چاپ صفحه |  صفحه نخست سامانه |  مجری و همکاران |  اطلاعات تفضیلی |  دانلود | علوم پزشکی زاهدان |
| کد طرح | 7487 |
| عنوان فارسی طرح | تعیین خصوصیات فیزیکوشیمیایی و بررسی پاسخ ایمنی ایجاد شده توسط نانولیپوزومهای حاوی آنتی ژن لیشمانیا و ادجوانت Imiquimod درمدل موشی |
| عنوان لاتین طرح | Physicochemical characterization and evaluation of induced immune response with Nanoliposomes containing Leishmania antigens and adjuvant Imiquimod in murine model |
| نوع طرح | بنیادی-کاربردی |
| محل اجرای طرح | مرکز تحقیقات بیماریهای عفونی و گرمسیری |
| رسته مطالعاتی | تحقیقی- تجربی |
| دانشکده/مرکز | دانشکده پزشکی زاهدان |
| زمان اجرا -روز | 450 |
| نام و نامخانوادگی | سمت در طرح | نوع همکاری | درجهتحصیلی | پست الکترونیک |
|---|---|---|---|---|
| احمد مهرآوران | مجری | اجراء طرح | دکترای تخصصی | ahmadmehravaran55@gmail.com |
| عنوان | متن |
|---|---|
| خلاصه طرح به فارسی | تعیین خصوصیات فیزیکوشیمیایی و بررسی پاسخ ایمنی ایجاد شده توسط نانولیپوزومهای حاوی آنتی ژن لیشمانیا و ادجوانت Imiquimod درمدل موشی |
| خلاصه طرح به لاتین | Physicochemical characterization and evaluation of induced immune response with Nanoliposomes containing Leishmania antigens and adjuvant Imiquimod in murine model |
| محل اول بکارگیری نتایج تحقیق | |
| بيان مسئله تحقيق/اهمیت پژوهش | بیان مسئله تحقیق (مشتمل بر مرور تحقیقات گذشته داخلی وخارجی مرتبط با موضوع با ذکر منابع و توجیه ضرورت انجام طرح) : طبق آمار سازمان جهانی بهداشت(WHO/TDR) موارد لیشمانیوز موجود در دنیا 12 میلیون نفر و تعداد افراد در معرض خطر 350 میلیون نفر تخمین زده می شود، سالک از انواع دیگر بیماری (احشایی و مخاطی-پوستی) شایع تر بوده بطوریکه هر ساله نزدیک به 70% کل موارد جدید گزارش شده (حدود 5/1-1 میلیون نفر) مربوط به این شکل بیماری می باشد و 90% موارد سالک جهان از کشورهای ایران، افغانستان، عربستان سعودی ، سوریه، برزیل و پرو گزارش شده است. درمان لیشمانیوز به کمک ترکیبات آنتی موآن صورت می گیرد که گرانقیمت بوده و همراه با عوارض جانبی است و متاسفانه همیشه موثر نیست. درمان استاندارد با وجود هزینه های سنگین و اثرات جانبی همیشه موثر نیست و همچنین مقاومت دارویی به خصوص در موارد انواع آنتروپونوتیک گزارش شده است. مبارزه با مخازن و ناقلین نیاز به بودجه کلان دارد و خصوصا در مواردی که مخزن بیماری انسان نیست تقریبا موفق نبوده است. بنظر می رسد که تنها راه مبارزه با این بیماری یافتن واکسنی موثر می باشد و بنا به دلایل متعدد از جمله مصونیت دراز مدت بعد از بهبودی از این بیماری و.... پژوهشگران بر این باورند که یافتن چنین واکسنی امکان پذیر است و یافتن واکسنی موثر گامی بلند در رفع این مشکل خواهد بود. از نظر تاریخی موثر ترین روش پیشگیری لیشمانیزاسیون است، این روش از قرنها پیش بعنوان روش پیشگیری در ایران باستان مرسوم بوده است اما به دلیل مشکلات عدیده این روش از جمله فقدان روش مناسب استاندارد کردن لیشمانیا ماژور، که باعث عدم کنترل میزان بروز زخم و پیشرفت ضایعه می گردد، امروزه کمتر مورد توجه قرار گرفته است. روش پیشگیری ایده آل می بایست کمترین عوارض جانبی و بالاترین میزان اثربخشی را داشته باشد که تاکنون در مورد لیشمانیزاسیون امکان دسترسی به آن نبوده است و اگر عوارض ناشی از تلقیح انگل زنده را بتوان به نحوی کاهش داد شاید بتوان از لیشمانیزاسیون بعنوان روش پیشگیری و ارزیابی واکسن ها استفاده کرد. از آنجاییکه تا کنون از میان نسل های مختلف واکسن های تحقیقاتی علیه لیشمانیوز تنها واکسن های نسل اول (اجزای انگل کشته شده) در فاز 3 کارآزمائی بالینی ارزیابی شده و بیشترین اثربخشی مربوط به این نسل از واکسن ها بوده است، در این مطالعه نیز یک نوع آنتی ژن لیشمانیا از نسل اول ( SLA) به عنوان عامل ایمنی زا انتخاب شده است. لیشمانیاهای بیماریزا خاص پستانداران بوده و اکثرا برای انسان بیماریزا می باشند. گونه های مختلف این جنس به دو شکل کلی بدون تاژک (آماستیگوت) داخل سلولی در میزبان مهره دار و تاژک دار (پروماستیگوت) خارج سلولی در میزبان بی مهره (پشه خاکی) یا محیط کشت دیده می شود. پروماستیگوت های موجود دربدن پشه خاکی به محض ورود به بدن میزبان مهره دار توسط سلولهای بیگانه خوار تک هسته ای یا ماکروفاژها مورد حمله واقع شده و به طریق فاگوسیتوز بلعیده می شوند.در داخل ماکروفاژ، پروماستیگوت ها به آماستیگوت تبدیل می شوند. این تبدیل در 24 ساعت اولیه ورود پروماستیگوت ها رخ می دهد. بعد از ورود انگل به داخل بدن میزبان مهره دار، سیستم ایمنی میزبان واکنش نشان می دهد. پاسخ سیستم ایمنی ازطریق ایمنی ذاتی و ایمنی اختصاصی (ایمنی سلولی و ایمنی هومورال) بر علیه انگل اعمال می شود. (1-4) ایمنی ذاتی وابسته به سلولهای کشنده طبیعی، ماستوسیتها، ماکروفاژها، دندرتیک ها و گرانولوسیتها است که فورا وارد واکنش شده و مقادیر قابل توجهی از سایتوکاینها را ترشح میکنند تا سلولهای T ویژه آنتی ژنهای لیشمانیا را در محل بسیج کنند. سلولهای NK (Natural Killer Cell) در مراحل اولیه عفونت نقش اساسی را در تولید IFN- (Interferon-γ) برعهده دارند (5, 2). این سلولها با تولید IFN- درشروع پاسخ Th1 (T helper 1) موثر هستند. IFN- باعث تمایز زیر رده CD4+/Th1 شده و باعث مقاومت اولیه نسبت به لیشمانیا ماژور (L. major) در موشها میشود (5). ماکروفاژها (خصوصا سلولهای دندرتیک) نیز سایتوکاینها و فاکتورهایی را تولید میکنند که عبارتند از: IL-15(Interleukin-15)، IL-6، IL-12، IFN-γ، TGF-β(Transforming Growth Factor) و TNF-α (Tumor Necrosis Factor) (2). آنتی بادیهای ضد لیشمانیا در اشکال مختلف لیشمانیوز وجود دارند. عموما حضور و اهمیت پاسخهای آنتی بادی با گسترش بیماری نسبت معکوس دارد. تلاشهای انجام شده برای ایجاد ایمنی حفاظتی بوسیله انتقال سرم ایمیون در حیوانات متعدد با شکست مواجه شده است. به طور کلی میتوان گفت که ایمنی هومورال در کنترل لیشمانیوز نقشی را ایفا نمیکند و تمامی شواهد حاکی از نقش ایمنی سلولی درکنترل بیماری میباشد (6). IgG در موش حاوی چهار زیررده IgG1،IgG2a ، IgG2b، IgG3 میباشد. طی یک دوره پاسخ ایمنی علیه لیشمانیوز در مدل موشی، ایزوتیپهای مختلف ایمونوگلوبولینی ترشح میشوند که به طور کلی غلبه تیتر IgG1 طی یک عفونت یا متعاقب یک ایمن سازی، دلیل افزایش سلولهای Th2 است در حالی که افزایش تیتر IgG2a بر غلبه سلولهای Th1 دلالت دارد (8, 7). به طور کلی میتوان گفت که لنفوسیتهای T در تنظیم پاسخهای ایمنی سلولی علیه لیشمانیوز نقش عمده ای دارند. دو زیر رده مهم سلولهای CD4+ T، سلولهای Th1 و Th2 میباشند. سلولهای Th1 با ترشح سایتوکاینهایی نظیر IL-2، IFN- و TNF- مسؤل ایجاد پاسخ های ایمنی سلولی ازجمله پاسخ ازدیاد حساسیت تاخیری و فعال شدن ماکروفاژها میباشند. درحالی که سلولهای Th2 سایتوکاینهای IL-4، IL-5، IL-6 و IL-10 را ترشح کرده و در ایجاد پاسخ هومورال و تولید IgE، IgA و بعضی ایزوتایپهای IgG نقش دارند (6, 2, 1). بررسی ها نشان داده که نوع پاسخ ایمنی، تعیین کننده سرنوشت عفونت با لیشمانیا در مدلهای تجربی است. بدین معنی که در مدل موشی لیشمانیوز، بروز پاسخ Th1 با مقاومت و بروز پاسخ Th2 با حساسیت مرتبط است و سایتوکاینها در این بین میانجی هستند (3, 1) و وقتی پاسخ Th1 و یا Th2 ایجاد شد، تغییر آن بسیار دشوار است. بنابراین در مراحل اولیه (48 ساعت اول) امکان لحاظ تعیین بروز پاسخ Th1 یا Th2 وجود دارد. امروزه مشخص شده است که عدم توانایی کنترل لیشمانیوز، ناشی غلبه پاسخ Th2 بر Th1 در سیستم ایمنی میزبان میباشد (6, 2, 1). ارزیابی پاسخ سلولهای T به دو طریق in vivo (واکنش DTH (Delayed Type Hypersensitivity و چالش با انگلهای زنده در مدل حیوانی) و in vitro (بررسی پرولیفراسیون سلولهایT و تولید سایتوکاینها) قابل بررسی است. بطوری که پاسخ Th2 همراه با واکنشهای ضعیف حساسیت تاخیری (DTH) است ولی پاسخ های Th1 به شکل بروز ایمنی با واسطه سلولی بوده که با واکنشهای شدید DTH همراه است (1). وجود IFN- که شاخص اصلی پاسخ Th1 میباشد در ابتدای عفونت، با فعال سازی ماکروفاژها و در نتیجه از بین بردن انگلهای داخل سلولی باعث کنترل بیماری میشود. درحالی که تولید IL-4 در ابتدای عفونت باعث حساسیت درمقابل بیماری و پاسخ Th2 میشود (6, 2, 1). از گذشته های بسیار دور با علم به این موضوع که یکبار ابتلا به لیشمانیوز جلدی منجر به بروز مصونیت دایمی علیه این بیماری می شود، بنابراین به منظور پیشگیری از عفونت از زخم افراد مبتلا با شیئی تیز برداشت میشد و به محلی پوشیده از بدن فرد سالم تلقیح می گردید (لیشمانیزاسیون طبیعی). در اوایل قرن بیستم (1908) استفاده از شکل پروماستیگوت زنده به منظور لیشمانیزاسیون استفاده شد (لیشمانیزاسیون مصنوعی). لیشمانیزاسیون در بعضی مناطق اندمیک خاورمیانه برای مدت ها مرسوم بود و در ایران در طول جنگ تحمیلی بیش از دو میلیون رزمنده و حدود دویست و پنجاه هزار کودک در منطقه اصفهان لیشمانیزه شدند اما به دلیل بروز مشکلاتی از قبیل عدم بهبودی 1-2% افراد لیشمانیزه در یک سال، استفاده از شکل زنده انگل در ایران متوقف شد (لیشمانیزاسیون هنوز در ازبکستان به عنوان تنها وسیله پیشگیری مورد استفاده قرار میگیرد). در ایران از لیشمانیزاسیون بعنوان روشی برای ارزیابی واکسن های لیشمانیا استفاده گردید (9). از اوایل دهه 1990 مطالعات بر روی شکل کشته شده انگل در ایران آغاز گردید. مطالعات بر روی میزان مصونیت زایی شکل زنده ضعیف شده انگل، آنتی ژن ها و پروتئین های نوترکیب و فرم DNA واکسن همزمان در مناطق مختلف جهان نیز با اشتیاق وسیعی شروع گردید. بررسی ها نشان داده است که استفاده از شکل کشته شده و شکل زنده ضعیف شده انگل (واکسن های نسل اول) به همراه ادجوانت ها و سیستم های رهاسازی مناسب توانسته است محافظت نسبی علیه گونه های متفاوت لیشمانیا در مدل حیوانی ایجاد کند (10) ولی محدودیت عمده در مورد این نوع واکسن ها تهیه ، تولید، استاندارد کردن و انجام آزمون های کنترل کیفیت آنها در مقیاس های وسیع و صنعتی و از همه مهمتر بروز عفونت شدید در برخی افراد پس از لیشمانیزاسیون می باشد(9). ادجوانتها برای بهبود اثر واکسنها از سال 1920 مورد استفاده قرار گرفته اند.این مواد با مکانیسمهای متفاوتی باعث افزایش پاسخ سیستم ایمنی می شوند. ادجوانت ها به دو گروه کلی ذرهای (Particulate) و غیر ذرهای (non-particulate) تقسیم میشوند. ادجوانتهای ذرهای که به شکل ذرات ریز میکروسکپی بوده قسمتی از فعالیت ادجوانتی خودشان را بواسطه ماهیت ذرهای خود بروز میدهند و عموما زمانی این مواد بیشترین خاصیت ادجوانتی را خواهند داشت که ماده ایمونوژن به آنها متصل شده باشد و یا در کنار آن قرار گرفته باشد. از این دسته میتوان نمکهای آلومینیوم، لیپوزومها، ویروزومها، امولسیونهای آب در روغن، امولسیونهای روغن درآب را نام برد. ادجوانتهای غیر ذرهای برای اعمال خاصیت ادجوانتی به ماهیت ذرهای بودن وابسته نبوده و عمدتا این مواد تنظیم کنندههای سیستم ایمنی (Immunomodulators) میباشند. این مواد زمانی بیشترین خاصیت ادجوانتی را خواهند داشت که همراه یک ادجوانت ذرهای تجویز شوند (11). ادجوانت Imiqimod سبب ترشح سایتوکینهای IFN-α, TNF, IL-1β از مونوسیتها میشود (12). همچنین میتواند پاسخ ایمنی را به سمت Th1 به پیش ببرد که بسیار مناسب جهت انگلهای درون سلولی نظیر لیشمانیا میباشد (13). استفاده از ترکیب ادجوانت Imiqimod و ترکیبات انتی موان سبب بهبود یافتن زودتر زخم در کشور پرو شد(14). این ترکیب در ازمایشات مختلف در کشورهای دیگر هم نتایج مشابه دداد تا جایی که سازمان بهداشت جهانی انرا به عنوان خط دوم مبارزه با لیشمانیا معرفی کرد(15). مطالعه(2008) Wen-Wei Zhang نشان می دهد که استفاده از ادجوانت Imiqimod علیه لیشمانیا ماژور سبب پاسخ ایمنی Th1 در موشهای BALB/C شده است (16). همچنین Fox (2014) نشان داد استفاده از لیپوزومهای آنیونی مانند DPPC, DPPG و ادجوانت Imiqimod پاسخ ایمنی را به سمت Th1 می برد (17). در تحقیقی که توسط فیروزمند و همکاران سال 2013 در مورد لیشمانیا ماژور با استفاده از لیپوزومهای کاتیونی (DOTAP) انجام شد نوع پاسخ ایمنی ایجاد شده Th1 گزارش شد (18). استفاده از سامانه های ذره ای لیپیدی به عنوان ادجوانت و یا سیستم دارورسانی موثر جهت واکسیناسیون علیه لیشمانیوز خصوصا در مورد واکسن های نسل دوم و سوم فراوان گزارش شده است. از روشهای تولید لیپوزومها می توان به روشهای دیالیز، سانتریفوژ، تزریق اتانولی و اتری و Lipid film hydration اشاره کرد (19-23). آنتی ژنهای محلول انگل لیشمانیا با غلظت مشخص بر اساس مطالعات قبلی مجریان طرح تهیه خواهند شد و توسط لیپوزومهای حاوی ادجوانت imiquimod در ذره محصور میشوند. Imiquimod ادجونتی است که در حال حاضر برای درمان زگیل استفاده میگردد این مولکول از طریق میانکنش با TLRs (Toll like receptors) روی پاسخ ایمنی تاثیر می گذارد ،وتولید سایتوکاین های مرتبط با پاسخ Th1 را القا وپاسخ های IgG2aرا افزایش می دهد ،نشان داده شده که Imiquimod در یک فرمولاسیون واکسن زمانی که همراه با آنتی ژن تجویز می شود قادر است پاسخ های ایمنی را افزایش دهد (24-26). مطالعات قبلی نشان داده است تغییر در نوع فسفولیپید به کار رفته در ساختار لیپوزوم و نیز تغییر بارسطحی یا اندازه ذره ای می تواند پاسخ ایمنی را به سمت دلخواه سوق دهد (27-29). در این پزوهش با توجه به مزایای بسیار خوب سیستمهای لیپوزومی و کفایت خوب آنها در تحریک سیستم ایمنی سلولی ما به دنبال یافتن این موضوع هستیم که آیا با به کار گرفتن استراتژی هایی مانند انکپسوله کردن آنتی ژن SLAداخل لیپوزوم ، به کار بردن Imiquimod به عنوان ادجوانت و همچنین استفاده از لیپوزوم هایی با بار کاتیونی (DOTAP)،آنیونی (DSPC) و خنثی (EPC)، می توانیم پاسخ ایمنی سلولی را به نحو مطلوب و موثر تحریک کنیم یا خیر ؟ |
| مشکل جاری که سیاست گزار با آن مواجه است کدام است؟ | |
| روش های موجود کدامها هستند؟ | |
| پیشنهاد اول نحوه کاربرد | |
| محل دوم بکارگیری نتایج تحقیق | |
| سوالات و / یا فرضیات پژوهش | 1- آیا ُ SLA به همراه نانوذرات لیپوزوم در شدت بروز و نوع پاسخ ایمنی ایجاد شده در مدل موشی لیشمانیوز تاثیر دارد؟ 2- آیا نوع فسفولیپید و بارسطحی لیپوزوم تهیه شده بر روی نوع پاسخ ایمنی ایجاد شده در مدل موشی لیشمانیوز تاثیر دارد؟ |
| هدف کلی طرح | بررسی پاسخ ایمنی ایجاد شده توسط نانولیپوزومهای حاوی آنتی ژن لیشمانیا و ادجوانت Imiquimod درمدل موشی |
| منافع و مضرات روشهای موجود کدامند؟ | |
| چرا پیام تحقیق شما حلال مشکل جاری است؟ | |
| اهداف اختصاصی | 1- تهیه و تعیین خصوصیات فیزیکوشیمیایی لیپوزومهای خنثی، آنیونی و کاتیونی حاوی SLA 2- بررسی تاتیر نوع فسفولیپید، بارسطحی و اندازه ذره ای لیپوزوم تهیه شده بر روی نوع پاسخ ایمنی ایجاد شده در مدل موشی لیشمانیوز |
| پیشنهاد دوم نحوه کاربرد | |
| محل سوم بکارگیری نتایج تحقیق | |
| سازمانها، مراکز و موسسات و سایر بهره برداران بالقوه دستاوردهای طرح | وزارت بهداشت درمان وآموزش پزشکی، موسسه سرم سازی رازی |
| پیام تحقیق شما چه منافعی از نظر هزینه، کارایی و بهره وری برای مدیر دارد؟ | |
| برای اجرای راه حل پیشنهادی شما چه موانع و حمایتهایی وجود دارند؟ | |
| تعریف واژه های تخصصی | SLA: مخلوطی از انگلهای محلول در آب انگل ایشمانیاSoluble Leishmania Antigen میباشد لیپوزوم: لیپوزوم به یک وزیکولمیکروسکوپی شامل دولایهی فسفولیپیدی گفته میشودکه یک فضای مائی را احاطه نموده است. و میتوانند قطری بین 50 نانومتر تا 50 میکرومتر داشته باشند |
| پیشنهاد سوم نحوه کاربرد | |
| محل چهارم بکارگیری نتایج تحقیق | |
| نوع مطالعه | بنیادی-کاربردی |
| جامعه مورد مطالعه(معرفی مشارکت کنندگان)/ محیط پژوهش(معیارهای ورود و خروج ذکر شوند) | آزمایش روی 150 موش BALB/c ماده 6-8 هفتهای انجام میشود. در صورتیکه سن موشها خارج از این محدوده باشد یا اینکه از نظر وزنی نسبت به سایرین کمتر باشند در آزمایش وارد نمیشوند و اگر در حین آزمایش به هر دلیلی ازبین بروند از آزمایش خارج میشوند. |
| پیشنهاد چهارم نحوه کاربرد | |
| حجم نمونه و روش محاسبه آن | |
| روش نمونه گیری(نحوه تخصیص تصادفی و همسانسازی در صورت لزوم ذکر شود) | |
| روش و ابزار جمع آوري داده ها / صحت و استحکام داده ها (پرسشنامه یا فرم اطلاعاتی ضمیمه شود) | |
| روش اجرای طرح(با جزئیات بطور کامل شرح داده شود) | روش اجرای طرح(با جزئیات بطور کامل شرح داده شود): حیوان: موشهای BALB/c ماده 6-8 هفتهای از مرکز تحقیقات حیوانات دانشگاه علوم پزشکی زاهدان ابتیاع می گردد. موشها در دمای25-22 درجه سانتیگراد و شرایط نوری 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی و بر طبق استاندارد های کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی زاهدان نگهداری می شوند. انگل Leishmania major: انگل L. major سویه MRHO/IR/75/ER، از موش BALB/c جدا می گردد. ابتدا در محیط آگار خوندار (NNN) کشت داده شده و سپس انگلها به محیط کشت RPMI 1640 حاوی20-10% 100U/ml‚ FCS پنی سیلین G و 100g/ml استرپتومایسین انتقال داده می شوند و در دمای ºC 26 تکثیر می شوند. تهیه آنتی ژن SLA: انگلهای L. major آماده در فاز stationary، به لوله فالکون انتقال داده می شود. لوله (های) حاوی انگل در دمای0c 24 به مدت 10 دقیقه و با سرعت rpm4500 سانتریفیوژ می شود. پس از مشخص شدن تعداد انگل، 50 میکرو لیتر کوکتل آنزیمی به محلول (به ازای حداقل 1.2 میلیارد انگل در هر سی سی ) اضافه می شود. سپس پروسه فریز-ذوب و سونیکاسیون سوسپانسیون انگلی به کمک دستگاه probe sonicator و نهایتا جداسازی سوپرناتنت و انتقال به میکروتیوب های جدید صورت می گیرد. در مرحله بعد محلول SLA به کیسه دیالیز منتقل شده تا کوکتل آنزیمی اضافی از محیط حذف شود. محلول SLA بدست آمده به کمک فیلتر سرنگی mµ0.2 استریل می شود. روش تهیه Liposom:در این روش در یک بالن ته گرد مقادیر مورد نیاز از لیپید،کلسترول و توسط حلال آلی (کلروفرم: متانول به نسبت مولی 2 به 1) حل میگردد. سپس در دستگاه خلاء چرخان حلال آلی تبخیر میشود تا فیلم لیپیدی نازکی برروی جداره بالن تشکیل شود سپس بالن ته گرد را به دستگاه Freeze Drier برای مدت زمان کوتاهی وصل کرده تا مقادیر ناچیز باقی مانده حلال آلی خارج شود. به فیلم لیپیدی حاصله در دمای بالاتر از Tm(Transition temperature) مقادیر مناسبی از آب مقطر استریل اضافه میشود و توسط ورتکس همزده تا لایههای لیپیدی در فاز آبی پخش شده و تشکیل MLV (Multilamellar Vesicle) اولیه را بدهد. سپس مقدار معینی SLA به لیپوزومهای حاصل افزوده و مخلوط سونیکیت و در نهایت بوسیله دستگاه Extruder از فیلتر 400 سپس 200 نانومتر عبور داده میشود تا لیپوزومهای حاوی SLA با اندازه ذره ای حدود 200 نانومتر حاصل شود. جدا سازی آنتی ژن محصور نشده احتمالی در لیپوزومها: برای جداسازی آنتی ژنهای محلول انگل لیشمانیا انکپسوله نشده در لیپوزوم ، از روش اولتراسانتریفوژ استفاده می گردد. در صورت عدم جداسازی مناسب به روش فوق، از روش ژل کروماتوگرافی با ستون سفاروز CL-4B استفاده خواهد شد. تعیین کیفی و کمی آنتی ژن SLA: تعیین کیفی آنتی ژن به کمک روش SDS-PAGE، تعیین مقدار پروتئین با روش BCA، تعیین مقدار لیپید با روش Bartlett خواهد بود. بررسی مورفولوژی، اندازه و پتانسیل زتا لیپوزومهای تهیه شده: برای بررسی شکل، اندازه، Lamellarity و پتانسیل زتا لیپوزومهای های بدست آمده از میکروسکوپ الکترونی و Particle Size Analyzer استفاده خواهد شد. تهیه انگل لیشمانیا ماژور در فاز ایستا (stationary) جهت انجام آزمون چالش: انگل L. major سویه MRHO/IR/75/ER در محیط NNN و سپس در محیط RPMI 1640 حاوی ,FCS 10% پنی سیلین و استرپتومایسین کشت داده می شود و هر روز از نظر آلودگی بررسی می شود. پروماستیگوت های فاز stationary کشت (روز 5-4) پس از شستشو با PBS به تعداد مشخص (106X1) به همراه ادجوانت به کف پای موش ها به صورت زیر جلدی تزریق می شود. پروسه ایمیونیزاسیون: ایمیونیزاسیون در موشهای BALB/c ماده با تزریق هر کدام از فرمولاسیونهای تهیه شده به صورت زیر جلدی در ناحیه پشت موش صورت می گیرد (حجم نهایی تزریق به هر موش μl 50 میباشد). حیوانات به گروههای 10 تایی در هر قفس تقسیم شده و برچسبی شامل مشخصات، نوع فرمولاسیون دریافتی، تاریخ تزریقها و نتایج حاصل از پیگیری مرگ و میرهای اتفاقی روی هر قفس نصب میشود. در هر گروه موشها شمارهگذاری میشوند. چالش با انگل زنده: پس از اتمام مراحل ایمونیزاسیون، انگلهای ویرولان در مرحله ایستا به این موشها تزریق خواهد شد. انگلها پس از کشت و تکثیر در محیط کشت و رسیدن به مرحله ایستا، در شرایط استریل برداشت شده و با PBS شسته می شود و بعد از شمارش انگلها، حجم محلول انگلی به گونهای با PBS تنظیم میشود که هر میلی لیتر آن حاوی 107×2 عدد انگل L. major باشد. سپس مقدار مشخص از محلول انگلی که حاوی 106×1 پروماستیگوت زنده در مرحله ایستا می باشد بوسیله سرنگ انسولین به کف پای راست هر موش تزریق میشود و همین حجم PBS هم به کف پای چپ موش تزریق میگردد. سپس قطر زخمها بصورت اختلاف بین قطر پای تلقیح شده و قطر پای مقابل هفته ای یکبار بعد از چالش، هر 7 روز یکبار با استفاده از کولیس ورینه اندازهگیری میشود. اندازهگیری قطر پا تا زمانی که زخمها باز شوند، صورت میگیرد. اندازه گیری بار انگلی در طحال، غدد لنفاوی و کف پا: به منظور تعیین تعداد انگلهای زنده در بافت آلوده یک سیستم دو فازی شامل یک فاز مایع حاوی محیط RPMI-1640، 10% 100U/ml‚ FCS پنی سیلین G و 100g/ml استرپتومایسین (محیط RPMI-1640 کامل) بر روی یک لایه جامد از آگار خوندار تهیه می گردد و سپس تحت شرایط استریل، 50 میکرولیتر محیط کشت داخل هر چاهک پلیت 96 خانه ای توزیع می شود. پلیت های تهیه شده تا زمان استفاده داخل یخچال نگهداری می شود. به منظور بررسی تعداد انگلهای موجود در بافت موشهای آلوده، موشها بعد از نخاعی شدن داخل ظرف محتوی اتانل º70 به مدت 10 دقیقه غوطه ور شده و سپس تحت شرایط استریل طحال، کف پا و غدد لنفاوی ناحیه کشاله ران برداشته می شود. بعد از توزین ابتدا بافتهای جداشده به صورت جداگانه به قطعات ریز تکه شده و سپس به کمک ته پیستون سرنگ هموژن می گردد. سپس با محیط کشت RPMI-1640 کامل حجم تمامی پلیتها به 5/2 میلی لیتر رسانده می شود. در مرحله بعد 8 رقت بصورت رقیق سازی سریال 10/1 تهیه شده و 150 میکرولیتر از هر رقت (12 تکرار) به هر چاهک پلیت 96 خانه حاوی آگار خوندار افزوده می شود. پلیت های تهیه شده به مدت 10 روز در دمای ºC 26 نگهداری می شوند. پس از اتمام زمان انکوباسیون تمامی چاهکها توسط میکروسکپ از لحاظ وجود ویا عدم وجود انگل بررسی می شود. نتایج به صورت مثبت (مشاهده انگل) و منفی (عدم مشاهده انگل) در رقت های مختلف یادداشت شده و در نهایت نتایج به کمک نرم افزار آماری Graph Pad prism 5 به صورت تعداد انگل در طحال ویا غده لنفاوی گزارش میشود. اندازهگیری تیتر IgG2a, IgG1, IgG: برای اندازهگیری IgG ها از روش ELISA غیرمستقیم استفاده میشود. در این روش ابتدا چاهکهای پلیت 96 خانهای با آنتی ژن لیشمانیا (SLA) پوشش داده میشود. متعاقب آن چاهک های حاوی آنتی ژن با نمونه سرمی حاوی آنتی بادی (مجهول یا استاندارد) انکوبه میشود. سپس آنتی بادیهای باند نشده جدا و شسته میشوند. در نهایت یک آنتیIgG کونژوگه به یک آنزیم برای ردیابی افزوده میشود. اندازهگیری تیتر آنتی بادیها در زمان های مشخص صورت میگیرد. اندازه گیری سایتوکاینهایIL-10 و IL-4 و IFN- خارج سلولی به روش Elispot: در زمان مشخص، موش ها کشته شده، طحال جمع آوری شده و سلولهای موجود در آنها جداسازی می گردد. برای انجام آزمون Elispot ابتدا آنتی بادی های مونوکلونال اختصاصی برای سایتوکاین مورد نظر، بر روی یک فاز جامد ثابت می شوند. در مرحله بعد سلولهای جمع آوری شده به محیط اضافه می شوند و در کنار آنتی ژن لیشمانیا (عامل محرک تولید سایتوکاین) انکوبه می شوند. در مدت انکوباسیون سایتوکاین تولید و به آنتی بادی مونوکلونال اختصاصی خود متصل می شود. در مرحله بعد سلولها شسته می شوند و آنتی بادی های شناساگر آنتی سایتوکاین به محیط افزوده می گردد. این آنتی بادی های شناساگر مستقیما با یک آنزیم کونژوگه شده اند که نهایتاً با اضافه کردن یک سوبسترا به محیط، بر اثر فعالیت آنزیم یک رسوب رنگی نامحلول تولید می شود. بنابراین نقاط رنگی در محل تولید سایتوکاین مشاهده خواهد شد. این نقاط رنگی توسط دستگاه Elispot reader شناسایی و شمارش خواهد گردید. اندازه گیری سایتوکاینهای IL-4 و IFN- داخل سلولی به روش فلوسایتومتری: در روش فلوسایتومتری سلولهای طحالی استخراج شده توسط PMA/Ionomycin تحریک می شوند سپس ابتدا توسط آنتی بادیها بر علیه CD4 و CD8 به صورت سطح سلولی رنگ آمیزی می شوند و در نهایت سلولهای طحالی را نفوذپذیر کرده و با آنتی بادیها علیه IFN- و IL-4 رنگ شده و توسط دستگاه فلوسیتومتری بررسی می شوند. |
| روش تجزیه، تحليل و توصیف دادهها (نمونهاي از جدول توخالي ضميمه شود و روش هاي آماري مورد استفاده به طور كامل توضيح داده شود)(کیفی و کمی) | در توصیف داده ها از شاخص های آماری میانگین، انحراف معیار و جداول فراوانی و نمودار استفاده می شود. در تحلیل داده ها از نرم افزار Prism0.5آنالیز واریانس یک طرفه و متعاقب آن برای مقایسه دو به دو گروهها از آزمون Tukey-Kramer استفاده میشود. |
| ملاحظات اخلاقی | |
| محدودیتهای اجرائی طرح و پیش بینی جهت حل آنها | بسیاری از کیتهای الیزا، کیت الی اسپات، کیت فلوسایتومتری و فسفولیپیدها از خارج تهیه میشوند و معمولا خرید آنها وقت زیادی می طلبد و هزینه بر هستند بنابراین جهت جلوگیری از هر گونه کمبود و خلل در حین اجرای طرح، همه این مواد در ابتدای شروع به کار از شرکتهای معتبرخریداری میشود. |
| کلمات کلیدی | |
| فهرست منابع و مراجع | 1. Sacks D, Noben-Trauth N. The immunology of susceptibility and resistance to Leishmania major in mice. Nat Rev Immunol. 2002 Nov;2(11):845-58. 2. Reiner SL, Locksley RM. The regulation of immunity to Leishmania major. Annu Rev Immunol. 1995;13:151-77. 3. Roberts LJ, Handman E, Foote SJ. Science, medicine, and the future: Leishmaniasis. BMJ. 2000 Sep 30;321(7264):801-4. 4. Reed SG. Leishmaniasis vaccination: targeting the source of infection. J Exp Med. 2001 Aug 6;194(3):F7-F9. 5. Kemp M, Theander TG, Kharazmi A. The contrasting roles of CD4+ T cells in intracellular infections in humans: leishmaniasis as an example. Immunol Today. 1996 Jan;17(1):13-6. 6. McSorley S, Proudfoot L, O'Donnell CA, Liew FY. Immunology of murine leishmaniasis. Clin Dermatol. 1996 Sep-Oct;14(5):451-64. 7. Coler RN, Skeiky YA, Bernards K, Greeson K, Carter D, Cornellison CD, et al. Immunization with a polyprotein vaccine consisting of the T-Cell antigens thiol-specific antioxidant, Leishmania major stress-inducible protein 1, and Leishmania elongation initiation factor protects against leishmaniasis. Infect Immun. 2002 Aug;70(8):4215-25. 8. Campos-Neto A, Webb JR, Greeson K, Coler RN, Skeiky YA, Reed SG. Vaccination with plasmid DNA encoding TSA/LmSTI1 leishmanial fusion proteins confers protection against Leishmania major infection in susceptible BALB/c mice. Infect Immun. 2002 Jun;70(6):2828-36. 9. Khamesipour A, Dowlati Y, Asilian A, Hashemi-Fesharki R, Javadi A, Noazin S, et al. Leishmanization: Use of an old method for evaluation of candidate vaccines against leishmaniasis. Vaccine. 2005;23(28):3642-8. 10. Khamesipour A, Rafati S, Davoudi N, Maboudi F, Modabber F. Leishmaniasis vaccine candidates for development: a global overview. Indian J Med Res. 2006 Mar; 123(3):423-38. 11. Cox JC, Coulter AR. Adjuvants--a classification and review of their modes of action. Vaccine. 1997; 15(3):248-5. 12. Testerman T. L., Gerster J. F., Imbertson L. M., Reiter M. J., Miller R. L., Gibson S. J., Wagner T. L., Tomai M. A. (1995). Cytokine induction by the immunomodulators imiquimod and S-27609. J. Leukoc. Biol. 58 365–372. 13. Wagner T. L., Ahonen C. L., Couture A. M., Gibson S. J., Miller R. L., Smith R. M., Reiter M. J., Vasilakos J. P., Tomai M. A. (1999). Modulation of TH1 and TH2 cytokine production with the immune response modifiers, R-848 and imiquimod. Cell. Immunol. 191 10–19. 14. Miranda-Verastegui C., Llanos-Cuentas A., Arévalo I., Ward B. J., Matlashewski G. (2005). Randomized, double-blind clinical trial of topical imiquimod 5% with parenteral meglumine antimoniate in the treatment of cutaneous leishmaniasis in Peru. Clin. Infect. Dis. 40 1395–1403 15. WHO(2010).“Control of the leishmaniases,” in Report of a Meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniases, Geneva, 22–26 March 2010.WHO Technical Report Series 949. 16. Wen-Wei Zhang , Greg Matlashewski . Immunization with a Toll-Like Receptor 7 and/or 8 Agonist Vaccine Adjuvant Increases Protective Immunity against Leishmania major in BALB/c Mice▿ Infect Immun. 2008 ; 76(8): 3777–3783. 17. Fox CB, Sivananthan SJ, Duthie MS, Vergara J, Guderian JA, Moon E, Coblentz D, Reed SG, Carter D. A nanoliposome delivery system to synergistically trigger TLR4 AND TLR7. J Nanobiotechnology. 2014: 26;12-17. 18. Firouzmand H, Badiee A, Khamesipour A, Heravi Shargh V, Alavizadeh SH, Abbasi A, Jaafari MR. Induction of protection against leishmaniasis in susceptible BALB/c mice using simple DOTAP cationic nanoliposomes containing soluble Leishmania antigen (SLA). Acta Trop. 2013;128(3):528-35. 19-Liang M, Toth I, Davies NM. A novel method for preparing immune stimulating complexes (ISCOMs) by hydration of freeze-dried lipid matrix. Eur J Pharm Biopharm 2008 Mar: 68(3):840-5. 20. Frezard F. Liposomes: from biophysics to the design of peptide vaccines. Braz J Med Biol Res. 1999 Feb;32(2):181-9. 21. Felnerova D, Viret JF, Gluck R, Moser C. Liposomes and virosomes as delivery systems for antigens, nucleic acids and drugs. Curr Opin Biotechnol. 2004 Dec;15(6):518-29. 22. Vaccine Adjuvants:Preparation Methods and Research Protocols. 1 ed. O'Hagan DT, editor. Totowa, New Jersey: Humana Press; 2000. 23. Wilschut J. Influenza vaccines: The virosome concept. Immunology Letters. 2009;122(2):118-21. 24- Tomai MA, Stanczak TL, Tygrett LT, Waldschmidt TJ. The immune response modifiers imiquimod and R-848 are potent activators of B lymphocytes. Cell Immunol 2000;203: 55–65. 25- Gibson SJ, Riter TR, Gleason RM, Rogers LM, Fuller, AE. Plasmacytoid dendritic cells produce cytokines and mature in response to the TLR7 agonists, imiquimod and resiquimod. Cell Immunol 2001;218: 74–86. 26 -Johnston CB. Topical imiquimod is a potent adjuvant to a weakly-immunogenic protein prototype vaccine. Vaccine2006:24;1958-65. 27. Liposome Technology. 3 ed. Gregoriadis G, editor. New York: Informa Healthcare; 2007. 28. Badiee A, Khamesipour A, Samiei A, Soroush D, Shargh VH, Kheiri MT, Barkhordari F, Robert Mc Master W, Mahboudi F, Jaafari MR. The role of liposome size on the type of immune response induced in BALB/c mice against leishmaniasis: rgp63 as a model antigen. Exp Parasitol. 2012 Dec; 132(4):403-9. 29. Badiee A, Jaafari MR, Khamesipour A, Samiei A, Soroush D, Kheiri MT, Barkhordari F, McMaster WR, Mahboudi F. Enhancement of immune response and protection in BALB/c mice immunized with liposomal recombinant major surface glycoprotein of Leishmania (rgp63): the role of bilayer composition. Colloids Surf B Biointerfaces. 2009;74(1):37-44. |
| معرفی پژوهش/ اهداف پژوهش (عین عبارت هدف پروپوزال را کپی نکنید. بلکه با جملاتی که برای مردم قابل فهم باشد (برای سواد حدود پنجم ابتدایی )هدف را برای شرکت کنندگان توضیح دهید.) در تمام این متن در صورتیکه شرکت کننده کودک یا فرد فاقد ظرفیت تصمیم گیری است باید مواردیکه منظور از "من"، فرد شرکت کننده بوده است به "کودک" یا "فرد تحت سرپرستی من" اصلاح شود و مواردیکه منظور از "من"، رضایت دهنده است به من به عنوان "ولی" یا "قیم قانونی" اصلاح شود. | |
| خون گیری (آیا طرح شما نیاز به خونگیری دارد یا خیر) | |
| نحوه همکاری/ مزایا ی طرح (در این بخش برای شرکت کنندگان به زبان ساده توضیح دهید که: چه مداخله ای بر روی آنها صورت میگیرد. چه اقدامات پاراکلینیکی بر روی آنها انجام میشود. چه نمونه ای و با چه حجمی از آنها میگیرید در این مدت چند نوبت مراجعه باید داشته باشند و به چه فواصلی چه اقداماتی را در پیگیری آنها انجام میدهید. (حتی میتوانید سود بالقوه ای که شرکت کنندگان میتوانند از شرکت در این پژوهش ببرند بنویسید. این سود میتواند شرح احتمال درمان یا تشخیص بهتر بیماریشان، دریافت خدمات سلامت رایگان و یا پرداخت مشوق مالی در ازای جبران همکاریشان باشد) | |
| عوارض جانبی (منظور عوارض و میزان احتمال بروز آنها در این مطالعه است) | |
| جبران عوارض احتمالی (برای آنکه شرکت کننده بتواند ارزیابی مناسبی از سود و زیان شرکت در پژوهش شما داشته باشد لازم است بتواند سود و زیان مداخلات معمول و مداخلات این پژوهش را مقایسه کند. به عنوان مثال میزان موفقیت و میزان عوارض هریک را مقایسه کند.) - او باید بداند كه اگر در حين و بعد از انجام پژوهش هم هر مشكلي اعم از جسمي و روحي به علت شرکت در اين پژوهش برایش پيش آمد درمان عوارض، و هزينههاي آن و غرامت مربوطه بر عهده مجري خواهد بود. | |
| هزینه های مربوط به انجام طرح تحقیقاتی (تمام مداخلات پژوهشی باید برای بیمار رایگان باشد و بیمار بداند شامل چه مواردی هستند. ) | |
| روش های جایگزین در صورت عدم تمایل به شرکت در مطالعه چه روش های درمانی برای بیمار ارائه خواهد شد | |
| محرمانه بودن بیمار باید بداندکه دست اندر كاران اين پژوهش، كليه اطلاعات مربوط به او را نزد خود به صورت محرمانه نگهداشته و فقط اجازه دارند نتايج كلي و گروهي اين پژوهش را بدون ذکر نام و مشخصات بیمار منتشر كنند. و كميته اخلاق در پژوهش با هدف نظارت بر رعایت حقوق وی ميتواند به اطلاعات ایشان دسترسي داشته باشد. | |
| پاسخگویی به پرسش ها در این بخش نام و اطلاعات دسترسی فردی از عوامل پژوهش را که بتواند اطلاعات صحیح و کافی در اختیار شرکت کنندگان قرار دهند و در مورد عوارض و نگرانیها راهنمایی لازم را ارائه دهند ذکر شود | |
| حق نپذیرفتن یا انصراف بیمار باید بداند که شرکت اودر اين پژوهش کاملاً داوطلبانه است و مجبور به شرکت در اين پژوهش نيست و در صورت عدم شرکت از مراقبتهاي معمول تشخيصي و درماني محروم نخواهد شد او باید بداند كه حتي پس از موافقت با شركت در پژوهش ميتواند هر وقت كه بخواهد، پس از اطلاع به مجري، از پژوهش خارج شود و خروج اواز پژوهش باعث محرومیت از دریافت خدمات درمانی معمول برای اونخواهد شد. | |
| رضایت او باید بداند که اگر اشکال يا اعتراضي نسبت به دست اندركاران يا روند پژوهش دارد مي تواند با كميته اخلاق در پژوهش دانشگاه تماس گرفته و مشکل خود را به صورت شفاهي يا كتبي مطرح نمايد. در انتهای فرم قید گردد : اينجانب موارد فوقالذکر را خواندم و فهميدم و بر اساس آن رضايت آگاهانه خود را براي شركت در اين پژوهش اعلام ميکنم. اينجانب ……………… خود را ملزم به اجراي تعهدات مربوط به مجري در مفاد فوق دانسته و متعهد ميگردم در تأمين حقوق و ايمني شركت كننده در اين پژوهش تلاش نمايم | |
| پرسشنامه یا فرم اطلاعاتی |
| نام فایل | تاریخ درج فایل | اندازه فایل | دانلود |
|---|---|---|---|
| First Proposal.doc | 1394/05/12 | 430080 | دانلود |
| 7487.doc | 1394/08/11 | 60928 | دانلود |
| pro7487.doc | 1394/10/14 | 430592 | دانلود |
| es7487.docx | 1394/10/14 | 17428 | دانلود |
| 7487 B.doc | 1394/10/26 | 49664 | دانلود |
| 7487 G.doc | 1394/10/26 | 60928 | دانلود |
| 7487 da.doc | 1394/10/26 | 52736 | دانلود |
| mehr es.docx | 1394/12/08 | 16451 | دانلود |
| mehr pro.doc | 1394/12/08 | 476160 | دانلود |
