مقایسه تاثیر درمانهای لیزرکم توان با طول موج های متفاوت بر سلولهای بنیادی لیگامان پریودنتال

Comparing the effect of low level laser therapy with different wave lengths on periodontal ligament stem cells


چاپ صفحه 		پژوهان
صفحه نخست سامانه		 مجری و همکاران
مجری و همکاران		 اطلاعات تفضیلی
اطلاعات تفضیلی		 دانلود
دانلود 		علوم پزشکی زاهدان
علوم پزشکی زاهدان

مجریان:

کلمات کلیدی:

اطلاعات کلی طرح
hide/show

کد طرح 7348
عنوان فارسی طرح مقایسه تاثیر درمانهای لیزرکم توان با طول موج های متفاوت بر سلولهای بنیادی لیگامان پریودنتال
عنوان لاتین طرح Comparing the effect of low level laser therapy with different wave lengths on periodontal ligament stem cells
نوع طرح بنیادی-کاربردی
محل اجرای طرح دانشکده دندانپزشکی
رسته مطالعاتی مطالعه تجربی (Experimental)(مطالعه کمی)
دانشکده/مرکز دانشکده دندانپزشکی زاهدان
زمان اجرا -روز 180

اطلاعات مجری و همکاران
hide/show

نام و نام‌خانوادگی سمت در طرح نوع همکاری درجه‌تحصیلی پست الکترونیک
محمدایوب ریگی لادزمجری اول دکترای تخصصی dr.rigi@gmail.com
لیلا غلامیمجری دوم دندانپزشک متخصصl.gholami@hotmail.com
مهناز شهرکی پورمشاورمشاور آمارکارشناسی ارشدmahnaz@gmail.com

اطلاعات تفضیلی
hide/show

عنوان متن
خلاصه طرح به فارسی مقایسه تاثیر درمانهای لیزرکم توان با طول موج های متفاوت بر سلولهای بنیادی لیگامان پریودنتال
خلاصه طرح به لاتینComparing the effect of low level laser therapy with different wave lengths on periodontal ligament stem cells
بيان مسئله تحقيق/اهمیت پژوهش
سلولهای بنیادی مشتق از بافتهای دندانی اولین بار از ناحیهپالپ دندانهای دائمی استخراج شدند. پس از آن محققین موفق به جداسازی آنها از سایر بافتهای دندانی مانند فولیکول دندانی و لیگامان پریودنتال دندان گشتند. اهمیت کاربردی این سلولها در توانایی بالقوه تمایز آنها به رده های سلولی مختلف ماننداستئوبلاست سمنتوبلاست و... می باشد که در بازسازی بافتهای دندانی و پریودنتال ضروری میباشد و می توانند افق های جدیدی را در درمانهای رژنراتیو دندانپزشکی با استفاده از علم مهندسی بافت (Tissue engineering ) باز نماید.1-3
در سالهای اخیر پیشرفت های چشم گیری در زمینه تجهیزات دندانپزشکی صورت گرفته است و لیزر ها امروزه موارد کاربرد کلینیکی و درمانی مختلف در دندانپزشکی پیدا کرده است.

استفاده از لیزر کم توان به عنوان یک روش درمانی با اثرات بیولوژیک اولین بار توسط Mesterو همکاران در ١٩٦٨ پیشنهاد شد.4 در مورد اثرات تابش لیزری در دوزهای پایین در تغییر عملکرد سلولی مکانیزم های از جمله تحریک مولکولهای چرخه سلولی ، میتوکندری و تشدید تشکیل گرادیان پروتون الکترومکانیکی غشایی میتوکندری پیشنهاد می گردد. همچنین تاثیراتی در افزایش آزاد سازی کلسیم به سیتوپلاسم که موجب تحریک میتوز با افزایش موقتی در PH داخل سلولی و در نتیجه افزایش سیگنال های میتوژنیک در سلول وافزایش تولید ATP نیز مطرح شده است. 5-7


در زمینه بررسی تاثیر تابش لیزر کم توان بر روی سلولها ی مختلف از جمله سلولهای بنیادی مطالعات مختلفی صورت پذیرفته است اما هنوز نیازمند بررسی های دقیق تر جهت کاربردی کردن این نوع درمان بر روی سلولها خصوصا سلولهای بنیادی مشتق از بافت های دندانی می باشیم

در مطالعه ای توسط Mvula در ٢٠٠٨ اثر لیزر کم توان با طول موج ٦٣٠nm بر سلولهای بنیادی مشتق از بافت چربی انسان بررسی گردید و اثرات تحریکی بر تکثیر این سلولها گزارش شد.8
در سال ٢٠٠٨ همچنین Eduardoو همکاران به بررسی اثر لیزر ٦٦٠nm با توان کم بر روی سلولهای بنیادی مشتق از پالپ دندان پرداختند و اثرات مثبت تابش ٢٠mw را در مقایسه با تابش ٤٠mw مشخص نمودند.9
در مطالعهای دیگر با استفاده از لیزر ٦٦٠nm در ٢٠١٢ Pereira و همکاران به بررسی ٤ دانسیته انرژی مختلف بر سلولهای بنیادی جدا شده از پالپ دندان سالم و ملتهب گزارش نمودند که این تابش در درز های بالا تمایز وتکثیر سلولی را بهبود نمی بخشید و فقط در دوزهای پایین تر اثرات مثبت مشاهده گردید.10
در سال ٢٠١٢ Soleimani و همکاران با آزمایش بر روی سلولهای بنیادی مشتق از مغز استخوان با لیزر 810nm مشاهده نمودند که تنها در دوز های تابشی زیر ٦J/cm2 می توان اثرات مثبت بر بر تکثیر سلولی مشاهده نمود.11
طبق بررسی ما تا کنون تنها یک مطالعه به بررسی تاثیر لیزر کم توان بر سلولهای بنیادی مشتق از لیگامان پریودنتال دندان پرداخته اند. در سال 2015 Soares و همکاران اثر لیزر ٦٦٠nmرا به صورت کم توان بر روی این سلولها مطالعه کردند و تاثیر مثبت دانسیته انرژی ١ J/cm2 را بر افزایش تکثیر این سلولها گزارش نمودند.12
از آنجا که در مطالعاتی تا کنون انجام شده از لیزرهای با طول موج محدوده نور مرئی استفاده شده است و به امکان تاثیرات متفاوت طول موج های مختلف در این مطالعه بر آن هستیم که به بررسی تاثیرات ٣ لیزر دیود با طول موج های ناحیه مادون قرمز (٩٨٠،٩٤٠،٨١٠nm) که امروزه به طور متداولتری در دندانپزشکی و از جمله در جراحی های دهان مورد استفاده قرار میگیرند بر سلولهای بنیادی جدا شده از لیگامان پریودنتال انسان بپردازیم .

سوالات و / یا فرضیات پژوهش1. میانگین در صد زنده ماندن سلولی بعد از تابش لیزر ٨١٠ با دانسیته های 0.5,1.5,2.5 J/cm2 بعد از ٢٤ ،48 ساعت چقدر است
2. میانگین در صد زنده ماندن سلولی بعد از تابش لیزر ٩٤٠ با دانسیته های 0.5,1.5,2.5 J/cm2 بعد از ٢٤ ،48ساعت چقدر است
3. میانگین در صد زنده ماندن سلولی بعد از تابش لیزر ٩٨٠ با دانسیته های 0.5,1.5,2.5 J/cm2 بعد از ٢٤ ،48 ساعت چقدر است
4. میانگین پرولیفراسیون سلولی بعد از تابش لیزر ٨١٠ با دانسیته های 0.5,1.5,2.5 J/cm2 بعد از ٢٤ ،48 و٧٢ ساعت چقدر است
5. میانگین پرولیفراسیون سلولی بعد از تابش لیزر ٩٤٠ با دانسیته های 0.5,1.5,2.5 J/cm2 بعد از ٢٤ ،48 و٧٢ ساعت چقدر است
6. میانگین پرولیفراسیون سلولی بعد از تابش لیزر ٩٨٠ با دانسیته های 0.5,1.5,2.5 J/cm2 بعد از ٢٤ ،48 و٧٢ ساعت چقدر است
7. میانگین در صد زنده ماندن سلولی بعد از تابش سه لیزر مورد بررسی با دانسیته های 0.5,1.5,2.5 J/cm2 بعد از ٢٤ ،48 ساعت با هم تفاوت معنی دار دارد

8. میانگین پرولیفراسیون سلولی بعد از تابش سه لیزر مورد بررسی با دانسیته های 0.5,1.5,2.5 J/cm2 بعد از ٢٤ ،48 و٧٢ ساعت با هم تفاوت معنی دار دارد

هدف کلی طرحمقایسه تاثیر درمانهای لیزرکم توان با سه طول موج لیزر متفاوت بر سلولهای بنیادی لیگامان پریودنتال
اهداف اختصاصی1. تعیین میانگین در صد زنده ماندن سلولی بعد از تابش لیزر ٨١٠ با دانسیته های 0.5,1.5,2.5 J/cm2 بعد از ٢٤ ،48 ساعت چقدر است
2. تعیین میانگین در صد زنده ماندن سلولی بعد از تابش لیزر ٩٤٠ با دانسیته های 0.5,1.5,2.5 J/cm2 بعد از ٢٤ ،48 ساعت چقدر است
3. تعیین میانگین در صد زنده ماندن سلولی بعد از تابش لیزر ٩٨٠ با دانسیته های 0.5,1.5,2.5 J/cm2 بعد از ٢٤ ،48 ساعت چقدر است
4. تعیین میانگین پرولیفراسیون سلولی بعد از تابش لیزر ٨١٠ با دانسیته های 0.5,1.5,2.5 J/cm2 بعد از ٢٤ ،٢٤ و48 ساعت چقدر است
5. تعیین میانگین پرولیفراسیون سلولی بعد از تابش لیزر ٩٤٠ با دانسیته های 0.5,1.5,2.5 J/cm2 بعد از ٢٤ ،48 و٧٢ ساعت چقدر است
6. تعیین میانگین پرولیفراسیون سلولی بعد از تابش لیزر ٩٨٠ با دانسیته های 0.5,1.5,2.5 J/cm2 بعد از ٢٤ ،48٤ و٧٢ ساعت چقدر است
7. مقایسه میانگین در صد زنده ماندن سلولی بعد از تابش سه لیزر مورد بررسی با دانسیته های 0.5,1.5,2.5 J/cm2 بعد از ٢٤ ،48 ساعت
8. مقایسه میانگین پرولیفراسیون سلولی بعد از تابش سه لیزر مورد بررسی با دانسیته های 0.5,1.5,2.5 J/cm2 بعد از ٢٤ ،48 و٧٢ ساعت
سازمانها، مراکز و موسسات و سایر بهره برداران بالقوه دستاوردهای طرحدندانپزشکان، متخصصین پریودنتولوژی
تعریف واژه های تخصصیآزمون MTT : جهت بررسی سمیت سلولی و در حقیقت زنده ماندن سلولی از آزمایش سنجش MTT استفاده میشود. MTT یک نمک تترازولیم زرد محلول در آب است. در اثر آنزیمهای دهیدروژناز میتوکندریایی که فقط در سلولهای زنده فعال میباشند، در حلقه MTT محلول شکستی ایجاد شده و به بلورهای آبی- بنفش رنگ فورمازان غیر محلول تبدیل میشود و میزان آن توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه گیری می شود
رنگامیزی Propidium Iodide: رنگی که جهت رنگامیزی DNAو هسته سول استفاده میشود و جهت افتراق سلولهای با هسته نرمال و غیر نرمال بکار میرود
نوع مطالعهتجربی
جامعه مورد مطالعه(معرفی مشارکت کنندگان)/ محیط پژوهش(معیارهای ورود و خروج ذکر شوند)سلولهای بنیادی جدا شده از لیگامان پریودنتال
حجم نمونه و روش محاسبه آنبا توجه به اینکه مداخله بر روی نمونه های یکسان ودر شرایط آزمایشگاهی یکسان انجام می شود ونیز با توجه به مقالات مشابه12 در هر گروه مورد بررسی ٦چاهک محیط کشت برای آزمون های زنده ماندن سلولی و تکثیر سلولی در زمانهای مختلف در نظر گرفته خواهد شد
روش نمونه گیری(نحوه تخصیص تصادفی و همسانسازی در صورت لزوم ذکر شود)در دسترس
روش و ابزار جمع آوري داده ها / صحت و استحکام داده ها (پرسشنامه یا فرم اطلاعاتی ضمیمه شود)فرم اطلاعاتی ضمیمه شماره ١ ، شامل اطلاعات مربوط به گروه های مورد مطالعه در زمان های مختلف







روش اجرای طرح(با جزئیات بطور کامل شرح داده شود)
جهت جدا نمودن سلولهای بنیادی دو دندان پرمولر سالم که دچار انکلیوز یا تحلیل ریشه نباشند و به دلایل ارتودنسی نیاز به کشیدن آنها باشد پس از گرفتن رضایت آگاهانه با حداقل تروما کشیده خواهند شد. بلافاصله بعد ازکشیدن زمانی که هنوز تاج دندان در فرسپس قرار دارد بوسیله دیسک به همراه شستشو با نرمال سالین ریشه از تاج جدا شده و با احتیاط لازم جهت جلوگیری از آسیب به لیگامان پریو دنتال در محیط حاوی DMEM قرار داده شده و به آزمایشگاه منتقل میگردند

بمنظور تأیید هویت مزانشیمی سلولهای کشت داده‌شده، از روش فلوسیتومتری جهت تعیین درصد سلولهای مزانشیمی با ردیابی CD105, CD 90 (Chemicon) به عنوان مارکر های سلولهای مزانشیمی و نیز (Chemicon) CD45, به عنوان مارکر سلولهای هموتوپوئیتیک استفاده خواهد شد که منفی شدن آن نشان دهنده مزانشیمی بودن سلولهای جدا شده می باشد. جهت انجام فلوسیتومتری سلولها پس از شستشو با محلول شستشوی مخصوص فلوسیتومتری (که حاوی PBS، 1% سرم و 058/0% EDTA می‌باشد) به مدت 30 دقیقه با فرمالدهید 4% فیکس گردید و در مرحله بعدی با آنتی بادی‌های مورد نظر که شامل CD105 ، CD90، CD45 بوده و به صورت مستقیم به یک آنتی بادی ثانویه فلورسنت متصل بودند انکوبه می شوند. انکوباسیون آنتی بادیهای مورد استفاده به مدت 40 دقیقه انجام گرفت و بعد از فیکس مجدد سلولها با پارافرمالدهید 1% توسط دستگاه فلوسیتومتری نمونه Bectin Dekenson و نرم‌افزار Win MDI 2.8 مورد بررسی قرار گرفتند.

سلولهای پاساژ سوم با تعداد 5000 سلول در هر خانه ی پلیت 96 خانه کشت داده خواهند شد و طبق شماره گذاری نوع درمان لیزر دریافتی را مشخص می نماییم و در فرم ضمیمه ١ ثبت می نماییم
با توجه به ابعاد یک چاهک استاندارد پلیت ٩٦ خانه و تنظیمات لیزری برای هرکدام از لیزر های (Picasso,AMD lasers, USA)٨١٠ (Epic10, Biolase, USA) , nm,٩٤٠( Velure S9, Lassering, Italy), nm ٩٨٠ سه دانسیته انرژی 0.5, 1/5, 2/5 J/cm2 تنظیم خواهد شد یعنی ٩ گروه و جهت بررسی زنده ماندن سلولها بعد از تابش لیزر های مختلف در زمانهای ٢٤، ٤٨ساعت با آزمون های زنده ماندن سلولی و تکثیر سلولی ٦ چاهک سلولی جهت ٦ بار تکرار این آزمایش در هر گروه مورد بررسی اختصاص داده خواهد شد.
برای ارزیابی سمیت سلولی و در حقیقت زنده ماندن سلولها بعد از تابش های لیزری مختلف در این تحقیق از آزمایش سنجش MTT استفاده می‌شود. MTT یک نمک زرد رنگ تترازولیم محلول در آب است. در اثر آنزیم‌های دهیدروژناز میتوکندریایی که فقط در سلول‌های زنده فعال می‌باشند، در حلقه MTT محلول شکستی ایجاد شده و به بلورهای آبی رنگ فورمازان غیر محلول تبدیل می‌شود؛ لذا با استفاده از روش نور سنجی در طول موج 540-570 نانومتر میزان فورمازان که توسط دی متیل سولفوکساید یا حلال‌های دیگر به شکل محلول درآمده اندازه گیری شده و از طول موج 690 نانومتر رفراندوم کم شده و بدین وسیله میزان توده سلول‌های زنده تعیین می‌گردد.
در این آزمایش شدت رنگ تولید شده با تعداد سلول‌های زنده در ارتباط می‌باشد به این منظور سلول‌ها را به مدت 24 ساعت در انکوباتور قرار می‌دهیم. سپس آن‌ها را از انکوباتور خارج کرده و تعویض محیط کرده و مواد مورد آزمایش را به محیط کشت اضافه می کنیم. پس از 24 ساعت پلیت را از انکوباتور خارج و به هر چاهک 10 میکرو لیتر محلول MTT و 90 میکرو لیتر محیط کشت αMEM حاوی FBS10%اضافه کرده و سپس به مدت 4-3 ساعت در دمای ˚C37 انکوبه می‌شود. در این مرحله می‌توان بلورهای فورمازان را توسط میکروسکوپ معکوس در سلول‌های زنده مشاهده نمود. سپس محیط روئی هر چاهک را به آرامی خارج کرده و به هر چاهک 100 میکرو لیتر دی متیل سولفوکساید اضافه نموده و بعد از چندین بار پیپت کردن هر چاهک به منظور حل شدن بلورهای فورمازان، جذب نوری توسط دستگاه الایزا ریدر در طول موج 690-540 نانومتر خوانده می‌شود. نتایج به صورت در صد گزارش میگردد و کنترل این آزمون ١٠٠در صد در نظر گرفته میشود
جهت بررسی تکثیر سلولی (Proliferation) مانند قبل سلولها در تعداد ٥٠٠٠سلول در چاهک های پلیت ٩٦ خانه کشت میشوند و بعد از تابش لیزر و گذشت زمان های مورد نظر ( ٢٤،٢٤و ٧٢ ساعت بعد از تابش ) نمونه ها با رنگامیزی با تریپان بلو رنگامیزی شده و زیر میکروسکوپ نوری مورد شمارش قرار خواهند گرفت و نسبت افزایش آنها در مقایسه با شروع مطالعه به صورت عددی گزارش میشود. جهت دقت بیشتر مطالعه ٦ چاهک کشت برای هر دانسیه انرژی مورد بررسی در هر زمان مورد بررسی اختصاص داده خواهد شد که میانیگین نتیجه به دست آمده از نتایج هر ٦ بار گزارش شده و مورد مقایسه در آنالیز نتایج قرار خواهد گرفت. یک گروه از سلولها نیز بدون تابش و به عنوان گروه کنترل بررسی خواهند شد.
همچنین جهت بررسی تاثیرات تابش لیزرها بر هسته سلولها سلولهای کشت داده شده پس از ٧٢ ساعت در شرایط تاریکی رنگ هسته Propidium iodide (Sima,Iran)با غلظت 1mlgr/mlPBS و ١٠٠بار رقیق شده تهیه شده و ١٠ میکرو لیتر از آن روی هریک از چاهک های سلولی مورد بررسی ریخته شده سپس بعد از ١-٢ دقیقه نمونه ها توسط محلول PBS شستشو داده شده و زیر میکروسکوپ فلورسنت از نظر تغییرات مورفولوژیک هسته مورد بررسی قرار خواهند گرفت. یک گروه بدون تابش لیزری نیز به همین روش مورد بررسی و مقایسه قرار خواهد گرفت.

روش تجزیه، تحليل و توصیف داده‌ها (نمونه‌اي از جدول توخالي ضميمه شود و روش هاي آماري مورد استفاده به طور كامل توضيح داده شود)(کیفی و کمی)با استفاده از روشهای آمار توصیفی (تنظیم جداول توزیع فراوانی، تعیین شاخص های مرکزی پراکندگی، رسم نمودار) و روشهای آمار تحلیلی (آزمونهای اندازه های تکراری و آنالیز واریانس یکطرفه و آزمون همبستگی و یا آزمونهای نا پارامتریک مشابه)داده ها در سطح اطمینان 95% و با استفاده از نرم افزار SPSS تجزیه و تحلیل خواهند شد.

مقایسه میزان تکثیرسلولی در زمانهای مختلف تحت تابش دانسیته های انرژی متفاوت در لیزر های مورد مطالعه




دانسیته انرژی
24 h
Mean+SD 48 h 72 h P value
0.5 / 810nm
1.5 / 810nm
2.5 / 810nm
0.5 / 940nm
1.5 / 940nm
1.5 / 940nm
0.5 / 980nm
1.5 / 980nm
بدون لیزر
P value
ملاحظات اخلاقی کدهای ١٠،١١ از راهنمای اخلاقی پژوهش با سلول‌های بنیادی
رعایت خواهند شد.
محدودیتهای اجرائی طرح و پیش بینی جهت حل آنهااحتمال مرگ و آلودگی سلولهای در طی مراحل کشت و آزمایش. بدین منظور از افراد متخصص و با تجربه که سابقه انجام این کار را دارند استفاده خواهد شد
کلمات کلیدیLaser therapy low level, Proliferatipon, stem cells
فهرست منابع و مراجع-. Gronthos S, Mankani M, Brahim J, et al. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 2000;97:13625–13630.

2- Caplan AI. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res 1991;9: 641–650.
3- Kuznetsov SA, Krebsbach PH, Satomura K, Kerr J, Rimi- nucci M, Benayahu D, Robey PG. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. J Bone Miner Res 1997;12:1335– 1347.
4- Mester E, Szende B, Tota JG. Effect of laser on hair growth of mice. Kiserl Orvostud .1967;19:628–31.
5- karu T. Laser biostimulation: a photobiological phenomenon. J photochem photobiol B 1989;3(4):638-40
6- Friedmann H, Lubart R, Laulicht I, Rochkind S. A possible explanation of laser-induced stimulation and damage of cell cultures. J photochem photobiol B 1991;11(1):87-91
7-Carroll JD, Milward MR, Cooper PR,Hadis M, Palin WM. Developments in low level light therapy (LLLT) for dentistry. dent Mater.2014; 30(5):465-475.
8-Mvula B, Mathope T, Moore T, Abrahamse H (2008) The effect of low-level laser irradiation on adult human adipose-derived stem cells. Lasers Med Sci 23(3):277–282
9- Eduardo Fde P, Bueno DF, de Freitas PM et al (2008) Stem cell proliferation under low-intensity laser irradiation: a preliminary study. Lasers Surg Med 40(6):433–438 134..

10-Pereira LO, Longo JPF, Azevedo RB Laser irradiation did not increase the proliferation or the differentiation of stem cells from normal and inflamed dental pulp. Arch Oral Biol. 2012;57(8):1079–1085.
11-Soleimani M, Abbasnia E, Fathi M, Sahraei H, Fathi Y, Kaka G. The effects of low-level laser irradiation on differentiation and proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells into neurons and osteoblasts: an in vitro study. Laser Med Sci. 2012; 27(2):423–430.
12- Soares DM1, Ginani F, Henriques ÁG, Barboza CA.Effects of laser therapy on the proliferation of human periodontal ligament stem cells.Lasers Med Sci. 2015 Apr;30(3):1171-4


پرسشنامه یا فرم اطلاعاتی

پیوست ها
hide/show

نام فایل تاریخ درج فایل اندازه فایل دانلود
6- laser PDLSC.docx1394/03/05587865دانلود
laser PDLSC eslahat shora.doc1394/04/16350208دانلود
komite akhlagh.doc1394/05/03347136دانلود