شناسایی ژنهای مقاوم به سیپروفلوکساسین در باکتری انتروکوک فکالیس جدا شده از نمونه های کلینیکی عفونت های اندودونتیک در بیماران شهر زاهدان در سال 1395

.    هدف  از درمان ریشه، از بین بردن باکتری‌های سیستم کانال و مهیا کردن محیطی مناسب برای بهبود  بافت پری‌اپیکال است.(1) نقش میکروارگانیسم‌ها در ایجاد و تداوم بیماری‌های پالپ و پری‌اپیکال توسط مطالعات انسانی و حیوانی فراوان به خوبی نشان داده شده‌است.(2) میکروارگانیسم ها در کانال‌های عفونی و بافت‌های پری‌رادیکولر، توانایی تهاجم و جای گرفتن در عمق عاج و سمنتوم اطراف ریشه‌ی دندان را دارند. عفونت کانال ریشه، 'پلی میکروبیال' و متشکل از هر دو نوع باکتری هوازی و بی هوازی می‌باشد. یک مطالعه تعداد گونه‌های باکتریایی دخیل در عفونت کانال ریشه را تا 600 گونه گزارش کرده است.(3)
  جهت حذف عفونت کانال ریشه و بهبود ضایعات پری اپیکال، دقت در انجامِ تمامِ اجزای درمان مورد نیاز است. مراحلِ اصلی در درمانِ عفونت اندودونتیک شامل پاکسازی و شکل دهی کانال( اینسترومنتیشن و شستشو)، استفاده از داروهای داخل کانال در بین جلسات، پر کردگی کانال ریشه ، ترمیم تاجی و علاوه بر این همه، عملکردِ سیستمِ ایمنی بیمار است(4, 5) اما این توالی و اهمیت بخش‌های مختلف درمان، در پروسه‌ی «رژنراسیون» (Regeneration) دستخوش تغییر می‌شود.
  روش درمانی رژنراسیون به عنوان پروسه ای با پایه ی بیولوژیک که به هدف جایگزین کردن ساختارهای آسیب دیده مثل عاج، ساختار ریشه و سلول های کمپلکس پالپ-عاج انجام می گردد، تعریف می شود. (6)این روش درمانی جدید به عنوان یک آلترناتیو درمانی، که هدف آن علاوه بر ترمیم پریودونتیت اپیکال، بهبود عملکرد فیزیولوژیک پالپ نرمال نیز هست، مورد استقبال قرار گرفته است. مطالعات ادامه ی تکامل ریشه و عصب گیری نرمال را با انجام این درمان نشان داده اند. (7)هدف نهایی این روش، رژنراسیونِ اجزا و عملکردِ نرمال کمپلکس پالپ- عاج است.
   اول بار، دکتر Nygaard-Ostby  دردهه شصت میلادی نشان داد که بعد از عبور فایل از اپیکال ریشه و القا خونریزی در کانال، بافتِ واسکولاره ی تازه ای در قسمت خالی اپیکالی ریشه شکل میگیرد.(8) در 1966 مطالعه ای منتشر شد که نشان  می داد ضدعفونی سازی می تواند به صورت اولیه با دارویی ترکیبی از چند آنتی بیوتیک که در بین جلسات در کانال قرار داده می شود، اتفاق بیفتد.(9) پنج سال بعدتر نتایج مطالعه دیگری نشان داد که از بین رفتن علایم و ادامه ی تکامل ریشه با استفاده از انتی بیوتیک ها در پروتکل ضدعفونی سازی و القاء عامدانه ی خونریزی در داخل کانال اتفاق می‌افتد. (8) نخستین گزارش معاصر از پروسه ی رژنراسیون در سال 2001 منتشر شد.(7) از آن زمان گزارش مورد های بسیاری از نتایج کلینیکی این درمان شامل از بین رفتن علایم و نشانه های پریودونتیت اپیکال، ادامه ی تکامل ریشه و در موارد خاص، پاسخ نرمال به تست های وایتالیتی منتشر شده است.(7) علیرغم  عدم وجود کارآزمایی های بالینی تصادفی، این مطالعات کلینیکی این فرضیه را حمایت می کنند که بیماران با گزینه های درمانی محدود، می توانند از این روش درمانی منتفع شوند.

   در درمان رژنراسیون از دبریدمانِ مکانیکیِ دیواره های کانال اجتناب می شود زیرا این امر موجب آسیب به stem cell های بافت اپیکالی، که برای ایجاد دوباره بافت در کانال ریشه ضروری هستند، می گردد.(10, 11) از این جهت  برای ضد عفونی کانال ریشه استفاده از محلول های شستشو و نیز استفاده از داروها در بین جلسات اهمیت بیشتری می یابد. (12)شایع ترینِ این داروهای داخل کانال، خمیر ترکیبی آنتی بیوتیک است.(13)احتمالاً توانایی این ترکیب آنتی بیوتیکی در حذف باکتری های توبول های عاجی(14) مهمترین دلیل استفاده گسترده از آن است.

   گسترش استفاده از خمیر انتی بیوتیک تا حد زیادی مرهون Hoshino و همکاران اوست.(14) آنها موثر بودن ترکیب آنتی بیوتیک ها ( و به طور خاص: سیپروفلوکساسین، مترونیدازول و ماینوسیکلین) را در از بین بردن باکتری های عاجِ عفونی ریشه نشان دادند.(15) همچنین آنها متوجه شدند که خمیر آنتی بیوتیک سه گانه می تواند کمکِ مهمی در پروسه ی رِواسکولاریزاسیون انجام دهد، زیرا این ترکیب دارویی با کاهش دادن یا از بین بردنِ باکتری های موجود در کانال، محیط را برای رشد بافت عروقی و سلول ها اماده می کند. کارآبودن آنتی بیوتیک سه گانه در ضد عفونی سیستم کانال ریشه  در مدل پری کلینیکی و بر روی سگ نیز نشان داده شده است.(16) مزیت مهم این ترکیب آنتی بیوتیکی، تاثیر بالای آن بر  روی میکروارگانیسم های اندودونتیک است  و موثر بودن آن با استفاده ی از آن در بیشتر گزارش موردهای منتشر شده حمایت می شود.(7)

   خمیر آنتی بیوتیک سه گانه(Triple antibiotic) حاوی سه آنتی بیوتیک مترونیدازول (Metronidazole)، سیپروفلوکساسین( Ciprofloxacin) و ماینوسیکلین (Minocycline)است. مترونیدازول دارویی nitronmidazol است که بر پروتوزوآ و باکتری‌های بی‌هوازی اثر می‌گذارد و سیپروفلوکساسین، فلوروکوئینولون سنتتیک است که اثر باکتریسیدال دارد. (16)منابع موجود نشان می دهند که آنتی بیوتیک سه گانه بصورت موثری قادر به استریل کردن کانال و نتیجتاً ترمیم ضایعه پری اپیکال است.(17) نتایج مطالعه‌ای در سال 2011 نشان داد که ترکیب آنتی بیوتیک سه گانه تا 99% قادر به از بین بردن گونه ی باکتریایی مقاومی مثل E.faecalis موجود در کانال ریشه است.(18)

   اما یک مانعِ مهم در مقابلِِ اثرگذاریِ آنتی بیوتیک ها، به وجود آمدنِ مقاومتِ باکتریایی در برابرِ آنهاست. مطالعات نشان می دهند که میکروبیوتای دهانی به عنوان یک مخزن برای بسیاری از ژن های مقاومت به آنتی بیوتیک ها (از جمله آنتی بیوتیک های رایج مثل بتالاکتام ها، تتراسیکلین ها و ماکرولید ها) عمل می کند.(19, 20) این موضوعی نگران کننده است زیرا انتی بیوتیک ها به صورت گسترده برای درمان عفونت های دهانی و از جمله عفونت های با منشا اندودونتیک تجویز می شوند.(21) آنتی بیوتیک ها در موارد خاص و به صورت سیستمیک یا موضعی قابل تجویز هستند. استفاده ی سیستمیک از آنتی بیوتیک ها در اندودونتیک شامل آبسه های حاد با درگیری سیستمیک، عفونت های گسترش یابنده، عفونت های موضعی در افراد با نقص ایمنی و یا به جهت پروفیلاکسی است.(22) استفاده ی موضعی نیز همانطور که پیشتر توضیح داده شد، اخیراً و به عنوان داروی داخل کانال، در درمان رژنراسیون مورد استفاده قرار می گیرد. در نتیجه انتخاب موثرترین آنتی بیوتیک جهت استفاده ی سیستمیک یا موضعی، به درک صحیح از الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی در اجتماع باکتریایی بستگی دارد.

در زیر به اختصار درباره ی مکانیسم مقاومت و ژن های موثر در ایجاد مقاومت نسبت به آنتی بیوتیک سیپروفلوکساسین که در این مطالعه مورد بررسی قرار خواهد گرفت، صحبت می شود:

سیپروفلوکساسین: افزایش استفاده از فلوروکینولون ها منجر به افزایش مقاومت به این دسته دارویی نیز شده است. مقاومت به فلوروکینولون ها به صورت تیپیک ناشی از تغییر در آنزیم های هدف (شاملِ DNA gyrase و Topoisomeras IV) و نیز تغییر در ورود و دفع دارو است. (23)تغییر در زیر گروهِ gyr A از DNA gyrase و زیر گروهِ parC  از توپوایزومراز، مهمترین نقش را در سطح بالای مقاومتِ باکتری های گرم منفی به فلوروکینولون ها دارند.(24) همچنین تغییر در این دو ژن نقش مرکزی را در کسب مقاومت در گونه های ایزوله شده ی  Acinetobacter  به سیپروفلوکساسین بازی می کند.(25, 26)
مطالعه ای در سال 1995 با بررسی بر روی گونه P.aeruginosa  نتیجه گرفت که جهش در ژنgyr A  مهمترین مکانیسم برای مقاومت به فلوروکینولون هاست.(27)
مطالعه ای در سال 1999 با بررسی بر روی نمونه های مقاوم به سیپروفلوکساسین، جهش در ژن gyr A را درآنها نشان داد.(28)
مطالعه ی Zhao  در سال 2013 جهش در ژن های gyr A  و parC را مرتبط با سطوح بالای مقاومت در Neisseria gonorrhea نشان داد.(29)
 مطالعه ی Chaudhry نیز جهش دوگانه یا سه گانه در gyr A  به تنهایی یا همراه با par C  را مسئول مقاومت بالای Neisseria gonorrhea  به سیپروفلوکساسین معرفی کرد.(30)

***
   علیرغم توسعه و شیوع درمان رژنراسیون و استفاده ی گسترده از خمیر ترکیبی انتی بیوتیک در آن، مقاومت های ژنی متفاوت سویه های باکتریایی در عرصه های مختلف درمانی رو به گسترش است. مقاومت دارویی یکی از عوارض مهم تکامل پاتوژنی در محیط می باشد و این موضوع را به یکی از دغدغه های سیستم سلامت بدل کرده است. بویژه، مقاومت دارویی مسئول رخداد مرگ های متعدد، افزایش میزان بستری ها و طولانی شدن دوره های درمانی در سیستم درمانی بوده است. در ایالات متحده آمریکا، هزینه های تحمیل شده بر سیستم سلامت ناشی از مقاومت دارویی سالانه ده ها میلیادر دلار  تخمین زده شده است. مطالعات در زمینه مداخلات دارویی نقش مهمی در کنترل اپیدمی های پاتوژنیک ایفا کرده اند، با این وجود و با توجه به تکامل رو به گسترش سویه های مقاوم پاتوژنیک، همچنان مطالعات گسترده ای در زمینه تکامل مقاومت دارویی مورد نیاز هستند (23). با توجه به این موضوع،   ارزیابی عملکرد استفاده از داروها در مناطق مختلف ضروری به نظر می رسد لذا در این مطالعه ی به بررسی تاثیر سیپروفلوکساسین بر باکتری های کانال ریشه عفونی بیماران اندودونتیک شهر زاهدان در سال 1395 می پردازد.

 

1-میزان فراوانی ژن های مقاوم به سیپروفلوکساسین(  gyr Aو  par C)در نمونه های جدا شده از کانال ریشه عفونی چه میزان است؟
2- میزان  کلی فراوانی ژن های مقاومت در نمونه های جدا شده از کانال عفونی چه میزان است؟
3- شیوع انتروکوک فکالیس در کانال های ریشه عفونی چه میزان است؟

تعیین وجود ژنهای مقاوم به سیپروفلوکساسین ( gyr A و par C) در باکتری انتروکوک فکالیس جدا شده از نمونه های عفونت های اندودونتیک

1- تعیین میزان فراوانی ژن par C در نمونه های جدا شده از کانال ریشه عفونی
2-تعیین میزان فراوانی ژن gyr A در نمونه های جدا شده از کانال ریشه عفونی 
3- تعیین میزان کلی فراوانی ژن های مقاومت به داروهای مترونیدازول و یپروفلوکساسین در نمونه های جدا شده از کانال عفونی
4- تعیین شیوع باکتری انتروکوک فکالیس در کانال های ریشه عفونی

سیپروفلوکساسین: آنتی بیوتیکی از دسته فلوروکوئینولونها است که اثر باکتریسیدال دارد.
ژن مقاوم: ژن هایی در میکروارگانیسم ها که مقاومت به داروهای انتی بیوتیکی را موجب می شوند.
انتروکوک فکالیس: گونه باکتریایی گرم مثبت و بی هوازی که عمدتاً در لوله گوارش و مجرای تناسلی-ادراری و نیز در کانال ریشه عفونی دندان وجود دارد.
اندودونتیکس: شاخه ای از علم دندانپزشکی که با تشخیص و درمان بیماری های پالپ دندان سر وکار دارد.
عفونت: تهاجم و تکثیر میکروارگانیسم های پاتوژنیک در بدن که موجب آسیب بافتی و ایجاد بیماری می شود.

معیارهای ورود:
- بیمار مراجعه کننده به بخش اندودونتیکس دانشکده دنداتپزشکی زاهدان که پس از انجام تست های وایتالیتی، تشخیص 'پالپ نکروزه' باری دندان او گذاشته شود.
- پالپ دندان در ارتباط با حفره‌ی دهان نباشد
- بیمار در طی سه ماه گذشته در بیمارستان بستری نشده و آنتی بیوتیک مصرف نکرده باشند.
- دندان مورد نظر تحت درمان اندو قرار نگرفته باشد
معیارهای خروج:
- عدم وجود پالپ نکروزه پس از ورود به پالپ چمبر و کانال ریشه
-  عدمِ امکانِ ایزولاسیون دندان و آلودگیِ محیط درمان توسط بزاق
- بیمارانی که در ضمن درمان، مصرف داروهای مخدوش کننده مطالعه را به یاد بیاورند

مطابق با مطالعات مشابه صورت گرفته توسط Rocas  و همکاران(43) در سال 2012 و نیز مطالعه دیگر او در سال 2013(44)،  تعداد26 نمونه(25 نمونه برای بررسی مقاومت ژنی و یک نمونه به عنوان کنترل) بدست امده از کانال های نکروزه ، در مطالعه وارد خواهند شد.

پس از جمع آوری داده ها ، نتایج حاصله را در نرم افزار spss(ورژن 22.0.0)  وارد شده و یافته ها با استفاده از روش آماری توصیفی داده ها، آنالیز خواهند شد.
 

الف) یافتن تعداد نمونه‌های مورد نظر که با معیارهای ورود و خروج مطالعه تطابق داشته باشند
ب)هزینه ی بالای انجام مراحل PCR

سعی خواهد شد تا زمان بیشتری جهت یافتن مواردی که تمام معیارهای ورود و خروج مطالعه را دارند صرف شود که با توجه به تعداد زیاد مراجعین به کلینیک دانشکده دندانپزشکی، یافتن تعدادِ مشخص شده ی بیماران، ممکن خواهد بود.
با کاستن از هزینه های دیگر، و با توجه به بودجه پیش بینی شده، بررسی ژن های مورد نظر ممکن خواهد بود.

سیپروفلوکساسین- ژن مقاوم- انتروکوک فکالیس-عفونت- اندودونتیک
 Ciprofloxacin-Resistance gene-Enterococcus faecalis-Endodontic- Infection

1.            Siqueira JF. Endodontic infections: concepts, paradigms, and perspectives. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology. 2002;94(3):281-93.

2.            Sundqvist G. Ecology of the root canal flora. Journal of Endodontics. 1992;18(9):427-30.

3.            Özok A, Persoon I, Huse S, Keijser B, Wesselink P, Crielaard W, et al. Ecology of the microbiome of the infected root canal system: a comparison between apical and coronal root segments. International endodontic journal. 2012;45(6):530-41.

4.            Spangberg LS, Haapasalo M. Rationale and efficacy of root canal medicaments and root filling materials with emphasis on treatment outcome. Endodontic Topics. 2002;2(1):35-58.

5.            Haapasalo M, Endal U, Zandi H, Coil JM. Eradication of endodontic infection by instrumentation and irrigation solutions. Endodontic topics. 2005;10(1):77-102.

6.            Murray PE, Garcia-Godoy F, Hargreaves KM. Regenerative endodontics: a review of current status and a call for action. Journal of endodontics. 2007;33(4):377-90.

7.            Diogenes A, Henry MA, Teixeira FB, Hargreaves KM. An update on clinical regenerative endodontics. Endodontic Topics. 2013;28(1):2-23.

8.            NYGAARD‐ÖSTBY B, HJORTDAL O. Tissue formation in the root canal following pulp removal. European Journal of Oral Sciences. 1971;79(3):333-49.

9.            Rule D, Winter G. Root growth and apical repair subsequent to pulpal necrosis in children. British dental journal. 1966;120(12):586.

10.          Wigler R, Kaufman AY, Lin S, Steinbock N, Hazan-Molina H, Torneck CD. Revascularization: a treatment for permanent teeth with necrotic pulp and incomplete root development. Journal of endodontics. 2013;39(3):319-26.

11.          Law AS. Considerations for regeneration procedures. Journal of endodontics. 2013;39(3):S44-S56.

12.          Geisler TM. Clinical considerations for regenerative endodontic procedures. Dental Clinics of North America. 2012;56(3):603-26.

13.          Kontakiotis EG, Filippatos CG, Tzanetakis GN, Agrafioti A. Regenerative endodontic therapy: a data analysis of clinical protocols. Journal of endodontics. 2015;41(2):146-54.

14.          Hoshino E, Kurihara‐Ando N, Sato I, Uematsu H, Sato M, Kota K, et al. In‐vitro antibacterial susceptibility of bacteria taken from infected root dentine to a mixture of ciprofloxacin, metronidazole and minocycline. International endodontic journal. 1996;29(2):125-30.

15.          Sato I, Ando‐Kurihara N, Kota K, Iwaku M, Hoshino E. Sterilization of infected root‐canal dentine by topical application of a mixture of ciprofloxacin, metronidazole and minocycline in situ. International endodontic journal. 1996;29(2):118-24.

16.          Windley W, Teixeira F, Levin L, Sigurdsson A, Trope M. Disinfection of immature teeth with a triple antibiotic paste. Journal of endodontics. 2005;31(6):439-43.

17.          Vijayaraghavan R, Mathian VM, Sundaram AM, Karunakaran R, Vinodh S. Triple antibiotic paste in root canal therapy. Journal of Pharmacy And Bioallied Sciences. 2012;4(6):230.

18.          Madhubala MM, Srinivasan N, Ahamed S. Comparative evaluation of propolis and triantibiotic mixture as an intracanal medicament against Enterococcus faecalis. Journal of endodontics. 2011;37(9):1287-9.

19.          Kim S-M, Kim HC, Lee S-WS. Characterization of antibiotic resistance determinants in oral biofilms. The Journal of Microbiology. 2011;49(4):595-602.

20.          Kouidhi B, Zmantar T, Hentati H, Najjari F, Mahdouni K, Bakhrouf A. Molecular investigation of macrolide and Tetracycline resistances in oral bacteria isolated from Tunisian children. Archives of oral biology. 2011;56(2):127-35.

21.          Baumgartner JC, Smith JR. Systemic antibiotics in endodontic infections. Endodontic Microbiology 1st edn Ames, IA: Wiley-Blackwell. 2009:225-41.

22.          Siqueira JF, Rôc̦as IN, Lopes HP. Treatment of endodontic infections: Quintessence Publishing London; 2011.

23.          Jacoby GA. Mechanisms of resistance to quinolones. Clinical Infectious Diseases. 2005;41(Supplement 2):S120-S6.

24.          Ruiz J. Mechanisms of resistance to quinolones: target alterations, decreased accumulation and DNA gyrase protection. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2003;51(5):1109-17.

25.          Vila J, Ribera A, Marco F, Ruiz J, Mensa J, Chaves J, et al. Activity of clinafloxacin, compared with six other quinolones, against Acinetobacter baumannii clinical isolates. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2002;49(3):471-7.

26.          Nowroozi J, Sepahi AA, Kamarposhti LT, Razavipour R, Mazhar F. Evaluation of ciprofloxacin (gyrA, parC genes) and tetracycline (tetB gene) resistance in nosocomial Acinetobacter baumannii infections. Jundishapur Journal of Microbiology. 2014;7(2).

27.          Cambau E, Perani E, Dib C, Petinon C, Trias J, Jarlier V. Role of mutations in DNA gyrase genes in ciprofloxacin resistance of Pseudomonas aeruginosa susceptible or resistant to imipenem. Antimicrobial agents and chemotherapy. 1995;39(10):2248-52.

28.          Zirnstein G, Li Y, Swaminathan B, Angulo F. Ciprofloxacin Resistance in Campylobacter jejuniIsolates: Detection of gyrA Resistance Mutations by Mismatch Amplification Mutation Assay PCR and DNA Sequence Analysis. Journal of Clinical Microbiology. 1999;37(10):3276-80.

29.          Zhao L, Zhao S. Molecular basis of high-level ciprofloxacin resistance in Neisseria gonorrhoeae strains from Shandong Province, China. Brazilian Journal of Microbiology. 2013;44(1):273-6.

30.          Chaudhry U, Ray K, Bala M, Saluja D. Mutation patterns in gyrA and parC genes of ciprofloxacin resistant isolates of Neisseria gonorrhoeae from India. Sexually transmitted infections. 2002;78(6):440-4.

31.          Rôças IN, Siqueira JF. Antibiotic resistance genes in anaerobic bacteria isolated from primary dental root canal infections. Anaerobe. 2012;18(6):576-80.

32.          Rôças IN, Siqueira JF. Detection of antibiotic resistance genes in samples from acute and chronic endodontic infections and after treatment. Archives of oral biology. 2013;58(9):1123-8.

.

شناسایی ژنهای مقاوم به سیپروفلوکساسین در باکتری انتروکوک فکالیس جدا شده از نمونه های  کلینیکی عفونت های اندودونتیک در بیماران شهر زاهدان در سال 1395

اینجانب........... موافقت می‌نمایم که به عنوان یک فرد مورد مطالعه در پژوهش ' شناسایی ژنهای مقاوم به سیپروفلوکساسین در باکتری انتروکوک فکالیس جدا شده از نمونه های  کلینیکی عفونت های اندودونتیک در بیماران شهر زاهدان در سال 1395 ' به سرپرستی آثای دکتر صابری شرکت نمایم. در این پژوهش درمان ریشه دندان این جانب بدون هرگونه تغییر در مسیر درمان به شرحی که توسط سرپرست پژوهش به طور شفاهی توضیح داده شده صورت می‌گیرد. کلیه اطلاعات مربوط به این جانب محرمانه باقی مانده و در صورت تمایل خود هر زمان که بخواهم می‌توانم به همکاری خود خاتمه دهم. در صورت تمایل نتایج به اطلاع من خواهد رسید.

جنسیت بیمار؟
سن بیمار؟
آیا بیمار، بیماری سیستمیک دارد؟
شماره ی دندان و فک درگیر؟
آیا بیمار با درد مراجعه کرده است؟
وضعیت بیماری پالپ دندان؟
وضعیت بیماری پری اپیکال دندان؟
آیا اپکس ریشه دندان بسته است؟
آیا بیمار در سه ماه اخیر داروی ایمونو ساپرسیو مصرف کرده است؟
آیا بیمار در ه ماه اخیر آنتی بیوتیک مصرف کرده است؟
ویژگی خاص رادیوگرافیکِ دندانِ مبتلا؟