بررسی شیوع آلودگی ویروسTT ( Transfusion Transmitted Virus ) در افراد مبتلا به بیماری های کبدی و مقایسه آن با گروه کنترل سالم با روش semi nested-pcrدر زاهدان

-  بیان مسئله تحقیق   :

کبد دومین اندام بزرگ بدن است و عملکردهای متعدد و متفاوتی را در بدن بر عهده دارد. کبد، فعل و انفعالاتی انجام می‌دهند.  کبد غذاها و نوشیدنی‌ها را به انرژی و مواد مغذی مورد نیاز بدن تبدیل می‌کند و  مواد مضر مانند الکل و سموم  را فیلتر کرده، از بدن دفع می‌کند و مسوولیت دفاع از بدن در برابر عفونت‌ها را بر عهده دارد. هنگامی که کبد آسیب ببیند یا تخریب شود، فرد متحمل نارسایی یا مشکلات کبدی می‌شود. انگل ها، ویروس‌ها و مواد شیمیایی مضر می‌توانند به سلول های کبد آسیب برسانند. چنانچه فرد دچار آسیب‌های کبدی شود، به مرور عملکرد صحیح کبد از کار می‌افتد و نارسایی کبد را در پی خواهد داشت (1-4) نارسایی کبد بر دو نوع حاد و مزمن می باشد.نارسایی حاد کبدی یک بیماری پیشرونده سریع است بعبارت دیگر عملکرد کبد ظرف یک هفته و گاهی چند روز با علل شناخته شده یا ناشناخته مختل می‌شود و کبد به سرعت عملکرد خود را از دست می دهد. برخی علل نارسایی حاد کبدی با درمان برطرف می شوند، اما برخی مواقع، پیوند کبد تنها راه درمان نارسایی حاد کبدی است (6و5) که معمولا علل نارسایی حاد کبد عبارتند از (1 : مسمومیت با استامینوفن (2 برخی داروها مثل آنتی بیوتیک ها، داروهای غیراستروئیدی ضد التهابی و داروهای ضد تشنج  .(3ویروس های هپاتیتی ( هپاتیت های نوع A و B و E) و یا ویروس های جدید خونی  از جمله TTV (  Transfusion Transmitted Virus) می توانند باعث نارسایی حاد کبدی شوند. عوارض نارسایی حاد کبدی بصورت ادم مغزی) تجمع مایعات در مغز ) و  بیماری های عفونی بروز می کند ( 6و7) اما  نارسایی مزمن کبدی با سرعت کمتری پیشرفت می‌کند. بروز علائم اولیه گاهی ماه‌ها و سال‌ها به طول می‌انجامد. نارسایی مزمن کبدی اغلب ناشی از تخریب بافت‌های کبد است که بر اثر مصرف طولانی مدت الکل ( بیماری کبدی مربوط به مصرف بالای الکل و بیماری کبد چرب ) و یا حمله ویروس های کبدی ( ویروس های هپاتیتی B   Cو ویروس های غیر هپاتیتی مثل   TTV )  می باشد . نارسایی مزمن کبدی بدلیل چندین بیماری رخ می دهد:

1-بیماری کبدی-الکلی: که بدلیل مصرف بالای الکل در افراد دیده می شود.

2-بیماری کبد چرب-غیر الکلی که بدلیل چاقی و اختلالات کبدی بروز می کند.

3-سیروز کبدی: جاهایی از سلول های بافت کبدی فیبرزی و سخت می شود که در طولانی مدت سلولها می میرندکه باعث نارسایی مزمن کبد و از کار افتادن عملکرد کبد می شود. که علت آن مصرف بالای الکل، هپاتیت ویروسی نوع B,C می دانند.

4-سرطان اولیه کبدی( primary liver cancer ) :با تخریب پیشرونده بافت کبدی با عوامل اغلب ویروسی،  بصورت سرطان اولیه و کارسینومای هپاتوسلولار (سرطان کبد پیشرفته) بروز می کند. بجز مکانیسم های بیماری های کبدی که ذکر شده ، بیماری کبدی می تواند بصورت التهاب کبدی یا هپاتیت (Hepatitis) بروز کند که این هپاتیت کبدی می تواند بر حسب بروز عوارض بافتی به صورت حاد یا مزمن دیده شود. بیماری هپاتیت حاد بیشتر توسط ویروس هپاتیت A ,E اتفاق می افتد و در حالیکه بیماری هپاتیت مزمن اغلب توسط ویروس های هپاتیت B,C بروز می کند در این حالت بطور پیشرونده آنزیم های اصلی کبدی دچار  اختلال  می شوند و با از بین رفتن سلول های کبدی و یا فیبرزی شدن آنها، سیروز کبدی ، نارسایی کبدی و نهایتا سرطان کبد را سبب می شوند. طبق گزارشات جهانی از دوازده نفر یک نفر مبتلا به یکی از اختلالات کبدی می باشد (7) امروزه حدود 300000 مورد از هپاتیت های حاد / مزمن و  بیماری سیروز کبدی در سرتاسر دنیا گزارش شده است که عامل ویروسی آن از نوع ویروس های هپاتیتی A-E نمی باشند بعبارت دیگر عامل آن ویروس های جدیدی هستند که از راه خون در حال انتشار در سطح جهانی هستند از جمله ویروس(Transfusion transmitted Virus) TT

•   که هنوز اطلاعات دقیقی از آنها در دست نیست ولی محل همانندسازی انها در سلول های کبدی می باشد که می تواند در تخریب سلول های کبدی  و نارسایی مزمن کبدی نقش مهمی داشته باشند (7و8) . اولین بار  در سال 1997 ویروس TT  از سرم یک بیمار ژاپنی که بعد از دریافت خون دچار هپاتیت حاد با علت نامشخص )  (non-A--Eشده بود جدا شد (9).

TTV  یک ویروسDNA  دار تک رشته ای و بدون پوشش با تنوع زیاد ژنتیکی است، توزیع جهانی دارد و فراوانی آن در نقاط مختلف جهان متفاوت است (10). اعتقاد بر این است که TTV یک ویروس کبددوست است چون مقدار  ویروس در کبد بیماران مبتلا به این ویروس بیش از سرم آنهاست. همچنین با روشهای in situ hybridization و PCR مشخص شده که این ویروس در درون سلولهای کبدی قرار گرفته و در آنها تکثیر می یابد و تغییرات مورفولوژیک در سلولهای آلوده مشاهده شده است (11). در  بسیاری از مایعات بدن از جمله بزاق، شیر، اشک و مدفوع یافت شده است (12) و راههای انتقال خونی (13)، گوارشی (14)، مادر به جنین و جنسی (15) برای آن پیشنهاد شده است. همچنین مشاهده شده است که آلودگی با  TTVبا افزایش ترانس آمینازهای سرم مرتبط است (16) و نیز ارتباطTTV  با هپاتیت پس از انتقال خون، هپاتیت حاد و بیماری کبدی مزمن با علت نامشخص پیشنهاد شده است ( 17)، ولی ارتباط بین عفونتTTV  و هپاتیت حاد و مزمن یا سایر بیماریها قویاً ثابت نشده و هنوز مورد بحث است (18و19). نقش احتمالی  TTV  در افزایش خطر کارسینوم هپاتوسلولار  در بیماران مبتلا به هپاتیت C مزمن هنوز در حال بررسی است (20). شیوع بالای TTV در گروههای کنترل در برخی مطالعات نقش پاتوژنیک آن را برجسته تر می کند (10).

از طرف دیگر گرچهTTV  می تواند از راه انتقال خون یا محصولات خونی آلوده منتقل شود این راههای انتقال برای توجیه شیوع بالای TTV در جمعیت سالم در بعضی نقاط جهان مانند ژاپن (%12) و اسکاتلند (%9/1) کافی نمی باشد ( 20و21).. شیوع TTV در کشورهای مختلف بطور گسترده ای متفاوت گزارش شده است، بطوریکه در بیماران کبدی حاد بدون سابقه دریافت خون 53-2% (19-15) و در بیماران با سابقه دریافت خون 40-19% (22,21,20) گزارش گردیده است. توزیع جغرافیایی، متدهای تشخیصی، حجم نمونه های مورد مطالعه، و حضور جنبه های بالینی یا دموگرافیک متفاوت می توانند از علل این تفاوتها باشند. مطالعات اولیه شیوع TTV را در اهداکنندگان خون سالم 1% تا 40% گزارش کردند (12) و با بکارگیری بیشتر پرایمرهای اختصاصی برای شناخت ژنوتیپ های مختلف، این شیوع تا 100% هم در برخی مطالعات گزارش شده است (22). بیشترین و دقیق ترین تکنیک مولکولی برای این ویروس روش Semi Nested PCR  گزارش دادند زیرا این ویروس از نظر اندازه و  ژنوم بسیار کوچک می باشد و برای کاهش خطای کار تشخیصی ، از این متد استفاده می شود. روش SemiNested-PCR  از نظر حساسیت و ویژگی تشخیصی، ارزش بالاتری نسبت به PCR معمولی دارد که  اولین بار okamato  و همکارانش به منظور شناسایی و جداسازی DNA  - TT  از این روش استفاده کردند که از  سه پرایمر استفاده می شود و در این روش ، تکنیک مولکولی  PCR در دو مرحله انجام می شود. با یک جفت پرایمر اول در طول  35 چرخه، قطعات مشخصی از DNA هدف تکثیر می یابد. سپس محصول PCR حاصل به لوله دیگری منتقل شده و بعنوان الگو استفاده می شود و بوسیله یک پرایمر دیگر مرحله دوم PCR انجام می شود (11).

 با استفاده از سه پرایمر زیر ژن ORF1 (Opean Reading Fragment1 ) در ژنوم ویروس TT ردیابی می گردد. این قطعه ژنی مسوول کد کردن پروتئین اندوکپسید این ویروس می باشد. آنالیز محصولات PCR از  ژن ORF1 در ویروس TT روی ژل آگاروز یک قطعه 271 bp می باشد. (11و12)

sense primer NG059  (5′-ACAGACAGAGGAGAAGGCAACATG-3′)

anti-sense primer NG06 (5′-CTGGCATTTTACCATTTCCAAAGTT-3′).

sense primer NG061 (5′-GGCAACATGTTATGGATAGACTGG-3′) .

  اطلاعات آماری در مورد شیوع TTV در بیماران کبدی و افراد کنترل سالم در بسیاری از نقاط کشور و بخصوص زاهدان موجود نمی باشد. و  با توجه به بالا بودن جمعیت بیماران کبدی در ایران و همچنین زاهدان، عدم وجود اطلاعات جامع در مورد بیماریزائی این ویروس در بدن، و مطرح بودن راههای مختلف انتقال (parenteral, fecal- oral, sexual)، در صورت بالا بودن شیوع TTV در این گروه از بیماران باید تمهیداتی در جهت کاهش خطر انتقال TTV به مراقبین بهداشتی و خانواده های این افراد و کسانیکه ارتباط نزدیک با آنان دارند بکار برد. که با توجه به موارد فوق بررسی شیوع TTV در جمعیت بیماران کبدی ضروری به نظر می رسد.

هدف از این پژوهش بررسی شیوع آلودگی ویروسTT (Transfusion Transmitted Virus) در افراد مبتلا به بیماری های کبدی و مقایسه آن با گروه کنترل سالم  با روش  semi nested-pcrدر شهر زاهدان می باشد.

مروری بر پژوهش های قبلی

در سال1997 Nishizawa  و همکارانش برای اولین بارویروسی با ژنوم کوچک به نام TTویروس را عامل  آسیب های بافت کبدی با زمینه نامشخص شناسایی کردند (9)

در سال1999 Tokita و همکارانش در طی تحقیقاتی که روی سلول های کبدی و میزان اتصال ویروسTT انجام دادند ادعا کردند که TTویروس میتواند سبب اختلال ونارسایی کبدی گردد اما هر نوع نارسایی کبدی بدلیلTT ویروس نیست (20).

در سال 1999 Oguchi و همکارانش با مطالعه بر روی بیماران با نارسایی کبدی که دریافت خون داشتند اظهار داشتند که این بیماران در بالاترین میزان ریسک آلودگی به ویروس های هپاتیت های B,C,Gو TTویروس می باشند که ارتباط معناداری بین افزایش مقدار این ویروس ها و تعداد دفعات واحد خون دریافت شده  وجود دارد  (21).

در سال 2003  Hsu  و همکارانش در ژاپن بیان کردند که شیوع عفونت کبدی حاصل از TT ویروس در افرادی که ابتلا به هپاتیتC ،کارسینومای هپاتوسلولار هستند بیشتر از افراد سالم دهنده خون است که TT ویروس همراه هپاتیت های دیگر می تواند زمینه هپاتیت های حاد و مزمن در کبد مهیا کنند(22).

در سال1999 Halfon و همکارانش در کره با بررسی شیوع TT ویروس در بین افراد سالم دهنده  خون و افراد بیمار هپاتیت B,C,G دهنده خون مشاهده کردند که میزان شیوع TT ویروس در افراد بیمار دهنده خون که ابتلا به هپاتیت هستند بیشتر است بطوریکه ارتباط معنی داری بین عفونت TT ویروس و هپاتیت B,C.G و آسیب های بافت کبدی و عفونت TT ویروس وجود دارد (23).

در سال 1999  Forns نیز در طی پژوهشی که بر روی افراد دهنده خون انجام دادند دریافتند که یکسری آسیب های بافتی کبدی با زمینه  نامشخص که در طی انتقال خون در افراد مشاهده می شود  بدلیل وجود TT ویروس می باشد(24).

ب- فرضیات یا سوالات پژوهشی

1. فرض بر این است که  شیوع عفونت ویروس TT در بیماران کبدی  نسبت به افراد سالم  بیشتر است .               

2- فرض بر این است که عوارض کبدی بدلیل وجود آلودگی ویروس TT  در مقایسه با بیماران کبدی بدون آلودگی به ویروس TT  بیشتر خواهد بود.

 بررسی شیوع آلودگی ویروسTT (Transfusion Transmitted Virus) در افراد مبتلا به بیماری های کبدی و مقایسه آن با گروه کنترل سالم  با روش  semi nested-pcrدر شهر زاهدان.

الف) ارزیابی شیوع عفونت ویروس TT در بیماران با سابقه  مشکلات کبدی .

ب) ارزیابی شیوع عفونت ویروس TT   در  افراد سالم.

  TTV ( Transfusion Transmitted Virus) یک ویروس بدون پوشش با DNA  حلقوی و تک رشته ای با مقدار  ژنوم 3853-3818 نوکلئوتیدی می باشد..

جامعه مورد مطالعه افراد بیمار مبتلا به بیماری کبدی (گروه مورد ) و افراد سالم کنترل شده  ( گروه شاهد )  در زاهدان می باشند. این مطالعه از نوع مورد- شاهدی (case- control study) است. 100 بیمار کبدی از بخش داخلی ( بخش بیماری های کبدی) بیمارستانهای خاتم الانبیا و علی بن ابیطالب(ع) زاهدان  بصورت تصادفی انتخاب می شوند. معیار ورود عبارت است از کلیه بیماران کبدی بستری شده در بخش بیماری های کبدی که با شرکت در این مطالعه موافق باشند. و معیار خروج ، وجود بیماری زمینه ای نظیر تالاسمی، هموفیلی ، دیالیز و کلیوی... که نیازمند به تزریق خون مکرر ، و  یا تحت درمان با داروهای ضد هپاتیت B و هپاتیت C (چون اثر این داروها بر TTV هنوز مشخص نشده است) می باشد . 100 فرد اهدا کننده خون سالم از افراد مراجعه کننده به بانک خون بصورت تصادفی انتخاب می شوند. معیار خروج وجود هر گونه بیماری حاد یا مزمن می باشد .

 با توجه به میزان افراد بیمار کبدی مراجعه کننده در دامنه زمانی سه ماه به بیمارستان های خاتم الانبیا و علی بن ابیطالب (ع) و کلینیک می باشد که با توجه به  محدودیت  زمانی و  هزینه طرح و با نظر متخضض بیماری های کبدی که ماهانه 40-50 فرد مبتلا به بیماری کبدی به بخش های درمانی (بخش بیماری های داخلی بیمارستان) مراجعه می کنند و  با نظر متخصص آمار تعداد  افراد  مورد  را  100 و  افراد  کنترل سالم  نیز 100 نفر در نظر گرفته می شود.

با سرشماری افراد مبتلا به بیماری های مزمن و یا حاد کبدی از بخش داخلی ( بخش بیماری های کبدی) بیمارستانهای خاتم الانبیا و علی بن ابیطالب(ع) زاهدان  بصورت تصادفی انتخاب می شوند.

  گروه کنترل افراد اهدا کننده خون سالم از افراد مراجعه کننده به بانک خون بصورت تصادفی انتخاب می شوند. معیار خروج وجود هر گونه بیماری حاد یا مزمن می باشد .

مشاهده و بررسی های آزمایشگاهی و پاتولوژی که با نظر پزشک متخصص تاییدی بر مبتلا بودن افراد به بیماری کبدی باشد.

روش اجرای طرح ( با جزئیات بطور کامل شرح داده شود):

 این مطالعه به صورت موردی- شاهدی در دو گروه بیمار  کبدی ( افراد بیمار مبتلا به نارسایی حاد و یا مزمن کبدی که از نظر متخصص  داخلی تایید بیماری  شده باشند ) و  گروه سالم ( خون افراد سالم کنترل شده در بانک انتقال خون ) برای بررسی میزان شیوع عفونت ویروس TT انجام می شود . به همین منظور تعداد 200  نمونه بترتیب شامل:

الف- تعداد100 نمونه خون بیمار کبدی از بخش داخلی ( بیماری های کبدی)  بیمارستانهای خاتم الانبیا و  

علی بن ابیطالب (ع) زاهدان بصورت تصادفی انتخاب می شوند. معیار ورود عبارت است از کلیه بیماران کبدی بستری شده  در بخش بیماری های کبدی که با شرکت در این مطالعه موافق باشند. و معیار خروج وجود بیماری زمینه ای نظیر تالاسمی، هموفیلی و کلیوی... که نیازمند به تزریق خون مکرر ، و  تحت درمان با داروهای ضد هپاتیت B و هپاتیت C (چون اثر این داروها بر TTV هنوز مشخص نشده است) می باشد .

 ب- تعداد 100 نمونه خون افراد اهدا کننده خون سالم ( مراجعه کننده به مرکز انتقال خون ) بصورت تصادفی انتخاب می شوند. معیار ورود شامل موافقت با شرکت در مطالعه و معیار خروج وجود هر گونه بیماری حاد یا مزمن می باشد .

از هر یک از افراد مورد نظر مقدار 5 میلی لیتر خون بر روی لوله های حاوی  EDTA گرفته شد و به آزمایشگاه منتقل می گردید. سپس با استفاده از کیت استخراج DNA، High Pure Viral Nucleic Acid Kit، بر طبق روش کیت استخراج DNA انجام می شود. سپس با استفاده از پرایمرهای اختصاصی که در زیر ذکر شده است تشخیص ویروس TTV به روش مولکولی Semi nested Pcrانجام می شود. و به منظور کاهش عوامل مختل کننده این مطالعه،  تمامی افراد  در این پروژه  تحت آزمایش ELISA به منطور  تعیین میزان آنتی بادی تولید شده بر ضد آنتی ژن E2 (Anti-E2) ویروس GBV-C ( ویروس هپاتیت G  که طبق نظر متخصص ویروس می تواند به عنوان یک عامل مختل کننده باشد زیرا این هپاتیت هنوز  همانند ویروس هپاتیت A-B-C در بیمارستان ها مورد بررسی قرار نمی گیرد .)

در ضمن در این تحقیق بمنظور بررسی هرچه دقیقتر روند عفونت ویروس فوق در گروه بیمار یکسری اطلاعات تکمیلی در ارتباط با زمینه بیماری های عفونی و ... مطابق آنچه که در پرسشنامه  قید شده و ضمیمه گردیده است، پرسیده می شود . نتایج حاصل از این مطالعه به همراه اطلاعات پرسشنامه های جمع آوری شده با آزمون های آماری نظیر Chi-square و Fisher's exact test و ANOVAموجود در نسخه 16 نرم افزارSPSS مورد تجزیه و تحلیل قرار می گیرند.

TTV.بیمار کبدی. semi-nested-pcr

References                                   

1-'Liver Diseases: MedlinePlus'. www.nlm.nih.gov. Retrieved 2015-06-20.

2-  'Liver disease - NHS Choices'. www.nhs.uk. Retrieved 2015-06-20.

3-  'CDC - Fasciola'. www.cdc.gov. Retrieved 2015-06-20.

4-'Hepatitis: MedlinePlus'. www.nlm.nih.gov. Retrieved 2015-06-20.

5-Benova L, Mohamoud YA, Calvert C, Abu-Raddad LJ (September 2014). 'Vertical transmission of hepatitis C virus: systematic review and meta-analysis'. Clinical Infectious Diseases 59 (6): 765–73. doi:10.1093/cid/ciu447. PMC 4144266. PMID 24928290.

6-Komatsu H (July 2014). 'Hepatitis B virus: where do we stand and what is the next step for eradication?'. World journal of gastroenterology 20 (27): 8998–9016. doi:10.3748/wjg.v20.i27.8998. PMC 4112872. PMID 25083074.

7-Samal J, Kandpal M, Vivekanandan P (January 2012). 'Molecular Mechanisms Underlying Occult Hepatitis B Virus Infection'. Clinical Microbiology Reviews 25 (1): 142–163. doi:10.1128/CMR.00018-11. PMC 3255968. PMID 22232374

8-Suk KT, Kim MY, Baik SK (September 2014). 'Alcoholic liver disease: treatment'. World journal of gastroenterology 20 (36): 12934–44. doi:10.3748/wjg.v20.i36.12934. PMC 4177474. PMID 25278689

9-Nishizawa T,  Okamoto H,  Konishi K , et al. A novel DNAvirus (TTV) associated with elevated trans aminase levels in post transfusion hepatitis of unknown etiology.  Biochem Biophys Res Commun 1997; 241: 92–97.

10. Abe K, Inami T, Asano K, et al: TT virus infection is widespread in the general populations from different geographic regions. Journal of Clinical Microbiology 1999; 37:2703–2705.

11. Rodriguez-Inigo E, Casqueiro M, Bartolome J, et al: Detection of TT virus DNA in liver biopsies by in situ hybridization.  Am J Pathol  2000; 156:1227-34.

12-. Matsubara M, Michitaka K, Horiike N, et al: Existence of TT Virus DNA in Extracellular Body Fluids from Normal Healthy Japanese Subject. Inter virology 2000; 43:16-9.                   

13. Simmonds P, Davidson F, Lycett C, et al: Detection of a novel DNA virus (TTV) in blood donors and blood products. Lancet 1998; 352:191–195.

14. Okamoto H, Akahane Y, Ukita M, et al: Fecal excretion of a nonenveloped DNA virus (TTV) associated with posttransfusion non-A–G hepatitis. J Med Virol 1998; 56:128–13.

15. Schröter M, Polywka S, Zöllner B, et al: Detection of TT Virus DNA and GB Virus Type C/Hepatitis G Virus RNA in Serum and breast milk: determination of mother-to-child transmission. J Clin Microbiol 2000; 38:745-7.

16. Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, et al: Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus (TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Hepatol Res 1998; 10:1–16.

17. Charlton M, Adjei F, Poterucha J, et al: TT-Virus infection in North American blood donors, patients with fulminant hepatic failure and cryptogenic cirrhosis. Hepatology 1998; 28:839–842.

18- Dai CY, Yu ML, Chuang WL, et al: Epidemiology and clinical significance of chronic hepatitis-related viruses infection in hemodialysis patients from Taiwan. Nephron 2002; 90:148-53.

19. Irshad M, Sharma Y, Dhar I, et al: Transfusion-transmitted virus in association with hepatitis A-E viral infections in  various forms of liver diseases in India.  World J Gastroenterol  2006; 12:2432-6.

20. Tokita H, Murai S, Kamitsukasa H, et al: High TT virus load as an independent factor associated with the occurrence of hepatocellular carcinoma among patients with hepatitis C virus-related chronic liver disease.  J Med Virol  2002; 67:501-9

21. Oguchi T, Tanaka E, Orii K, et al: Transmission of and liver injury by TT virus in patients on maintenance hemodialysis. J Gastroentrol 1999; 34:234-40.

22. Hsu HY, Ni YH, Chen HL, et al: TT virus infection in healthy children, children after blood transfusion, and children with non-A to E hepatitis or other liver diseases in Taiwan.  J Med Virol  2003; 69:66-71.

23. Halfon P, Bourliere M, Feryn JM, et al: Prevalence of transmitted transfusion virus (TTV) in populations at different risk for hepatitis virus: hemodialysis, chronic hepatitis C and cryptogenetic hepatitis patients. J Hepatol 1999; 30:552-6.

24. Forns X, Hegerich P, Darnell A, et al: High prevalence of TT virus (TTV) infection in patients on maintenance hemodialysis: frequent mixed infections with different genotypes and lack of evidence of associated liver disease. J Med Virol 1999; 59:313-7.

روش اجرای طرح ( با جزئیات بطور کامل شرح داده شود):

 این مطالعه به صورت موردی- شاهدی در دو گروه بیمار ( مشکلات کبدی ) و  گروه سالم ( خون افراد سالم کنترل شده در بانک انتقال خون ) برای بررسی میزان شیوع عفونت ویروس TT انجام می شود . به همین منظور تعداد 200  نمونه بترتیب شامل:

الف- تعداد100 نمونه خون بیمار کبدی از بخش داخلی ( بیماری های کبدی)  بیمارستانهای خاتم الانبیا و  

علی بن ابیطالب (ع) زاهدان بصورت تصادفی انتخاب می شوند. معیار ورود عبارت است از کلیه بیماران کبدی بستری شده  در بخش بیماری های کبدی که با شرکت در این مطالعه موافق باشند. و معیار خروج وجود بیماری زمینه ای نظیر تالاسمی، هموفیلی و کلیوی... که نیازمند به تزریق خون مکرر ، و  تحت درمان با داروهای ضد هپاتیت B و هپاتیت C (چون اثر این داروها بر TTV هنوز مشخص نشده است) می باشد .

 ب- تعداد 100 نمونه خون افراد اهدا کننده خون سالم ( مراجعه کننده به مرکز انتقال خون ) بصورت تصادفی انتخاب می شوند. معیار ورود شامل موافقت با شرکت در مطالعه و معیار خروج وجود هر گونه بیماری حاد یا مزمن می باشد .

از هر یک از افراد مورد نظر مقدار 5 میلی لیتر خون بر روی لوله های حاوی  EDTA گرفته شد و به آزمایشگاه منتقل می گردید. سپس با استفاده از کیت استخراج DNA، High Pure Viral Nucleic Acid Kit، بر طبق روش کیت استخراج DNA انجام می شود. سپس با استفاده از پرایمرهای اختصاصی که در زیر ذکر شده است تشخیص ویروس TTV به روش مولکولی Semi nested Pcrانجام می شود. و به منظور کاهش عوامل مختل کننده این مطالعه،  تمامی افراد  در این پروژه  تحت آزمایش ELISA به منطور  تعیین میزان آنتی بادی تولید شده بر ضد آنتی ژن E2 (Anti-E2) ویروس GBV-C ( ویروس هپاتیت G  که طبق نظر متخصص ویروس می تواند به عنوان یک عامل مختل کننده باشد زیرا این هپاتیت هنوز  همانند ویروس هپاتیت A-B-C در بیمارستان ها مورد بررسی قرار نمی گیرد .)

در ضمن در این تحقیق بمنظور بررسی هرچه دقیقتر روند عفونت ویروس فوق در گروه بیمار یکسری اطلاعات تکمیلی در ارتباط با زمینه بیماری های عفونی و ... مطابق آنچه که در پرسشنامه  قید شده و ضمیمه گردیده است، پرسیده می شود . نتایج حاصل از این مطالعه به همراه اطلاعات پرسشنامه های جمع آوری شده با آزمون های آماری نظیر Chi-square و Fisher's exact test و ANOVAموجود در نسخه 16 نرم افزارSPSS مورد تجزیه و تحلیل قرار می گیرند.

روش اجرای طرح ( با جزئیات بطور کامل شرح داده شود):

 این مطالعه به صورت موردی- شاهدی در دو گروه بیمار ( مشکلات کبدی ) و  گروه سالم ( خون افراد سالم کنترل شده در بانک انتقال خون ) برای بررسی میزان شیوع عفونت ویروس TT انجام می شود . به همین منظور تعداد 200  نمونه بترتیب شامل:

الف- تعداد100 نمونه خون بیمار کبدی از بخش داخلی ( بیماری های کبدی)  بیمارستانهای خاتم الانبیا و  

علی بن ابیطالب (ع) زاهدان بصورت تصادفی انتخاب می شوند. معیار ورود عبارت است از کلیه بیماران کبدی بستری شده  در بخش بیماری های کبدی که با شرکت در این مطالعه موافق باشند. و معیار خروج وجود بیماری زمینه ای نظیر تالاسمی، هموفیلی و کلیوی... که نیازمند به تزریق خون مکرر ، و  تحت درمان با داروهای ضد هپاتیت B و هپاتیت C (چون اثر این داروها بر TTV هنوز مشخص نشده است) می باشد .

 ب- تعداد 100 نمونه خون افراد اهدا کننده خون سالم ( مراجعه کننده به مرکز انتقال خون ) بصورت تصادفی انتخاب می شوند. معیار ورود شامل موافقت با شرکت در مطالعه و معیار خروج وجود هر گونه بیماری حاد یا مزمن می باشد .

از هر یک از افراد مورد نظر مقدار 5 میلی لیتر خون بر روی لوله های حاوی  EDTA گرفته شد و به آزمایشگاه منتقل می گردید. سپس با استفاده از کیت استخراج DNA، High Pure Viral Nucleic Acid Kit، بر طبق روش کیت استخراج DNA انجام می شود. سپس با استفاده از پرایمرهای اختصاصی که در زیر ذکر شده است تشخیص ویروس TTV به روش مولکولی Semi nested Pcrانجام می شود. و به منظور کاهش عوامل مختل کننده این مطالعه،  تمامی افراد  در این پروژه  تحت آزمایش ELISA به منطور  تعیین میزان آنتی بادی تولید شده بر ضد آنتی ژن E2 (Anti-E2) ویروس GBV-C ( ویروس هپاتیت G  که طبق نظر متخصص ویروس می تواند به عنوان یک عامل مختل کننده باشد زیرا این هپاتیت هنوز  همانند ویروس هپاتیت A-B-C در بیمارستان ها مورد بررسی قرار نمی گیرد .)

در ضمن در این تحقیق بمنظور بررسی هرچه دقیقتر روند عفونت ویروس فوق در گروه بیمار یکسری اطلاعات تکمیلی در ارتباط با زمینه بیماری های عفونی و ... مطابق آنچه که در پرسشنامه  قید شده و ضمیمه گردیده است، پرسیده می شود . نتایج حاصل از این مطالعه به همراه اطلاعات پرسشنامه های جمع آوری شده با آزمون های آماری نظیر Chi-square و Fisher's exact test و ANOVAموجود در نسخه 16 نرم افزارSPSS مورد تجزیه و تحلیل قرار می گیرند.