چاپ صفحه |  صفحه نخست سامانه |  مجری و همکاران |  اطلاعات تفضیلی |  دانلود | علوم پزشکی زاهدان |
| کد طرح | 7766 |
| عنوان فارسی طرح | فراوانی انگلهای روده ای و افتراق انتامبا هیستولیتیکا از انتامبا دیسپار با روش Nested PCR در مراجعین به آزمایشگاه های مراکز درمانی زاهدان1394-1395 |
| عنوان لاتین طرح | FREQUENCY OF INTESTINAL PARASITES AND DIFFERENTIATION OF ENTAMOEBA HISTOLYTICA FROM ENTAMOEBA DISPAR BY NESTED POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) IN REFERRED INDIVIDUALS TO THE MEDICAL CENTERS OF ZAHDAN 2015 - 2016 |
| نوع طرح | کاربردی |
| محل اجرای طرح | |
| رسته مطالعاتی | توصیفی(مطالعه کمی) |
| دانشکده/مرکز | دانشکده پزشکی زاهدان |
| زمان اجرا -روز | 365 |
| نام و نامخانوادگی | سمت در طرح | نوع همکاری | درجهتحصیلی | پست الکترونیک |
|---|---|---|---|---|
| محمد جعفری مدرک | مجری دوم | دکترای تخصصی | mjafari547547@yahoo.com | |
| علیرضا سلیمی خراشاد | مجری اول | دکترای تخصصی | salimi35ali@yahoo.com | |
| آفرین حنفی | همکار | دانشجو | کارشناسی ارشد | afarinhanafi@yahoo.com |
| علی حقیقی | مشاور | مشاور طرح | دکترای تخصصی | ahaghighi110@yahoo.com |
| عنوان | متن |
|---|---|
| خلاصه طرح به فارسی | فراوانی انگلهای روده ای و افتراق انتامبا هیستولیتیکا از انتامبا دیسپار با روش Nested PCR در مراجعین به آزمایشگاه های مراکز درمانی زاهدان1394-1395 |
| خلاصه طرح به لاتین | FREQUENCY OF INTESTINAL PARASITES AND DIFFERENTIATION OF ENTAMOEBA HISTOLYTICA FROM ENTAMOEBA DISPAR BY NESTED POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) IN REFERRED INDIVIDUALS TO THE MEDICAL CENTERS OF ZAHDAN 2015 - 2016 |
| محل اول بکارگیری نتایج تحقیق | |
| بيان مسئله تحقيق/اهمیت پژوهش | بیان مسئله: بیماری های انگلی روده ای از جمله مهم ترین بیماری های عفونی در سطح جهان هستند که با سلامت فردی و عمومی جامعه ارتباط مستقیمی دارند. آلودگی به انگلهای روده ای همواره در نقاط مختلف کشور ما وجود داشته و باعث صرف هزینه های قابل توجهی در زمینه های تشخیص، پیشگیری و درمان بوده است. همواره جهت برنامه ریزیهای صحیح بهداشتی برای کنترل و مبارزه با بیماریها در هر منطقه، نیاز به اطلاعات دقیق و جدید اپیدمیولوژیک می باشد. در همین راستا بررسی عفونت های انگلی روده ای علاوه بر شناخت عوامل محیطی مورد نظر و میزان شیوع می تواند شاخص بهداشتی موثری در جامعه باشد. تهاجم انتامباهیستولتیکا در انسان بیماری گستردهای از دیسانتری تا آمیبیاز خارج روده ای نظیر آبسههای کبدی ، ریوی و غیره میتواند ایجاد کند . این تک یاخته با ایجاد تا حدود100 هزار مورد مرگ و میر سالیانه در جهان دومین عامل مرگ و میر در اثر تک یاخته ها بعد از مالاریا و سومین عامل مرگ و میر انسان در اثر بیماریهای انگلی پس از مالاریا و شیستوزوما محسوب می گردد (2). دربعضی از کشورها آمیبیازیس یکی از 10 علت اولیه مرگ و میر انسانها می باشد و دریک نگاه کلی می توان گفت تقریباً 10% جمعیت جهان حامل انتامباهیستولتیکا/ انتامبادیسپار هستند (14). در تشخیص آزمایشگاهی دیسانتری آمیبی اغلب با دیسانتری باسیلر اشتباه میشود که منجر به گزارشهای مثبت کاذب یا منفی کاذب میگردد. تشخیص دیسانتری آمیبی در آزمایشگاههای تشخیص طبی مبتنی بر جستجو و یافتن آمیب درگسترش مرطوب تهیه شده از نمونه مدفوع فرد مبتلا می باشد . در این روش مهمترین فاکتور شناسایی صحیح و دقیق آمیب ، مهارت و تجربه فرد آزمایش کننده می باشد . حتی در کشورهایی که آمیبیاز و دیگر آلودگی های انگلی شایعتر از سایر مناطق است موارد تشخیص غلط به وفور مشاهده می گردد . یکی از مهمترین این خطاها گزارش اشتباه انتامبا دیسپار بجای انتامباهیستولتیکاست چرا که با روشهای مرسوم آزمایشگاهی افتراق این دو کاری است تقریباً غیر ممکن که این مسئله می تواند درکشور ما هم صادق باشد. لذا استفاده به موقع از تکنیک مناسب جایگاه ویژه ای در تشخیص دیسانتری آمیبی و بدنبال آن آمیبیاز خارج روده ای دارد . در حال حاضر تشخیص آمیبیاز وافتراق این دوگونه در آزمایشگاههای تحقیقاتی وبا روشهایی نظیر بررسی الگوی حرکت الکتروفورزی ایزو آنزیم ها ، استفاده از آنتی بادیهای منوکلونال برای شناسایی آنتی ژنهای اختصاصی و نیز با روشهای بیولوژی مولکولی نظیر PCR صورت می گیرد . در این تحقیق علاوه بر شناسایی انگل های روده ای با روش روتین و تحقیقی میکروسکوپی از روش PCR برای جداسازی و شناسایی این دو گونه آمیب از یکدیگر استفاده می شود . نتایج این طرح شاید بتواند سهمی در تأمین اطلاعات مستند بر اساس تحقیقات دانشگاهی جهت شناسایی انگلهای روده ای و آمیبهای دستگاه گوارش باشد. |
| مشکل جاری که سیاست گزار با آن مواجه است کدام است؟ | |
| روش های موجود کدامها هستند؟ | |
| پیشنهاد اول نحوه کاربرد | |
| محل دوم بکارگیری نتایج تحقیق | |
| سوالات و / یا فرضیات پژوهش | 1. فراوانی انگلهای روده ای انتامباهیستولیتیکا / انتامبا دیسپار باروش پارازیتولوژیکی چقدر است؟ 2. فراوانی دو آمیب انتامباهیستولیتیکا و دیسپار با روش مولکولی چقدر است؟ 3. فراوانی سنی و جنسی مبتلایان انگل های روده ای و انتامباهیستولیتیکا و دیسپار درمنطقه مورد مطالعه چقدر است |
| هدف کلی طرح | شناسایی میکروسکوپی انگل های روده ای و افتراق تک یاخته های انتامباهیستولیتیکا از انتامبا دیسپار با استفاده از روش Nested PCR در مراجعین به مراکز درمانی زاهدان. |
| منافع و مضرات روشهای موجود کدامند؟ | |
| چرا پیام تحقیق شما حلال مشکل جاری است؟ | |
| اهداف اختصاصی | 1.تعیین فراوانی انگلهای روده ای و انتامباهیستولیتیکا /انتامبا دیسپار باروش پارازیتولوژیکی. 2.افتراق دوآمیب انتامباهیستولیتیکا و دیسپار با روش مولکولی. 3.تعیین فراوانی سنی وجنسی مبتلایان به انگل های روده ای و انتامباهیستولیتیکا و دیسپار درمنطقه مورد مطالعه. |
| پیشنهاد دوم نحوه کاربرد | |
| محل سوم بکارگیری نتایج تحقیق | |
| سازمانها، مراکز و موسسات و سایر بهره برداران بالقوه دستاوردهای طرح | 1- معاونت بهداشتی دانشگاه علوم پزشکی زاهدان با استفاده از نتایج طرح در برنامه ریزی و کنترل بیماری آمیبیازیس در استان سیستان و بلوچستان و به تبع آن برنامه های کلان کشور نقش بسزایی خواهد داشت. 2- مرکز مدیریت بیماریهای واگیر وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشکی. |
| پیام تحقیق شما چه منافعی از نظر هزینه، کارایی و بهره وری برای مدیر دارد؟ | |
| برای اجرای راه حل پیشنهادی شما چه موانع و حمایتهایی وجود دارند؟ | |
| تعریف واژه های تخصصی | تعریف واژه های تخصصی: انتامبا هیستولیتیکا: یکی از آمیبهای بیماری زا مهم انسانی است. اغلب بدون علامت بوده و در روده بزرگ به صورت کومنسال زندگی میکنند ولی گاهی با حمله به بافت روده باعث دیسانتری آمیبی و عفونت خارج روده ای مثل آبسه کبدی میشود. انتامبا دیسپار: امیب شایع غیر بیماری زا است که از نظر اندازه و شکل ظاهری با میکروسکوپ نوری شبیه انتامباهیستولیتیکا است. آمیبیازیس: این بیماری بدنبال عفونت با انتامباهیستولیتیکا ایجاد می شود. این بیماری در دو نوع رود ه ای و خارج روده ای ظاهر می گردد که نوع روده ای به سه شکل بدون علامت یا علائم ضعیف مثل نفخ ، یبوست و گاهی اسهال است . نوع غیرخونی که با درد شکم و اسهال ایجاد می گردد و نوع خونی که اسهال و دل درد همراه با خون و بلغم در مدفوع وجود دارد . روشهای تشخیصی میکروسکوپی شامل روشهای آزمایش مستقیم، تغلیظ، کشت در محیط سرم منعقده و رنگ آمیزی اسید فست است. واکنش زنجیره پلی مراز (Nested PCR) : این روش متشکل از دو مرحله است.در مرحله اول یک واکنش PCR استانداردانجام شده و در مرحله دوم محصول PCR واکنش مرحله اول به عنوان DNA الگو استفاده میشود.دوجفت پرایمرجهت انجام این روش طراحی میشود.یک جفت آن به دو انتهای توالی هدف هیبرید میشود و محل اتصال جفت پرایمر دیگر که پرایمرهای لانه گزیده معروفند،در داخل توالی محصولPCR مرحله اول قرار دارد. |
| پیشنهاد سوم نحوه کاربرد | |
| محل چهارم بکارگیری نتایج تحقیق | |
| نوع مطالعه | این مطالعه از نوع توصیفی می باشد و از نظر مکانی منطقه سیستان و بلوچستان(زاهدان) را مورد پوشش قرار خواهد داد |
| جامعه مورد مطالعه(معرفی مشارکت کنندگان)/ محیط پژوهش(معیارهای ورود و خروج ذکر شوند) | مدفوع مراجعین به آزمایشگاههای مراکز بهداشتی درمانی زاهدان در سال 1395-1394 معیار ورود: تمامی مراجعین با علائم گوارشی و بدون علائم که توسط پزشک به آزمایشگاه معرفی می شوند و یا مراجعین برای کنترل بهداشتی معیار خروج: افرادی که رضایت به همکاری نداشته اند پس از درمان از مطالعه خارج می شوند |
| پیشنهاد چهارم نحوه کاربرد | |
| حجم نمونه و روش محاسبه آن | با استفاده از مطالعه ی (هوشیار و همکاران در سال 1384) در سطح اطمینان 95% ، حجم نمونه به روش زیر محاسبه گردیده است که n تعداد نمونه؛ zدامنه اطمینان ؛p احتمال شیوع و d دقت می باشد یعنی حداقل حجم نمونه 1521 نفر برآورد شده است و ما مدفوع1521 نفر را بررسی میکروسکپی کرده و در صورت مشکوک بودن تشخیص افتراقی انجام پذیرد. |
| روش نمونه گیری(نحوه تخصیص تصادفی و همسانسازی در صورت لزوم ذکر شود) | روش نمونه گیری غیر احتمالی در دسترس می باشد و کلیه مراجعینی که به مراکز بهداشتی و درمانی شهر زاهدان در استان سیستان و بلوچستان مراجعه نموده و شرایط ورود به مطالعه را داشته باشد وارد مطالعه می شوند. |
| روش و ابزار جمع آوري داده ها / صحت و استحکام داده ها (پرسشنامه یا فرم اطلاعاتی ضمیمه شود) | . پرسشنامه جهت اخذ اطلاعات سنی، جنسی، علائم بیماری و ... از مراجعین 2. بررسی میکروسکوپی نمونه مدفوع با روشهای مستقیم، تغلیظ 3. کشت نمونه های مشکوک شناسایی شده در بررسی میکروسکوپی در محیط کشت سرم منعقده 3. روش مولکولی Nested PCR |
| روش اجرای طرح(با جزئیات بطور کامل شرح داده شود) | در این بررسی که به منظور شناسایی انگلهای روده ای و انتامباهیستولتیکا از انتامبادیسپار به کمک روش میکروسکوپی و مولکولی PCR Nested صورت میگیرد ابتدا نمونه های مدفوع جمع آوری شده در آزمایشگاههای مختلف منطقه مورد آزمایش میکروسکوپی قرار میگیرد و کلیه نمونه ها به محل انجام آزمایش درگروه انگل شناسی منتقل و مجدد بررسی میکروسکوپی می شوند و نمونه های مشکوک به کیست یا تروفوزوئیت آمیب در همان محل در محیط های کشت اختصاصی کشت داده و نیز بصورت فرمله در فرمالین 10 درصدو در الکل 70 درصد در میکروتیوپ 1.5 میلی لیتر نگهداری می شوند. پس از تکثیر آمیب در محیط کشت وبدست آوردن مقادیر زیاد تروفوزوئیت آمیب ها از محیط کشت جداسازی شده و DNA آن نیز از نمونه مستقیم ،محیط کشت و یا نمونه الکله استخراج می گردد . سپس با استفاده از روش PCR قطعه مورد نظر از روی DNA تکثیر و با گونه های استاندارد مقایسه خواهد شد. بطور کلی این پژوهش در سه مرحله: جمع آوری نمونه ، ازمایش میکروسکوپی ، کشت و نگهداری نمونه ها و بررسی مولکولی انجام خواهد گرفت . جمع آوری نمونه ها: جهت شروع کار جمع آوری نمونه ابتدا با اداره امور آزمایشگاههای استان سیستان وبلوچستان هماهنگی لازم بعمل و پس از معرفی به آزمایشگاه مقدمات کار که امکانات آزمایش مستقیم ، محیط کشت سرم منعقده را شامل می شود فراهم خواهد گردید. پس از فراهم نمودن امکانات مورد نیاز آزمایش نمونه های مدفوع را شروع خواهیم کرد که این نمونه ها به دو شکل تهیه و مورد آزمایش قرار خواهند گرفت: 1- نمونه مدفوع بیماران مراجعه کننده به آزمایشگاه که نمونه برداری در همان محل انجام خواهد گرفت. 2- نمونه مدفوع بیماران مراجعه کننده به بیمارستانها و سایر آزمایشگاههای دولتی وخصوصی شهر زاهدان که با هماهنگی از قبل انجام گرفته با مسئولین این آزمایشگاهها نمونه ها به آزمایشگاه منتقل و مورد بررسی قرار خواهند گرفت.روی نمونه ها آزمایش مستقیم و روش تغلیظ فرمالین اتر انجام خواهد شد. پس از انجام مراحل فوق موارد مثبت یا مشکوک و مواردی که کشت موفقیت آمیز داشتند پس از جداسازی رسوب آمیب تا زمان استخراج DNA و انجام آزمایش PCRدر فریزر C ْ20- و همینطور در الکل 70 درصد نگهداری می شوند. (نگهداری در الکل 20 درصد هم پیشنهاد میشود). -آزمایش مستقیم: آزمایش مستقیم، آزمایشات ماکروسکپی مدفوع ، تهیه لام مرطوب با سرم فیزیولوژی و تهیه لام مرطوب با لوگل را شامل می شود که در آزمایش ماکروسکوپی قوام مدفوع به شکل) Form شکل دار)، Loose (شل یا نرم) یا Watery(آبکی) گزارش می شد که تروفوزوئیت ها بیشتر در نمونه هایLoose وWatery و کیست ها در نمونه شکل دار دیده می شوند.لام مرطوب تهیه شده با سرم فیزیولوژی برای دیدن تروفوزوئیت وکیست آمیب ها بکار می رود ،همچنین لام مرطوب تهیه شده با لوگل برای رنگ آمیزی واکوئل گلیکوژنی و هسته کیست ها استفاده می شود. روش انجام آزمایش: پس از شماره گذاری لام بر اساس شماره فرم ثبت اطلاعات نمونه یک قطره سرم فیزیولوژی در یک طرف لام ویک قطره لوگل رقیق شده در طرف دیگر لام قرار داده ، با نوک اپلیکاتور مقداری (حدود 2میلی گرم) از نمونه مدفوع را ابتدا در سرم فیزیولوژی و بعد در لوگل حل نموده و پس از گذاشتن لامل روی قطرات ،به بررسی آن با عدسی 10 و40 بمدت حدود 5 دقیقه برای هریک از قطرات می پردازیم. تهیه لام مناسب کمک زیادی در تشخیص موفق می کند و هنگام تهیه لام بایستی فرم نمونه را مدنظر داشت وسعی شود چنانچه نمونه قوام دار است هم از قسمتهای داخلی و هم از سطح مدفوع نمونه برداری انجام گیرد، در مدفوع حاوی مخاط نمونه بایستی از اطراف مخاط تهیه گردد و در مدفوع شل و آبکی نمونه می تواند از هر قسمت مدفوع برداشت شود. روش رسوبی فرمالین –اتر: . روش انجام آزمایش: 1) درون یک لیوان یکبار مصرف 10 میلی لیتر فرمالین 10٪ را به حدود 1 گرم مدفوع اضافه کرده و با اپلیکاتور پلاستیکی آنرا بطوریکه یک سوسپانسیون یکنواخت بدست آید مخلوط می نماییم. 2) تنزیب را4 لایه نموده درون قیف شیشه ای قرارداده و سوسپانسیون آماده را از درون آن وارد لوله درب پیچدار مدرج نموده بطوریکه 7 میلی لیتر آن وارد لوله گردد. 3) 3 میلی لیتر اتر به آن اضافه می نماییم و درب لوله را محکم می بندیم. 4) لوله را بشدت تکان داده تا فرمالین و اتر بخوبی در هم حل شوند وسپس درب لوله را باز می کنیم تا گاز حاصله خارج گردد . (این عمل را دو تاسه بار تکرار می کنیم) 5) لوله را 1 دقیقه با دور 2000 سانتریفوژ می کنیم . پس از ساتریفوژ 4 لایه تشکیل می شود که بترتیب از بالا به پایین عبارتند از:اتر و چربی، مواد زائد مدفوع ، فرمالین وپایین ترین لایه مواد رسوبی است. 6) بوسیله یک اپلیکاتور لایه دوم را از جدار داخلی لوله جدا کرده ، سپس مواد سه لایه رویی را با واژگون کردن سریع لوله خالی می کنیم. 7) یک یا دو قطره محلول لوگل رقیق شده به رسوب می افزاییم و پس از حل نمودن رسوب در لوگل یک قطره از آنرا جهت بررسی میکروسکپی برداشته وپس از تهیه لام با عدسی 10 و40 به بررسی آن می پردازیم. نمونه هایی که بدین ترتیب در آن کیست انتامباهیستولیتیکا /انتامبادیسپار یا کیست مشابه ومشکوک مشاهده می شد درمحیط های اختصاصی کشت داده می شد ، سایر تک یاخته ها وتخم کرمهای مشاهده در این روش جهت ارزیابی شیوع انگلهای روده ای انجام خواهد شد. . کشت نمونه ها : به منظور تبدیل کیست ها به تروفوزوئیت و نیز به منظور نگهداری تروفوزوئیت ها و تکثیر آنها اقدام به کشت نمونه ها در محیط کشت سرم منعقده اسب (HSr+s) وگردید. این محیط کشت دی فازیک و گزنیک می باشند. طرز ساخت : 1- قسمت جامد:ابتدا سرم اسب را در حرارت c ˚56 به مدت 30 دقیقه غیر فعال می کنیم ، سپس مقدار 5-2 میلی لیتر از سرم غیر فعال شده را در لوله های محیط کشت درب پیچدار که قبلا'استریل کرده ایم ریخته و لوله را بطور مایل(Slant) بطوریکه ارتفاع 4 سانتی متری تشکیل دهد در دمای c ˚80 قرار می دهیم تا در همین حالت سرم منعقد گردد.( زمان انعقاد بسته به فاصله لوله ها از المنت دستگاه فرق کرده و بین 70-30 دقیقه متغیر است ، باید توجه نمودکه دماو زمان اضافی موجب پف کردن سرم و غیرقابل مصرف شدن محیط کشت می شود.) قسمت جامد در دمای یخچال تا هنگام مصرف قابل نگهداریست. قسمت مایع:شامل محلول رینگر بوده که متشکل از مواد زیر می باشد: کلرید سدیم(NaCl) 9 گرم، کلریدپتاسیم(KCl)0.2 گرم، کلرید کلسیم (CaCl2) 0.2گرم، بیکربنات سدیم (NaHCO3)0.2گرم و آب مقطرتا حجم1000 میلی لیتر. مواد فوق را در ارلن ریخته پس از حل شدن کامل pH آنرا روی 4/7- 2/7 تنظیم می کنیم (در صورت نیاز به تنظیم pH میتوان ازNaOH 40٪ استفاده نمود.) و قبل از استفاده با اتوکلاو آنرا استریل می کنیم. 3 – نشاسته برنج: نشاسته برنج بصورت تجارتی موجود می باشد تنها قبل از استفاده آنرا در لوله های درب پیچدار توسط اتوکلاو استریل می کنیم ،میزان مصرف آن برای هر میلی لیتر فاز مایع مقدار3-2 گرم می باشد. (مصرف زیادی نشاسته باعث مرگ آمیب می گردد). 4-استرپتومایسین سولفات: برای جلوگیری از رشد بیش از حد باکتری ها از این آنتی بیوتیک استفاده می شود. این آنتی بیوتیک بصورت ویال از داروخانه تهیه واز پودر خشک آن بمیزان 500-250 میکروگرم به ازای هر میلی لیتر فاز مایع به محیط کشت اضافه می شود. روش انجام کشت: ابتدا لوله فاز جامد و رینگر را از یخچال خارج می کنیم تا دمای آن به دمای اتاق برسد. و مشخصات نمونه را بر روی لوله فاز جامد ثبت می کنیم. در کنار شعله, فاز مایع (رینگر) را به لوله محیط کشت اضافه می کنیم بطوریکه کاملا'روی فاز جامد را بپوشاند، سپس مقدار 3-2 میلی گرم نشاسته برنج و 2-1 میلی گرم استرپتومایسین سولفات با ته پی پت پاستور استریل به آن می افزاییم . 30 تا 50 میلی گرم از نمونه مدفوع یا 5/0 میلی لیتر از مدفوع دیسانتری یا سوسپانسیون مدفوع در رینگر را ، در شرایط استریل به لوله کشت اضافه می کنیم. محیط کشت را برای مدت 48 ساعت در دمایC ˚ 37-5/35 انکوبه می کنیم. روش بررسی و پاساژ آمیب : پس از 48 ساعت انکوباسیون ، با کمک پی پت پاستور استریل یک قطره از رسوب ته محیط کشت را در کنار شعله برمیداریم وپس از تهیه لام در زیر میکروسکپ به مطالعه آمیب های متحرک تکثیر یافته می پردازیم. در این محیط کشت علاوه بر انتامبا هیستولیتیکا انواع آمیب ها همچون انتامبادیسپار ، انتامبا کلی، انتامبا هارتمانی، دی انتامبا فراژیلیس، بلاستوسیستیس هومینیس و تاژکداران روده ای همچون تریکوموناس هومینیس، تریکوموناس واژینالیس وکیلوماستیکس مسنیلی (بجز ژیاردیا لامبلیا) رشد می کنند ولی بجز برخی گونه های بلاستوسیستیس هومینیس که مزاحمت زیادی را در روند انجام کشت ایجاد می کند ، باقی تک یاخته ها بعد از چند پاساژ از بین می روند وتنها انتامبا هیستولتیکا و انتامبادیسپار در ادامه پاساژها باقی می مانند. برای نگهداری و پاساژ آمیب، در صورت رشد، مقدار 5/0 تا5/1 میلی لیتر (بسته به میزان تکثیر آمیب ) از ته قسمت مایع با پی پت پاستور برمی داریم وبه محیط کاملی که از قبل آماده نموده ایم انتقال میدهیم . برای نگهداری آمیب بایستی این مرحله هر 48 ساعت تکرار شود. برای صرفه جویی در مصرف سرم اسب یا عدم دسترسی به آن در مناطق دور افتاده می توان به محیط قبلی پس از تخلیه قسمت مایع ، مجددا' رینگر، نشاسته برنج و استرپتومایسین اضافه کرده و انکوباسیون را ادامه دهیم. پس از انجام مراحل فوق موارد مثبت یا مشکوک و مواردی که کشت موفقیت آمیز داشتند پس از جداسازی رسوب آمیب تا زمان استخراج DNA و انجام آزمایش PCRدر فریزر C ْ20- و همینطور در الکل 70 درصد نگهداری می شوند. (نگهداری در الکل 20 درصد هم پیشنهاد میشود). - بررسی مولکولی به منظور تعیین گونه انتامبایی که در کشت به عنوان انتامبا هیستولیتیکا /انتامبادیسپار شناسایی شده بود اقدام به بررسی مولکولی به روش PCRخواهیم نمود که این مرحله شامل آماده سازی نمونه، استخراج DNA ، انجام PCR ، الکتروفورز روی ژل آگاروز و بررسی نتایج می باشد که در ادامه شرح کامل آن آمده است. - استخراج DNA: استخراج DNA هم از نمونه های کشت شده و هم نمونه مستقیم مدفوع انجام خواهد شد. استخراج DNA بصورت مستقیم از نمونه مدفوع: 200mgمدفوع را دوبار با 1میلی لیتر PBSاستریل با PH=7 شستشو میدهیم و 5min در دور 1400g سانتریفیوژ میکنیم.DNA را هم براساس دستورالعمل شرکت سازنده کیت استخراج میکنیم. استخراج DNA از محیط کشت: بعد از پاساژ کشت،رسوب رینگر در دور800g بمدت5min سانتریفیوژمیشود و سه بار با PBSاستریل شستشو میدهیم ( PH=7.2).سپس DNA با روش فنل کلروفرم یا استخراج DNA به کمک کیت از محیط کشت استخراج خواهد شد. بطور کلی استخراج DNA شامل 4 مرحله به شرح زیر می باشد: -1آزاد سازی DNA سلول (مرحله لیز سلولی): در این مرحله از بافر لیز کننده استفاده می شود ، تریس موجود در بافر لیزکننده، نقش بافری، EDTA به عنوان مهارکننده آنزیم های DNAse بوده وSDS به عنوان حل کننده چربیهای موجود در غشاء سلول و نمونه عمل می کند، پروتئیناز K به عنوان هضم کننده پروتئین ها و اتصالات بین سلولی عمل می نماید. -2مرحله حذف مواد آلی: پروتئین ها توسط فنل و کلروفرم از نمونه حذف می شوند. فنل با pH بیشتر از 7 سبب دناتوره شدن پروتئین ها می شود و کلروفرم نیز بقایای فنل را از محلول واکنش حذف می کند. وجود مقادیر کم فنل در نمونه ، یک مهار کننده مهم در واکنش PCR است. پروتئینهای دناتوره شده به صورت یک لایه سفید در حد واسط فاز آبی و فنل دیده می شود. -3 مرحله حذف املاح و تغلیظ DNA : استات سدیم DNA را یونیزه می کند و از حل شدن آن در محیط غیر آبی می کاهد. الکل با درجه خلوص بالا، درصدآب موجود در نمونه را کاهش می دهد وDNA به شکل کدورت غیر محلول ظاهر می شود. -4 شستشوی DNA : این مرحله با الکل اتانل 70 درجه انجام می شود و پس از خشک شدن، DNA در آب مقطرحل می شود. نکته : در طی پروسه استخراج و تخلیص اسیدهای نوکلئیک باید دقت نمود تا نوکلئازها به DNA و RNA آسیب نزنند. در این مرحله DNA آماده انجام PCR خواهد بود،در این مطالعه چون نمونه ها بتدریج جمع آوری میشوند پس از استخراج DNA و قبل از انجام PCR نمونه ها در در فریزر C °20- نگهداری خواهند شد . جهت کنترل اینکه آیا DNA خالص تهیه شده از دو روش استفاده می شود که شرح آن در ادامه آمده است.یکی از روشها قراردادن DNA در میدان الکتریکی با استفاده از ژل آگاروز است و روش دیگر بررسی میزان جذب نوری محصول استخراج شده با استفاده از اسپکتروفتومتر می باشد که به توضیح آن می پردازیم. اندازه گیری مقدار DNA با استفاده از اسپکتروفتومتر: برای اینکار ابتدا DNA استخراج شده به نسبت1:50 رقیق نموده و مقدار جذب نوری آنرا در OD=260nm و OD=280nm توسط UV visible Spectrophotometr می خوانیم.در OD=260nm جذب نوری برابر 1نشاندهنده 50 میکروگرم DNA به ازاء هر میلی لیتر نمونه خواهد بود. برای تعیین درجه خلوص DNA مقدارOD در 280 نانومتر هم خوانده می شود و نسبت این دو OD محاسبه میگردد. اگر این نسبت بین 9/1-8/1 باشد، نشانگر وجود DNA خالص است، اگر نسبت از 9/1 بالاتر رود RNA در نمونه زیاد است و اگر کمتر از 8/1 شود ، نشانگر حضور پروتئین یا فنل در رسوب می باشد. تکثیر DNA با استفاده از تکنیک: Nested PCR این روش متشکل از دو مرحله است.در مرحله اول یک واکنش PCR استانداردانجام شده و در مرحله دوم محصول PCR واکنش مرحله اول به عنوان DNA الگو استفاده میشود.دوجفت پرایمرجهت انجام این روش طراحی میشود.یک جفت آن به دو انتهای توالی هدف هیبرید میشود و محل اتصال جفت پرایمر دیگر که پرایمرهای لانه گزیده معروفند،در داخل توالی محصولPCR مرحله اول قرار دارد. جفت پرایمر E-1وE-2 جنس انتامبا، برای مرحله اول out PCR و جفت پرایمرEh-1و EH-2 برای هیستولیتیکا و همچنین ED-1و ED-2 برای تشخیص دیسپار، در مرحله دوم Nested استفاده میشود.در مرحله outer PCR پرایمر قسمت بزرگتری از DNA را پوشش داده و در مرحله دوم یا ,Nested پرایمرها قسمت مکمل حاصله درمرحله اول را تکمیل میکنند. در روش Nested حساسیت و ویژگی افزایش می یابد.حتی اگر محصول PCR واکنش اول در بین پس زمینه محصولات غیر اختصاصی محو شده باشد،با استفاده از PCR داخلی امکان تکثیر مناسب و اختصاصی را خواهد داشت و احتمال اینکه محصولات غیر اختصاصی توالی های مشابه پرایمرهای داخلی را داشته باشد بسیار کم خواهد بود. در این روش محصول PCR اول رقیق شده و بعنوان الگو در مرحله دوم استفاده خواهد شد.در جدول زیر پرایمرهای مرحله اول E-1و E-2 هستند. بعد از انجام PCR مرحله یک،محصول اولیه بعنوان الگو در مرحله بعد استفاده خواهد شد.و پرایمرهای مرحله دوم بترتیب برای هیستولیتیکا و دیسپار EHو ED است.پرایمرهای EH-1وEH-2 توالی 439bp و پرایمرهای ED-1وED-2 توالی 174bp را کد میکنند. توالی بازهای آلی پرایمرهای فوق با توجه به مطالعات(2007 ) Krishna Khairnar به شرح زیر میباشد:(15) TAA GAT GCA CGA GAG CGA AA:E1 GTA CAA AGG GCA GGG ACG TA :E2 AAG CAT TGT TTC TAG ATC TGA G:ٍEH-1 AAG AGG TCT AAC CGA AAT TAG EH-2 439 TCT AAT TTC GAT TAG AAC TCT:ED-1 TCC CTA CCT ATT AGA CAT AGC :ED-2 174 پرایمرهای فوق طبق اطلاعات بروشور مربوطه توسط آب مقطر دوبار تقطیر استریل تهیه و پس از تقسیم درحجم های مشخص در 20-درجه سانتیگراد نگهداری میشود. پس از اتمام سیکل فوق برای مشاهده محصول PCR از روش الکتروفورز روی ژل و مشاهده باندها توسط نور UV استفاده میشود. الکتروفورز روی ژل و مشاهده باندها: تانکهای مورد استفاده در این نوع الکتروفورز از نوع افقی (Horizontal gel tank) می باشد که ژل بصورت افقی در داخل تانک بر روی سطحی که تعبیه شده است قرار می گیرد.و بافر TAE 1X روی سطح ژل را می پوشاند.در اکثر موارد ابتدا برای حرکت DNA بداخل ژل ولتاژ را روی 80 ولت قرار داده و پس از حرکت DNAبداخل ژل ولتاژ روی120 ولت بمدت 45 دقیقه قرار می گیرد. در این بررسی از ژل آگاروز 1.8 درصد برای انجام الکتروفورز محصول استخراج DNA وژل آگاروز 1.8درصد جهت الکتروفورز محصول PCR استفاده خواهد شد. |
| روش تجزیه، تحليل و توصیف دادهها (نمونهاي از جدول توخالي ضميمه شود و روش هاي آماري مورد استفاده به طور كامل توضيح داده شود)(کیفی و کمی) | ابتدا اطلاعات بیماران را وارد کامپیوتر کرده و برای آنالیز داده ها از نرم افزار SPSS استفاده میکنیم و سپس با استناد به روش های آماری توصیفی (جداول توزیع فراوانی ،رسم نمودار) استفاده خواهد شد. |
| ملاحظات اخلاقی | کدهای مصوب کمیته کشوری اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی حفاظت از آزمودنی در پژوهش های علوم پزشکی جهت بهره برداری و مبنای قضاوت اخلاقی (PROTECTION CODE OF HUMAN SUBJECT IN MEDICAL RESEARCH) طرحها درکمیته منطقه ای اخلاق در پژوهشهای علوم پزشکی, به شرح ذیل اعلام می گردد: 1- کسب رضایت آگاهانه درکلیه تحقیقاتی که برروی آزمودنی انسانی انجام می گیرد ضروری است در مورد تحقیقات مداخله ای ، کسب رضایت آگاهانه باید کتبی باشد. 2- ارجحیت منافع جامعه یا پیشرفت علم نمی تواند توجیهی برای قراردادن آزمودنی در معرض ضرر و زیان غیرمعقول باشد ویا محدودیتی در اعمال اراده و اختیار او ایجاد نماید. 3- کسب رضایت آگاهانه بایستی فارغ ازهرگونه اجبار ، تهدید ، تطمیع و اغوا انجام گیرد ، درغیراینصورت رضایت اخذ شده باطل و هیچ اثر قانونی بر آن مترتب نیست و درصورت بروز هرگونه خسارت ، مسئولیت آن متوجه پژوهشگر خواهد بود. 17-محقق موظف است که اطلاعات مربوط به آزمودنی را بعنوان راز تلقی و آن را افشاء ننموده و ضمناً شرایط عدم افشاء آن را نیز فراهم کند، مگر آنکه در این مسیر محدودیتی داشته باشد که در اینصورت باید قبلاً آزمودنی را مطلع نماید. 20-انجام روشهای گوناگون تحقیق نباید مغایر با موازین دینی و فرهنگی آزمودنی وجامعه باشد. |
| محدودیتهای اجرائی طرح و پیش بینی جهت حل آنها | - عدم همکاری بیمار راه حل : توضیح دادن در مورد منافع این طرح و این که هیچ ضرری متوجه آنان نخواهد شد و اطلاعات آنها به طور محرمانه باقی خواهد ماند و نامشان به هیچ عنوان فاش نخواهد شد. |
| کلمات کلیدی | انگلهای روده ای . انتامباهیستولیتیکا / انتامبا دیسپار ، میکروسکوپی، Nested PCR |
| فهرست منابع و مراجع | 1. Fakhar M, Taghavi M, Kalani H, Montazeri M, Ziaei H. Current and Novel Laboratory Diagnostic Methods for Amebiasis. Journal of Mazandaran University of Medical Sciences. 2015;24(122):440-55. eng %@ %[ 2015. 2. Anuar TS, Al-Mekhlafi HM, Abdul Ghani MK, Abu Bakar E, Azreen SN, Salleh FM, et al. Molecular epidemiology of amoebiasis in Malaysia: Highlighting the different risk factors of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar infections among Orang Asli communities. International Journal for Parasitology. 2012 12//;42(13–14):1165-75. 3. Stanley SL. Amoebiasis. The Lancet. 2003;361(9362):1025-34. 4. John DT, Patri William. Markell and Voge,s Medical Parasitology1386. 5. Blessmann J, Buss H, Nu PAT, Dinh BT, Ngo QTV, Le Van A, et al. Real-time PCR for detection and differentiation of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar in fecal samples. Journal of clinical microbiology. 2002;40(12):4413-7. 6Microscopic Study and Differentiation of Entamoeba Histolytica from Entamoeba Dispar by Polymerase Chain Reaction in Medical Centers of Zahedan. 7. Pestehchian N, Nazary M, Haghighi A, Salehi M, Yosefi H. Frequency of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar prevalence among patients with gastrointestinal complaints in Chelgerd city, southwest of Iran*. Journal of research in medical sciences: the official journal of Isfahan University of Medical Sciences. 2011;16(11):1436. 8. Bracho MA, Rivero dRZ, Arraiz N, Villalobos R, Urdaneta H. [Detection of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar by PCR in children, less than five years of age with diarrhea, in Maracaibo, Venezuela. A preliminary study]. Investigacion clinica. 2013;54(4):373-81. 9. Nazeer JT, Khalifa KES, von Thien H, El-Sibaei MM, Abdel-Hamid MY, Tawfik RAS, et al. Use of multiplex real-time PCR for detection of common diarrhea causing protozoan parasites in Egypt. Parasitology research. 2013;112(2):595-601. 10. Verweij JJ, Oostvogel F, Brienen EA, Nang‐Beifubah A, Ziem J, Polderman AM. Short communication: Prevalence of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar in northern Ghana. Tropical Medicine & International Health. 2003;8(12):1153-6. 11. بررسی تنوع ژنتیکی انتامبا هیستولیتیکا و انتامبا دیسپار در نمونه بیماران با علایم گوارشی در تهران ناظم الحسینی مجرد احسان*, حقیقی علی, کاظمی بهرام, عظیمی راد معصومه, رستمی نژاد محمد, نوچی زهرا, ابدی علیرضا, زالی محمدرضا. 12.تشخیص افتراقی انتامبا هیستولیتیکا از انتامبا دیسپار با راستی, سیما, حقیقی, حاتمی, مهرنوش 12.PCR. روش PCR. مجله علمی پژوهشی فیض::: دانشگاه علوم پزشکی کاشان. 2006;10(2):30-4. 13. Fallah E, Shahbazi A, Yazdanjoii M, Rahimi-Esboei B. Differential detection of Entamoeba histolytica from Entamoeba dispar by parasitological and nested multiplex polymerase chain reaction methods. J Analyt Res Clin Med. 2014;2(1):27-32. 14. Khairnar K, Parija SC. A novel nested multiplex polymerase chain reaction (PCR) assay for differential detection of Entamoeba histolytica, E. moshkovskii and E. dispar DNA in stool samples. BMC microbiology. 2007;7(1):1. |
| معرفی پژوهش/ اهداف پژوهش (عین عبارت هدف پروپوزال را کپی نکنید. بلکه با جملاتی که برای مردم قابل فهم باشد (برای سواد حدود پنجم ابتدایی )هدف را برای شرکت کنندگان توضیح دهید.) در تمام این متن در صورتیکه شرکت کننده کودک یا فرد فاقد ظرفیت تصمیم گیری است باید مواردیکه منظور از "من"، فرد شرکت کننده بوده است به "کودک" یا "فرد تحت سرپرستی من" اصلاح شود و مواردیکه منظور از "من"، رضایت دهنده است به من به عنوان "ولی" یا "قیم قانونی" اصلاح شود. | |
| خون گیری (آیا طرح شما نیاز به خونگیری دارد یا خیر) | |
| نحوه همکاری/ مزایا ی طرح (در این بخش برای شرکت کنندگان به زبان ساده توضیح دهید که: چه مداخله ای بر روی آنها صورت میگیرد. چه اقدامات پاراکلینیکی بر روی آنها انجام میشود. چه نمونه ای و با چه حجمی از آنها میگیرید در این مدت چند نوبت مراجعه باید داشته باشند و به چه فواصلی چه اقداماتی را در پیگیری آنها انجام میدهید. (حتی میتوانید سود بالقوه ای که شرکت کنندگان میتوانند از شرکت در این پژوهش ببرند بنویسید. این سود میتواند شرح احتمال درمان یا تشخیص بهتر بیماریشان، دریافت خدمات سلامت رایگان و یا پرداخت مشوق مالی در ازای جبران همکاریشان باشد) | |
| عوارض جانبی (منظور عوارض و میزان احتمال بروز آنها در این مطالعه است) | |
| جبران عوارض احتمالی (برای آنکه شرکت کننده بتواند ارزیابی مناسبی از سود و زیان شرکت در پژوهش شما داشته باشد لازم است بتواند سود و زیان مداخلات معمول و مداخلات این پژوهش را مقایسه کند. به عنوان مثال میزان موفقیت و میزان عوارض هریک را مقایسه کند.) - او باید بداند كه اگر در حين و بعد از انجام پژوهش هم هر مشكلي اعم از جسمي و روحي به علت شرکت در اين پژوهش برایش پيش آمد درمان عوارض، و هزينههاي آن و غرامت مربوطه بر عهده مجري خواهد بود. | |
| هزینه های مربوط به انجام طرح تحقیقاتی (تمام مداخلات پژوهشی باید برای بیمار رایگان باشد و بیمار بداند شامل چه مواردی هستند. ) | الف: هزینه پرسنلی 0 ریال ب: جمع هزینه های آزمایشات و خدمات تخصصی 0 ج: جمع هزینههای وسایل و مواد 69370000 د : جمع هزینه های مسافرت . ه: جمع هزینه های متفرقه 630000 جمع کل هزینه ها (ریال): 70000000 |
| روش های جایگزین در صورت عدم تمایل به شرکت در مطالعه چه روش های درمانی برای بیمار ارائه خواهد شد | |
| محرمانه بودن بیمار باید بداندکه دست اندر كاران اين پژوهش، كليه اطلاعات مربوط به او را نزد خود به صورت محرمانه نگهداشته و فقط اجازه دارند نتايج كلي و گروهي اين پژوهش را بدون ذکر نام و مشخصات بیمار منتشر كنند. و كميته اخلاق در پژوهش با هدف نظارت بر رعایت حقوق وی ميتواند به اطلاعات ایشان دسترسي داشته باشد. | |
| پاسخگویی به پرسش ها در این بخش نام و اطلاعات دسترسی فردی از عوامل پژوهش را که بتواند اطلاعات صحیح و کافی در اختیار شرکت کنندگان قرار دهند و در مورد عوارض و نگرانیها راهنمایی لازم را ارائه دهند ذکر شود | |
| حق نپذیرفتن یا انصراف بیمار باید بداند که شرکت اودر اين پژوهش کاملاً داوطلبانه است و مجبور به شرکت در اين پژوهش نيست و در صورت عدم شرکت از مراقبتهاي معمول تشخيصي و درماني محروم نخواهد شد او باید بداند كه حتي پس از موافقت با شركت در پژوهش ميتواند هر وقت كه بخواهد، پس از اطلاع به مجري، از پژوهش خارج شود و خروج اواز پژوهش باعث محرومیت از دریافت خدمات درمانی معمول برای اونخواهد شد. | |
| رضایت او باید بداند که اگر اشکال يا اعتراضي نسبت به دست اندركاران يا روند پژوهش دارد مي تواند با كميته اخلاق در پژوهش دانشگاه تماس گرفته و مشکل خود را به صورت شفاهي يا كتبي مطرح نمايد. در انتهای فرم قید گردد : اينجانب موارد فوقالذکر را خواندم و فهميدم و بر اساس آن رضايت آگاهانه خود را براي شركت در اين پژوهش اعلام ميکنم. اينجانب ……………… خود را ملزم به اجراي تعهدات مربوط به مجري در مفاد فوق دانسته و متعهد ميگردم در تأمين حقوق و ايمني شركت كننده در اين پژوهش تلاش نمايم | |
| پرسشنامه یا فرم اطلاعاتی | دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی درمانی زاهدان پرسشنامه طرح : بررسی میکروسکوپی انگلهای روده ای و افتراق انتامباهیستولیتیکا از انتامبا دیسپار با روش Nested PCR در مراجعین به مراکز درمانی زاهدان1394-1395 الف) مشخصات محققین : نام و نام خانوادگی استاد راهنما : دکتر علیرضا سلیمی نام و نام خانوادگی پرسشگر: تاریخ تکمیل پرسشنامه: / / 13 آیا حاضر به شرکت در مطالعه میباشید؟ ب)مشخصات بیمار : جنسیت: زن: □ مرد: □ سن: ( سال تولد ) شغل : ج)علائم بیمار: بستری: □ سرپایی: □ اسهال □ دیسانتری □ اسهال و یبوست متناوب□ رنگ مدفوع: تب: دارد □ ندارد □ زورپیچ، اسپاسم های دردناک اسفنکتر مقعدی دارد □ ندارد □ تعداد دفعات اجابت مزاج : خستگی یا ضعف : دارد □ ندارد □ د)شرایط زندگی بیمار: شهر: □ روستا: □ سابقه مسافرت : دارد □ ندارد □ آب آشامیدنی مصرفی : چاه □ لوله کشی بهداشتی □ زندگی در اماکن عمومی : بلی □ خیر □ ه)بیماریهای زمینه ای : دارد □ ( قید شود) ندارد □ و) سابق مصرف آنتی بیوتیک یا سایر داروها: دارد □ ( قید شود) ندارد □ ز) نتیجه آزمایش : • مستقیم : • کشت : • مولکولی : |
| نام فایل | تاریخ درج فایل | اندازه فایل | دانلود |
|---|
