاد سازی کلسیم به سیتوپلاسم که موجب تحریک میتوز با افزایش موقتی در PH داخل سلولی و در نتیجه افزایش سیگنال های میتوژنیک در سلول وافزایش تولید ATP نیز مطرح شده است. ٢-٤
جهت رسیدن به نتایج مناسب دوز تابشی از اهمیت ویژه برخوردار است در واقع اگر تابش کمتر از میزان لازم ویا در زمان کوتاه داده شود اثرات مفید آن ایجاد نمی گردد و برعکس در دوز های تابش زیاد و یا در زمان طولانی نتایج مثبتی نخواهیم داشت وحتی گاهی اثرات سرکوبی می تواند ایجاد شود. در اغلب موارد در یک دوز تابشی اثرات معنی دار کلینیکی قابل مشاهده است. در موارد پاتولوژی های مزمن در برخی موارد نیازمند چند جلسه درمانی جهت رسیدن به نتایج مطلوب کلینیکی لازم میگردد. ٤-٧
درمانهای لیرز کم توان یا low level laser therapy (LLLT) بر اساس برخی مطالعات که تاکنون انجام شده است می تواند اثرات تحریک نوری (photostimulatory) داشته و در جهت تحریک رشد سلولی و متابولیسم و نیز بهبود رژنراسیون سلولی و پاسخ ضد التهابی موثر واقع شوند و بنابراین کاربردهای درمانی و کلینیکی مفیدی داشته باشند. ٨،٩
سلولهای فیبروبلاست لثه ای نقش مهمی در ترمیم زخم های دهانی دارند و تحریک تکثیر آنها می تواند در تسریع بهبود زخم های دهان موثر واقع شود.
تا کنون مطالعات متعددی اثر درمانهای لیزر های کم توان را بر ترمیم زخم و سلولهای متفاوت بررسی نموده اند. ١٠
از جمله در ٢٠٠٢ kreisle و همکاران به بررسی اثر لیزر دیود ٨٠٩nm به صورت کم توان بر تکثیر سلولهای فیبروبلاست لثه با انرژی های مختلف و زمانهای تابش متفاوت پرداختند و اثرات مثبتی از آن بر تکثیر سلولها گزارش نمودند١١
در مطالعه Saygun و همکاران در ٢٠٠٨ تکثیر سلولی و آزاد سازی فاکتورهای رشدی bFGF, IGE1, IGFBP3 در سلولهای فیبروبلاست لثه ای تحت تابش لیزر ٦٣٥nm به صورت کم توان مورد بررسی قرار گرفت که موجب افزایش تکثیر سلولی و نیز آزاد سازی این مواد شد.١٢
در سا ل ٢٠١٢ Basso و همکاران به بررسی تاثیر invitro تابش لیزر ٧٨٠nm با دوز های انرژی مختلف بر سلولهای فیبروبلاست لثه پرداختند و نتایج مثبت تابش های کم توان را در تحریک زیستی سلولها گزارش نمودند.١٣
همچنین در مطالعه ای دیگر در ٢٠١٢ اثر تابش لیزر 940 nm برتکثیر سلولی و تظاهر کلاژن نوع Iدر سلولهای فیبروبلاست لثه ای توسط Hakki و همکاران بررسی شد و اثرات مثبتی در تکثیر سلولی و افزایش تظاهر کلاژن و فاکتورهای رشدی گزارش شد.١٤



علیرغم مطالعات مختلف در این زمینه هنوز دستورات و پروتکل های مشخصی برای کاربرد لیزر های مختلف با توان کم در درمانهای دندانپزشکی وجود ندارد و نیازمند مطالعات دقیق تر در این حوزه جهت به دست آوردن پارامتر های کاربردی مناسب جهت درمانهای مکمل در دندانپزشکی می باشیم. همچنین مطالعات قبلی اکثرا بر روی طول موج های خاصی از لیزر ها در محدوده ٦٠٠-٨١٠ انجام شده اند. ١٥ با توجه به کاربردی شدن دستگاه های لیزر دیود دندانپزشکی با طول موج هایnm ٨١٠،٩٤٠و٩٨٠ در حوضه های مختلف درمانهای دندانپزشکی از جمله درمانهای پریودنتال و جراحی های دهان در این مطالعه ما به بررسی مقایسه ای in vitro این سه طول موج لیزری با دانسیته انرژی های متفاوت بر روی سلولهای فیبروبلاست لثه انسان خواهیم پرداخت.
سوالات و / یا فرضیات پژوهش1. میانگین در صد زنده ماندن سلولی بعد از تابش لیزر ٨١٠ با دانسیته های 0.5, 1.5, 2.5 2J/cm بعد از ٢٤ ،48 ساعت چقدر است 2. میانگین در صد زنده ماندن سلولی بعد از تابش لیزر ٩٤٠ با دانسیته های 0.5, 1.5, 2.5 2J/cm بعد از ٢٤ ،٤8 ساعت چقدر است 3. میانگین در صد زنده ماندن سلولی بعد از تابش لیزر ٩٨٠ با دانسیته های 0.5, 1.5, 2.5 2J/cm بعد از ٢٤ ،48 ساعت چقدر است 4. میانگین پرولیفراسیون سلولی بعد از تابش لیزر nm٨١٠ با دانسیته های 0.5, 1.5, 2.5 2J/cm بعد از ٢٤ ،48 و٧٢ ساعت چقدر است 5. میانگین پرولیفراسیون سلولی بعد از تابش لیزر ٩٤٠nm با دانسیته های 0.5, 1.5, 2.5 2J/cm بعد از ٢٤ ،48 و٧٢ ساعت چقدر است 6. میانگین پرولیفراسیون سلولی بعد از تابش لیزر ٩٨٠nm با دانسیته های 0.5, 1.5, 2.5 2J/cm بعد از ٢٤ ،48 و٧٢ ساعت چقدر است 7. میانگین در صد زنده ماندن سلولی بعد از تابش سه لیزر مورد بررسی با دانسیته های 0.5, 1.5, 2.5 2J/cm بعد از ٢٤ ،48 ساعت با هم تفاوت معنی دار دارد 8. میانگین پرولیفراسیون سلولی بعد از تابش سه لیزر مورد بررسی با دانسیته های 0.5, 1.5, 2.5 2J/cm بعد از ٢٤ ،٤8 و٧٢ ساعت با هم تفاوت دارد 9. آیا بعد از تابش سه لیزر مورد بررسی با دانسیته های 0.5, 1.5, 2.5 2J/cm سلولهای مورد مطالعه دچار تغییرات هسته میشوند؟
هدف کلی طرحاثر درمان لیزر کم توان بر سلولهای فیبروبلاست لثه ای انسان
اهداف اختصاصی1. تعیین میانگین در صد زنده ماندن سلولی بعد از تابش لیزر ٨١٠ با دانسیته های 0.5,1.5,2.5 2J/cm بعد از ٢٤ ،48 ساعت چقدر است؟ 2. تعیین میانگین در صد زنده ماندن سلولی بعد از تابش لیزر ٩٤٠ با دانسیته های 0.5,1.5,2.5 2J/cm بعد از ٢٤ ،48 ساعت چقدر است 3. تعیین میانگین در صد زنده ماندن سلولی بعد از تابش لیزر ٩٨٠ با دانسیته های 0.5,1.5,2.5 2J/cm بعد از ٢٤ ،48ساعت چقدر است 4. تعیین میانگین پرولیفراسیون سلولی بعد از تابش لیزر ٨١٠ با دانسیته های 0.5,1.5,2.5 2J/cm بعد از ٢٤ ،48 و٧٢ ساعت چقدر است 5. تعیین میانگین پرولیفراسیون سلولی بعد از تابش لیزر ٩٤٠ با دانسیته های 0.5,1.5,2.5 2J/cm بعد از ٢٤ ،48 و٧٢ ساعت چقدر است 6. تعیین میانگین پرولیفراسیون سلولی بعد از تابش لیزر ٩٨٠ با دانسیته های 0.5,1.5,2.5 2J/cm بعد از ٢٤ ،48 و٧٢ ساعت چقدر است 7. مقایسه میانگین در صد زنده ماندن سلولی بعد از تابش سه لیزر مورد بررسی با دانسیته های 0.5,1.5,2.5 2J/cm بعد از ٢٤ ،48 ساعت 8. مقایسه میانگین پرولیفراسیون سلولی بعد از تابش سه لیزر مورد بررسی با دانسیته های 0.5,1.5,2.5 2J/cm بعد از ٢٤ ،48 و٧٢ ساعت 9. بررسی وجود یا عدم وجود تغییر در هسته سلولهای مورد مطالعه بعد از تابش سه لیزر مورد بررسی با دانسیته های 0.5, 1.5, 2.5 2J/cm
سازمانها، مراکز و موسسات و سایر بهره برداران بالقوه دستاوردهای طرحدانشجویان دندانپزشکی، دندانپزشکان، متخصصین پریودانتیکس

تعریف واژه های تخصصی
آزمون MTT : جهت بررسی سمیت سلولی و در حقیقت زنده ماندن سلولی از آزمایش سنجش MTT استفاده میشود. MTT یک نمک تترازولیم زرد محلول در آب است. در اثر آنزیمهای دهیدروژناز میتوکندریایی که فقط در سلولهای زنده فعال میباشند، در حلقه MTT محلول شکستی ایجاد شده و به بلورهای آبی- بنفش رنگ فورمازان غیر محلول تبدیل میشود و میزان آن توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه گیری می شود
رنگ آمیزی Propidium Iodide: رنگی که جهت رنگ آمیزی DNAو هسته سول استفاده میشود و جهت افتراق سلولهای با هسته نرمال و غیر نرمال بکار میرود
نوع مطالعهتجربی
جامعه مورد مطالعه(معرفی مشارکت کنندگان)/ محیط پژوهش(معیارهای ورود و خروج ذکر شوند)سلولهای فیبروبلاست لثه ای انسانی تهیه شده از انستیتو پاستور ایران
همه سلولهایی که با موفقیت کشت داده شوند وارد مطالعه خواخند شد.
حجم نمونه و روش محاسبه آنبا توجه به اینکه مداخله بر روی نمونه های یکسان ودر شرایط آزمایشگاهی یکسان انجام می شود ونیز با توجه به مقالات مشابه 11و13 در هر گروه تحت بررسی در زمانهای مختلف حداقل ٦چاهک محیط کشت جهت 6 بار تکرار در هر گروه برای آزمون های زنده ماندن و تکثیر سلولی و یک چاهک سلولی جهت آزمون رنگامیزیPI در نظر گرفته خواهد شد
روش نمونه گیری(نحوه تخصیص تصادفی و همسانسازی در صورت لزوم ذکر شود)در دسترس
روش و ابزار جمع آوري داده ها / صحت و استحکام داده ها (پرسشنامه یا فرم اطلاعاتی ضمیمه شود)فرم اطلاعاتی ضمیمه 1
روش اجرای طرح(با جزئیات بطور کامل شرح داده شود)یبروبلاست لثه ی انسانی از انستیتو پاستور ایران خریداری شده. این رده‌ی سلولی در محیط کشت αMME حاوی 10% سرم گاوی (FBS) در فلاسک استریل کشت سلول کشت داده شده و پس از 2 تا 3 روز نیاز به تعویض محیط و بعد از یک هفته نیاز به پاساژ دادن دارند.

سلولهای پاساژ داده شده با تعداد 5000 سلول در هر خانه ی پلیت 96 خانه کشت داده خواهند شد و طبق شماره گذاری نوع درمان دریافتی را مشخص می نماییم
با توجه به ابعاد یک چاهک استاندارد پلیت ٩٦ خانه و تنظیمات لیزری برای هرکدام از لیزر های (Picasso,AMD lasers, USA)٨١٠ (Epic10, Biolase, USA)nm,٩٤٠( Velure S9, Lassering, Italy), nm ٩٨٠ در سه دانسیته انرژی 0.5, 1/5, 2/5 2J/cm تنظیم خواهد شد .
زنده ماندن سلولها بعد از تابش لیزر های مختلف در زمانهای ٢٤، ٤٨، ساعت با آزمون MTT و تکثیر سلولی بعد از 24،48،72 ساعت با اختصاص ٦چاهک سلولی جهت ٦ بار تکرار این آزمایش ها در هر گروه مورد بررسی انجام خواهد شد.
برای ارزیابی سمیت سلولی و در حقیقت زنده ماندن سلولها بعد از تابش های لیزری مختلف در این تحقیق از آزمایش سنجش MTT استفاده می‌شود. MTT یک نمک زرد رنگ تترازولیم محلول در آب است. در اثر آنزیم‌های دهیدروژناز میتوکندریایی که فقط در سلول‌های زنده فعال می‌باشند، در حلقه MTT محلول شکستی ایجاد شده و به بلورهای آبی رنگ فورمازان غیر محلول تبدیل می‌شود؛ لذا با استفاده از روش نور سنجی در طول موج 540-570 نانومتر میزان فورمازان که توسط دی متیل سولفوکساید یا حلال‌های دیگر به شکل محلول درآمده اندازه گیری شده و از طول موج 690 نانومتر رفراندوم کم شده و بدین وسیله میزان توده سلول‌های زنده تعیین می‌گردد.
در این آزمایش شدت رنگ تولید شده با تعداد سلول‌های زنده در ارتباط می‌باشد به این منظور سلول‌ها را به مدت 24 ساعت در انکوباتور قرار می‌دهیم. سپس آن‌ها را از انکوباتور خارج کرده و تعویض محیط کرده و مواد مورد آزمایش را به محیط کشت اضافه می کنیم. پس از 24 ساعت پلیت را از انکوباتور خارج و به هر چاهک 10 میکرو لیتر محلول MTT و 90 میکرو لیتر محیط کشت αMEM حاوی FBS10%اضافه کرده و سپس به مدت 4-3 ساعت در دمای ˚C37 انکوبه می‌شود. در این مرحله می‌توان بلورهای فورمازان را توسط میکروسکوپ معکوس در سلول‌های زنده مشاهده نمود. سپس محیط روئی هر چاهک را به آرامی خارج کرده و به هر چاهک 100 میکرو لیتر دی متیل سولفوکساید اضافه نموده و بعد از چندین بار پیپت کردن هر چاهک به منظور حل شدن بلورهای فورمازان، جذب نوری توسط دستگاه الایزا ریدر در طول موج 690-540 نانومتر خوانده می‌شود. نتایج به صورت در صد گزارش میگردد و کنترل این آزمون ١٠٠در صد در نظر گرفته میشود
جهت بررسی تکثیر سلولی (Proliferation) مانند قبل سلولها در تعداد ٥٠٠٠سلول در چاهک های پلیت ٩٦ خانه کشت میشوند و بعد از تابش لیزر و گذشت زمان های مورد نظر ( ٢٤،٢٤و ٧٢ ساعت بعد از تابش ) نمونه ها با رنگامیزی با تریپان بلو رنگامیزی شده و زیر میکروسکوپ نوری مورد شمارش قرار خواهند گرفت و نسبت افزایش آنها در مقایسه با شروع مطالعه به صورت عددی گزارش میشود. جهت دقت بیشتر مطالعه ٦ چاهک کشت برای هر دانسیه انرژی مورد بررسی در هر زمان مورد بررسی اختصاص داده خواهد شد که میانیگین نتیجه به دست آمده از نتایج هر ٦ بار گزارش شده و مورد مقایسه در آنالیز نتایج قرار خواهد گرفت. یک گروه از سلولها نیز بدون تابش و به عنوان گروه کنترل بررسی خواهند شد.
همچنین جهت بررسی تاثیرات تابش لیزرها بر هسته سلولها سلولهای کشت داده شده پس از ٧٢ ساعت در شرایط تاریکی رنگ هسته Propidium iodide با غلظت 1mlgr/mlPBS و ١٠٠بار رقیق شده تهیه شده و ١٠ میکرو لیتر از آن روی هریک از چاهک های سلولی مورد بررسی ریخته شده سپس بعد از ١-٢ دقیقه نمونه ها توسط محلول PBS شستشو داده شده و زیر میکروسکوپ فلورسنت از نظر تغییرات مورفولوژیک هسته مورد بررسی قرار خواهند گرفت.

روش تجزیه، تحليل و توصیف داده‌ها (نمونه‌اي از جدول توخالي ضميمه شود و روش هاي آماري مورد استفاده به طور كامل توضيح داده شود)(کیفی و کمی)با استفاده از روشهای آمار توصیفی (تنظیم جداول توزیع فراوانی، تعیین شاخص های مرکزی پراکندگی، رسم نمودار) و روشهای آمار تحلیلی (آزمونهای اندازه های تکراری و آنالیز واریانس یکطرفه و آزمون همبستگی و یا آزمونهای نا پارامتریک مشابه)داده ها در سطح اطمینان 95% و با استفاده از نرم افزار SPSS تجزیه و تحلیل خواهند شد. مقایسه میزان تکثیرسلولی در زمانهای مختلف تحت تابش دانسیته های انرژی متفاوت در لیزر های مورد مطالعه دانسیته انرژی 24 h Mean+SD 48 h 72 h P value 0.5 / 810nm 1.5 / 810nm 2.5 / 810nm 0.5 / 940nm 1.5 / 940nm 2.5 / 940nm 0.5 / 980nm 1.5 / 980nm 2.5 / 980nm بدون لیزر (کنترل) Pvalue
ملاحظات اخلاقی طبق کد ٤ فصل ٤ آیین نامه اخلاق در مورد نمونه‌هایی که هویت دهنده‌ی آن‌ها قابل ردیابی نباشد، می‌توان با استناد به رضایت‌نامه‌ی کلی اولیه، پژوهش‌های جدید را بدون اخذ رضایت‌نامه انجام داد.
محدودیتهای اجرائی طرح و پیش بینی جهت حل آنهااحتمال مرگ و آلودگی سلولهای در طی مراحل کشت و آزمایش. بدین منظور از افراد متخصص و با تجربه که سابقه انجام این کار را دارند استفاده خواهد شد
کلمات کلیدیLow level therapy laser- proliferation-Gingival fibroblasts
فهرست منابع و مراجع- Mester E, Szende B, Tota JG. Effect of laser on hair growth of mice. Kiserl Orvostud 1967;19:628–31.
2- karu T. Laser biostimulation: a photobiological phenomenon. J photochem photobiol B 1989;3(4):638-40
3- Friedmann H, Lubart R, Laulicht I, Rochkind S. A possible explanation of laser-induced stimulation and damage of cell cultures. J photochem photobiol B 1991;11(1):87-91
4-Carroll JD, Milward MR, Cooper PR,Hadis M, Palin WM. Developments in low level light therapy (LLLT) for dentistry. dent Mater.2014; 30(5):465-475.
5-Huang YY, Chen AC, Carroll JD, Hamblin MR. Biphasic dose response in low level light therapy. Dose Response 2009;7:358–83.
-
- 6- Huang YY, Sharma SK, Carroll JD, Hamblin MR. Biphasic dose response in low level light therapy – an update. Dose Response 2011;9:602–18.
- 7- Sommer AP, Pinheiro AL, Mester AR, Franke RP, Whelan HT. Biostimulatory windows in low-intensity laser activation: lasers, scanners, and NASA’s light-emitting diode array system. J Clin Laser Med Surg 2001;19:29–33..
- 8-Moore P1, Ridgway TD, Higbee RG, Howard EW, Lucroy MD. Effect of wavelength on low-intensity laser irradiation-stimulated cell proliferation in vitro. Lasers Surg Med. 2005 Jan;36(1):8-12.
9-Woodruff LD1, Bounkeo JM, Brannon WM, Dawes KS, Barham CD, Waddell DL, Enwemeka CS.The efficacy of laser therapy in wound repair: a meta-analysis of the literature. Photomed Laser Surg. 2004 Jun;22(3):241-7.


10- Kreisler M1, Christoffers AB, Al-Haj H, Willershausen B, d'Hoedt B. Low level 809-nm diode laser-induced in vitro stimulation of the proliferation of human gingival fibroblasts. Lasers Surg Med. 2002;30(5):365-9.
.

11-Lasers Med Sci. 2008 Apr;23(2):211-5. Epub 2007 Jul 10.
Effects of laser irradiation on the release of basic fibroblast growth factor (bFGF), insulin like growth factor-1 (IGF-1), and receptor of IGF-1 (IGFBP3) from gingival fibroblasts.
Saygun I1, Karacay S, Serdar M, Ural AU, Sencimen M, Kurtis B.

12-Int J Dent. 2012;2012:719452. doi: 10.1155/2012/719452. Epub 2012 Jul 15.
In vitro wound healing improvement by low-level laser therapy application in cultured gingival fibroblasts.
Basso FG1, Pansani TN, Turrioni AP, Bagnato VS, Hebling J, de Souza Costa CA.

13-Lasers Med Sci. 2012 Mar;27(2):325-31. doi: 10.1007/s10103-010-0879-5. Epub 2011 Jan 19.
Effects of different setting of diode laser on the mRNA expression of growth factors and type I collagen of human gingival fibroblasts.
Hakki SS1, Bozkurt SB.
14-Ginani F1, Soares DM, Barreto MP, Barboza CA. Effect of low-level laser therapy on mesenchymal stem cell proliferation: a systematic review. Lasers Med Sci. B Mar 13..
15-Peplow PV, Chung TY, Baxter GD. Laser photobiomodulation of proliferation of cells in culture: a review of human and animal studies. Photomed Laser Surg. 2010 Aug;28 Suppl 1:S3-40.
.
پرسشنامه یا فرم اطلاعاتی

پیوست ها
hide/show

نام فایل تاریخ درج فایل اندازه فایل دانلود
laser fibro.docx1394/03/05583723دانلود
laser fibro eslahat shora.doc1394/04/16329728دانلود
laser fibro eslahat shora 2.doc1394/05/03330240دانلود
komite akhlagh.doc1394/05/03320512دانلود