بررسی فنوتیپی مقاومت به آمینوگلیکوزیدها و ردیابی ژنهای (ArmA-RmtC) 16S rRNA methylase و a , ACC(6)-Ib ACC(3)-II در سویه های کلبسیلاپنومونیه جداشده از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان های آموزشی شهر زاهدان

کلبسیلاپنومونیه یکی از7 گونه موجود در جنس کلبسیلا از تیره کلبسیله و از خانواده انتروباکتریاسه می باشد. این باکتری یکی از شایع ترین پاتوژن های فرصت طلب گرم منفی و یکی از عوامل شایع عفونت های بیمارستانی است که دارای رابطه ژنتیکی نسبتا نزدیکی با سایر جنس های این خانواده نظیر اشرشیاکلی، سالمونلا، شیگلا و یرسینیا  می باشد(1, 2) . این ارگانیسمها جزیی از میکروفلورطبیعی بدن انسان را تشکیل می دهند و حدود یک سوم افراد، ناقل روده ای این میکروب هستند (3). از نظر بالینی سویه کلبسیلاپنومونیه به طور وسیعی در بیماران بستری در بیمارستانها، کلونیزه می گردد و در بیماران که دارای نقص سیستم ایمنی هستند مانند بیماران دیابتی و یا بیماران دارای نقص ایمنی اکتسابی و افراد مسن و کودکان بیشتر مشاهده می شود. کلبسیلا پنومونیه باعث ایجاد انواعی ازعفونت ها در افراد مختلف به ویژه نوزادان و بزرگسالان می شود که می توان به عفونت های پنومونی، سپتی سمی، اسهال، آبسه در کبد، اندوفتالمیت، مننژیت، و باکتریمی اشاره نمود (4). طبق آمار هر سال حدود 4 میلیون نوزاد بدلیل عفونت های پنومونی، سپتی سمی، اسهال و مننژیت فوت می کنند که بنظر می رسد نوزادان بدلیل نداشتن سیستم ایمنی کامل بیشتر در معرض خطر می باشند.این باکتری عامل 16 - 7 درصد عفونت های مجاری ادراری بوده و پس از اشریشیاکلی دومین عامل باکتریمی بیمارستانی ناشی از باکتری های گرم منفی است و بعد از سودوموناس آئروژینوزا دومین عامل ایجاد باکتریمی در افراد دچار سوختگی می باشد(5). عفونت های بیمارستانی به عنوان یکی از مشکلات عمده بهداشتی و درمانی جامعه مطرع می باشد، بطوریکه بیماران را در بیمارستان های سراسر جهان تحت تاثیر قرار می دهد و هزینه های درمانی فراوانی بر کشور تحمیل می کند، از این رو سازمان بهداشت جهانی سال 2011 را سال مقاومت آنتی بیوتیکی نامگذاری کرد(6). استفاده مداوم از آنتی بیوتیک ها و فشار انتخابی ناشی از این عوامل باعث افزایش مقاومت آنتی بیوتیکی  در بین ایزوله های بیمارستانی، بویژه کلبسیلاپنومونیه گردیده است و گزینه های درمانی را برای درمان عفونت های ایجاد شده بوسیله این پاتوژن های فرصت طلب محدودکرده است(7). این باکتری ها به طور فزاینده ای مقاومت همزمان نسبت به آنتی بیوتیک های بتالاکتام، کینولون ها و آمینوگلیکوزیدها دارد و این عوامل مقاومت، بر روی پلاسمید وجود دارند که می توانند بوسیله کونژوگاسیون به دیگر سویه ها نیز انتقال یابند(8).  ESBLها گروهی از آنزیم ها  شامل (CTX-TEM-SHV) هستند که از طریق هیدرولیز حلقه بتالاکتام باعث غیرفعال شدن آنتی بیوتیک های بتالاکتام می شوند و سویه های مقاوم به درمان ایجاد می کنند(9). مکانیسم مقاومت به فلوئوروکینولونها با واسطه پلاسمید  qnr شامل (qnrA-qnrB-qnrS-qnrD)  می باشد  که باعث کد کردن پروتئینی می شود که موجب محافظت DNAgyrase در برابر فلوئوروکینولونها می گردد(10). مقاومت به آمینوگلیکوزیدها در پاتوژن های بیمارستانی زیاد گزارش شده است( درحدود-50  20 درصد ).در حال حاضر این مقاومت در سویه های کلبسیلاپنومونیه و سودوموناس به حدود 70 درصد می رسد. سه مکانیسم اصلی می تواند باعث ایجاد مقاومت در آمینوگلیکوزیدها شود. اول، تغییراتی که در انتقال فعال و انتشار غیر فعال ایجاد می کند که دارو دیگر قادر به نفوذ در دیواره سلول باکتری و اتصال به ریبوزوم نیست. دوم، موتاسیون کروموزومی که باعث می شود دارو نتواند به رسپتور خود روی زیرواحد 30s ریبوزومی باکتریایی متصل شود.سوم، میکروارگانیسم می تواند آنزیمی تولید کند که آمینوگلیکوزیدها را غیرفعال کند(11). از این رو سویه های مقاوم، توانایی تغییر در ساختار بیوشیمیایی آمینوگلیکوزیدها را توسط آنزیم های تغییر دهنده آمینوگلیکوزیدها (Aminoglycosides Modifying Enzymes)  یا AMEs) ( دارا هستند. AMEs ها به سه خانواده  آنزیمی شامل : 1- N- استیل ترانسفرازها ) (ACC که توانایی استیلاسیون یک گروه آمینو  را دارد، 2- O- نوکلئوتیدیل ترانسفرازها ) (ANT که توانایی آدنیلاسیون گروه هیدروکسیل را دارد، 3- O- فسفوترانسفرازها )   (APH که توانایی فسفوریلاسیون گروه هیدروکسیل دارد تقسیم می شوند. سویه های تولیدکننده  AMEs  باعث از بین بردن اثر هم افزایی بین آنتی بیوتیک های آمینوگلیکوزیدی و عوامل ضد دیواره ای مانند بتالاکتام ها  می شوند(12). از بین این سه خانواده آنزیمی  ژن های کلاس ACC  در بین سویه مقاوم  باکتریایی از شیوع بیشتری برخوردار هستند که شامل ) ACC(1)-I , ACC(2)-I , ACC(3)-I , ACC(6)-I ( می باشد. هر کدام از این کلاس های آنزیمی  شامل چند زیر کلاس می باشند که آنزیم رمز شده توسط ژنهایa ACC(6)-Ib , ACC(3)-II  باعث مقاومت به اکثرآمینوگلیکوزیدها از جمله آمیکاسین ، جنتامایسن ، نتیل مایسین و توبرامایسین می شود(13). از دیگر مکانیسم های مقاومت به آمینوگلیکوزیدها بواسطه پلاسمید مربوط به ژنهای خانواده 16S rRNA methylase می باشد ، که عملکرد این ژن ها  از طریق متیله کردن جایگاه فعال آمینوگلیکوزیدها باعث مقاومت به این آنتی بیوتیک ها می شود. آنتی بیوتیک ها آمینوگلیکوزید به جایگاه A  در 16SrRNA از زیرواحدهای 30S ریبوزومی باکتری ها متصل می شود و سبب تداخل در سنتز پروتئین و باعث مرگ باکتری می شود(15) و باعث مقاومت سویه های  باکتریها به آمینوگلیکوزیدها از جمله جنتامایسین، توبرامایسین و آمیکاسین می شود(14). 10نوع ژن 16SrRNAmethylase شامل  ,ArmA ,RmtA ,RmtB ,RmtC ,RmtD RmtH ,RmtG ,Rmtf ,RmtE ,NpmA در باسیل های گرم منفی مانند سودوموناس آئروژینوزا، سراشیامارسنس، کلبسیلاپنومونیه، پروتئوس میرابلیس، اسینتوباکتربومانی و اشریشیاکلی شناسایی شده است که این ژن ها بروی پلاسمید قرار دارند و سریعا باعث انتقال ژن مقاومت به سایر باکتری ها از جمله باکتری های گرم منفی شده و ارگانیسم ها را نسبت به درمان مقاوم می کند(11).  باتوجه به مطالعات انجام شده از بین این ژن ها ArmA ، ,RmtC در سویه های کلبسیلاپنومونیه مقاوم به آمینوگلیکوزیدها حاوی آمیکاسین، جنتامایسین و توبرامایسین از شیوع بالاتری حدود 30-50 برخوردار است. (15). مقاومت به آمینوگلیکوزید ها از قبیل جنتامایسین و توبرامایسین منجر به کاهش اثر درمانی این نوع آنتی بیوتیک در سویه های مقاوم می شود(16). بنابراین در این مطالعه  پس از جمع آوری نمونه های کلبسیلاپنومونیه و انجام تست های افتراقی میکروب شناسی و بررسی مقاومت آنتی بیوتیکی به روش دیسک دیفیوژن بوسیله آنتی بیوتیک های جنتامایسین، آمیکاسین و توبرامایسین،کانامایسین و نتیل مایسین انجام می گیرد و برای انجام MIC از  نوارهای استریپ E.test آمیکاسین، جنتامایسین و توبرامایسین استفاده می کنیم. روش فنوتیپی دارای معایبی می باشد چون در آزمایشگاه های امروزه برای بررسی روش فنوتیپی از دیسک دیفیوژن استفاده می شود و MIC در اکثریت آزمایشگاه ها انجام نمی شود و همچنین روش فنوتیپی در  تعیین مقاومت آنتی بیوتیکی نقش دارد ولی در شناسایی نوع ژن های دخیل در مقاومت نقشی ندارد. بنابراین برای شناسایی  ژن ها  بررسی ژنوتیپی ایزوله ها استخراج DNA پلاسمیدی با روش مولکولی multiplex PCR  صورت خواهد گرفت.

در مطالعه Ling-Ma و همکارانش برروی کلبسیلاپنومونیه درسال 2007 در تایوان انجام شد، سو یه های کلبسیلا پنومونیه دارای  مقاومت به آمیکاسیون، جنتامایسین و توبرامایسین بوده است که  85%  سویه حاوی ژن armA و rmtB بودند که %44 سویه حاوی ژن armA و 37% سویه حاوی ژن  rmtBویک سویه حاوی هردو ژن armA و rmtB ، و %3 سویه حاوی RmtB و aac(6`)-ll  بودند(17).

درمطالعه Y.Zhou و همکارانش برروی کلبسیلاپنومونیه درسال2010  چین انجام گرفت، سویه های کلبسیلاپنومونیه دارای مقاومت به آمیکاسین و جنتامایسین بودند و %67 سویه ها حاوی ژن armA و %30 سویه ها حاوی ژن rmtB بودند(18).

در مطالعه Yang و همکارانش برروی کلبسیلاپنومونیه درسال2011 درچین انجام گرفت. همه سویه ها به سفوتاکسیم، سیپروفلوکساسین و آمیکاسین مقاوم بودند. که %58.2 سویه ها حاوی ژن ArmA و %40 سویه ها حاوی ژن RmtB بودند(19).

در مطالعه Kang و همکارانش برروی کلبسیلا پنومونیه درسال 2008در کره انجام شد 92% سویه ها حاوی ژن های ArmA و RmtB بودند و6.5% سویه هامقاوم به انتی بیوتیک امیکاسیون بودند(20).

در مطالعهThomas  وهمکارانش که برای تشخیص مقاومت به آمینوگلیکوزید ها در سویه های کلبسیلا پنومونیه درسال 2008 دربوستون انجام شد و اکثر سویه ها مقاومت به امیکاسین و جنتامایسین داشتند که 2 سویه حاوی ژن ArmAو یک سویه حاوی RmtB و دوسویه حاوی ژن RmtD  بودند(21).

درمطالعه اشرفیان در سال92-91در تهران انجام گرفت آنتی بیوتیک های کلستین، فسفومایسین و تیجیسیکلین بهترین اثر رت دتشته و سایر آنتی بیوتیک ها جنتامایسین و امیکاسین مقاوم بودند که از این بین 13.7%  حاوی ژن ArmA و 1.8%  حاوی ژن RmtC را داشتند(22).

در مطالعه رستمی و همکاران در سال90-89 انجام گرفت در سویه های مقاوم به آمینوگلیکوزید های آمیکاسین، جنتامایسین و توبرامایسین حدود 43.8% حاوی ژن ACC6 و 34.2% حاوی ژن ACC3 بود(23).

بنابراین باتوجه به شیوع سویه های کلبسیلاپنومونیه مقاوم به آمینوگلیکوزیدها حاوی ژن های 16SrRNA methylase(ArmA-RmtC) و ACC(6)-Ib,ACC(3)-IIa  و فراوانی این ژن ها در سویه های مقاوم به آمینوگلیکوزیدها در جوامع مختلف و فقدان آمار کافی و مناسب در در منطقه زاهدان پرداختن به آن ضروری به نظر می رسد. و باتوجه به نقصان روش های فنوتیپی برانیم تا با انجام این پروژه اقدام به مقایسه روش فنوتیپی و ژنوتیپی نماییم.  بنابراین این مطالعه با هدف بررسی فنوتیپی مقاومت به آمینوگلیکوزیدها و ردیابی ژنهای  16SrRNAmethylase(ArmA-RmtC)  و ACC(6)-Ib -  ACC(3)-IIa انجام خواهد گرفت.

.

تعیین فنوتیپی مقاومت به آمینوگلیکوزیدها و ردیابی ژنهای  16S rRNA methylase(ArmA-RmtC)  و   ACC(6)-Ib -  ACC(3)-IIa در سویه های کلبسیلاپنومونیه جداشده از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان های  آموزشی شهر زاهدان .

1. تعیین فراوانی سویه های کلبسیلاپنومونیه مقاوم به آمینوگلیکوزیدها جداشده از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان های آموزشی شهر زاهدان .
2. تعیین فراوانی سویه های کلبسیلاپنومونیه مقاوم به آمینوگلیکوزیدها به روش آنتی بیوگرام از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان های آموزشی شهر زاهدان به روش فنوتیپی.
3. تعیین حداقل غلظت ممانعت کننده از رشد(E-test)MIC  به آمینوگلیکوزیدهای آمیکاسین، جنتامایسن و توبرامایسین در سویه های کلبسیلاپنومونیه جدا شده از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان شهر زاهدان.
4. -تعیین فراوانی ژن های ArmA-RmtC,   در سویه های کلبسیلاپنومونیه مقاوم به آمینوگلیکوزیدها جداشده از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان های شهر زاهدان به روش ژنوتیپی.
5. تعیین فراوانی ژن های ACC(6)-Ib,ACC(3)-IIa در سویه های کلبسیلا پنومونیه مقاوم به آمینوگلیکوزیدها جداشده از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان های آموزشی شهر زاهدان به روش ژنوتیپی.
6. -تعیین توالی ژن های a ACC(6)-Ib, ACC(3)-II با استفاده از روش توالی نوکلئوتیدی (sequencing) ژن های دخیل در بروز مقاومت.
7. تعیین توالی ژن های 16SrRNAmethylase با استفاده ازروش توالی نوکلئوتیدی(sequencing) ژن های دخیل در بروز مقاومت.

مرکز تحقیقات بیماری های عفونی-گرمسیری دانشگاه علوم پزشکی زاهدان

PCR: به روش ازدیاد مقادیر جزیی DNA تا حد مشاهده آنها توسط روش های ساده و رایج آزمایشگاهی اطلاق می شود.

16S rRNA methylase: ژنهای تولید کننده آنها بر روی پلاسمید قرار دارد  و باعث متیله کردن جایگاه فعال آمینوگلیکوزیدها می شوند. و سویه های مقاوم باکتریها را قادر به مقاومت به آمینوگلیکوزیدها می کنند.

ژنهای ACC : آنزیم های تغییردهنده آمینوگلیکوزیدها که توانایی تغییر در ساختار بیوشیمیایی آمینوگلیکوزیدها دارا هستند توسط باکتریها تولید می شوند و توانایی استیلاسیون یک گروه آمینو دارند.

مقطعی-توصیفی

بیماران مراجعه کننده به بیمارستان های آموزشی  شهر زاهدان.

براساس مطالعه ای که توسط  Kang در کره انجام گرفت از نمونه کلبسیلاپنومونیه دارای مقاومت به آمینوگلیکوزید، 92 درصد دارای ژن های 16S rRNA methylase بودند. لذا از فرمول زیر تعداد حجم نمونه را بررسی می کنیم:

a=0.05      Z=1.96            

P=0.92      d=0.05

n=115

در این پژوهش نمونه های بالینی(خون،ادرار،مدفوع،خلط...)از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان های آموزشی شهر زاهدان با استفاده از روش نمونه گیری آسان یا در دسترس جمع آوری خواهد شد و پس از انتقال به آزمایشگاه میکروب شناسی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهر زاهدان، شناسایی آنها با روشهای استاندارد و افتراقی میکروب شناسی انجام می شود.

کلبسیلا پنومونیه براساس تستهای مرسوم میکروب شناسی، بررسی حساسیت یا مقاومت آنتی بیوتیکی با اندازه گیری قطر هاله عدم رشد، به روش دیسک دیفیوژن انجام می شود. MIC  به روش E.test بوسیله نوارهای استریپ های انجام می گیرد. استخراج پلاسمید های سویه های مقاوم براساس کیت انجام می گیرد، شناسایی ژن های  ArmA -RmtC,ACC(6)-Ib,ACC(3)-IIa  با استفاده از روش مولتی پلکس PCR  صورت می گیرد. و برای تعیین جهش های احتمالی در ژن های فوق، شناسایی و تایید دقیق نوع آنزیم براساس روشSequencing انجام خواهد شد.

1. ابتدا ایزوله های مشکوک به کلبسیلا پنومونیه از بیمارستان های آموزشی شهر زاهدان جمع آوریمی شود، سپس نمونه های جمع آوری شده را برروی محیط مک کانکی آگار کشت داده شده و به مدت 24 ساعت در دمای 37درجه سانتی گراد نگهداری می شوند.بعد از انکوباسیون از کلنی های مشکوک لام تهیه کرده و در صورت دیدن باسیل های گرم منفی ، کار های تشخیصی بوسیله تست های مرسوم آزمایشگاهی شامل رنگ آمیزی گرم، تست سیترات ، اکسیداز ، اوره آز، واکنش های IMVIC ، دکربوکسیلازها و کشت در محیط های TSI-SIM-MR-VP انجام می گیرد. پس از شناسایی سویه های کلبسیلا پنومونیه آنتی بیوگرام توسط دیسک های آنتی بیوتیکی آمیکاسین، جنتامایسین، توبرامایسین، نتیل مایسین و کانامایسین صورت می گیرد وسپس MIC به روش E.test بوسیله نوارهای استریپ های صورت می گیرد تا سویه های مقاوم شناسایی شود. سپس برای نگهداری کلنی های کلبسیلاپنومونیه محیط حاوی 85 %برین هارت براث + 15 %گلیسرول درست می کنیم از این محیط نگهدارنده بمقدار 1 تا 1.5 میلی لیتر در میکروتیوب های 1.5 سی سی استریل اضافه کرده و سپس از کلنی های کلبسیلاپنومونیه به محیط نگهدارنده اضافه می کنیم. در مرحله آخر میکروتیوب ها داخل فریزر -20 درجه سانتی گراد قرار می دهیم تا برای مراحل بعدی آزمایشات از این سویه ها استفاده شود.

2. بررسی الگو مقاومت دارویی:

با استفاده از استرپ های E.test حاوی آنتی بیوتیک های آمیکاسین، جنتامایسین و توبرامایسین حداقل غلظت ممانعت کننده دارویی سویه های مقاوم باکتریایی را اندازه می گیریم. از سویه به عنوان سویه اشرشیاکلی ATCC 25922کنترل استفاده خواهد شد.

استخراج پلاسمیدها سویه های مقاوم  براساس کیت انجام می گیرد. شناسایی ژن های(ArmA-RmtC) ACC(6)-Ib,ACC(3)-IIa- با استفاده از روش multiplex PCR صورت می گیرد. برای تعیین جهش های احتمالی در ژن های فوق، روش Sequencing انجام خواهد شد. که به شرکت تکاپوزیست ارسال و نتایج تعیین توالی با نرم افزار BLAST مورد بررسی قرار خواهد گرفت. ازسویه کلبسیلاپنومونیه  ATCC 700603   به عنوان سویه کنترل کیفی استفاده خواهد شد.

مقاومت دارویی سویه های جداشده نسبت به آنتی بیوتیک های(کاربنی سیلین (100 )، تیجیسیکلین(35 )،آمیکاسین(30 )، جنتامایسین (10 )، سفتریاکسون (30 )، نتیل مایسین (30 )، توبرامایسین (10 )، سیپروفلوکساسین (5 )، سفپیم (30 ) ، کانامایسین(30µg) با تست دیسک دیفیوژن(Disk Diffusion) به روش کربی- بایر براساس پروتکل CLSI تعیین ونتایج پس از 18 ساعت با اندازه گیری قطر هاله عدم رشد و مقایسه با جداول در دسترس خوانده و ثبت می شود. در این روش از سویه اشرشیاکلی ATCC 25922 به عنوان سویه کنترل استفاده خواهد شد.

تعیین حداقل غلظت ممانعت دارویی(MIC) : :

برای توصیف داده های کیفی از جداول توزیع فراوانی (مطلق و نسبی) و برای توصیف داده های کمی از شاخص های مرکزی و پراکندگی استفاده خواهد شد.

راهنمای عمومی اخلاق در پژوهشهای علوم پزشکی

دارای آزمودنی انسانی  در جمهوری اسلامی ایران

1-         هدف اصلی هر پژوهشباید ارتقای سلامت انسانها توأم با رعایت کرامت و حقوق ایشان باشد.

2-         در پژوهش بر آزمودنی انسانی، سلامت و ایمنی فرد فرد آزمودنی‎ها در طول و بعد از اجرای پژوهش، بر تمامی مصالح دیگر اولویت دارد. هر پژوهشی که بر روی آزمودنی انسانی انجام میگیرد، باید توسط افرادی طراحی و اجرا شود که تخصص و مهارت بالینی لازم و مرتبط را داشته باشند. در کارآزماییهای بالینی  بر روی بیماران یا داوطلبهای سالم نظارت پزشک دارای مهارت و دانش متناسب الزامی است.

3-         پژوهش بر انسان فقط در صورتی توجیهپذیر است که منافع بالقوهی آن برای هر فرد آزمودنی بیشتر از خطرهای  آن باشد. در پژوهشهای دارای ماهیت غیر درمانی، سطح آسیبی که آزمودنی در معرض آن قرار میگیرد نباید بیشتر از آنچه باشد که مردم عادی در زندگی روزمرهی خود با آن مواجه میشوند. حصول اطمینان از این امر برعهدهی طراحان، مجریان و همکاران پژوهش و تمامی شوراهای بررسی یا پایشکنندهی پژوهش از جمله کمیتهی اخلاق در پژوهش است.

4-         مواردی از قبیل سرعت، سهولت کار، راحتی پژوهشگر، هزینهی پایینتر و/ یا صرفاً عملی بودن آن به هیچ وجه نباید موجب قرار دادن آزمودنی در معرض خطر یا زیان افزوده یا تحمیل هر گونه محدودیت اختیار اضافی به وی شود.

5-         قبل از آغاز هر پژوهش پزشکی ، باید اقدامات  اولیه جهت به حداقل رساندن زیان احتمالی وارده به آزمودنیها و تامین سلامت آنها انجام گیرد.

6-         در کارآزمایی های بالینی دوسوکور  که آزمودنی از ماهیت دارویی یا مداخلهای که برای وی تجویز شده بیاطلاع است، پژوهشگر باید تدابیر لازم جهت کمکرسانی به آزمودنی در صورت لزوم و در شرایط اضطراری را تدارک ببیند.

7-         اگر در حین اجرای پژوهش مشخص شود که خطرات شرکت در این پژوهش برای آزمودنیها بیش از فواید بالقوهی آن است، باید آن پژوهش بلافاصله متوقف شود.

8-         طراحی و اجرای پژوهشهایی که بر روی آزمودنی انسانی انجام میگیرند، باید منطبق با اصول علمی پذیرفته شده بر اساس دانش روز و مبتنی بر مرور کامل منابع علمی موجود و پژوهشهای قبلی آزمایشگاهی، و  در صورت لزوم،  حیوانی مناسب باشد. مطالعات حیوانی باید با رعایت کامل اصول اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی انجام شوند.

9-         در پژوهشهای پزشکی که ممکن است به محیط زیست آسیب برسانند، باید احتیاطهای لازم در جهت حفظ و نگهداری و عدم آسیب رسانی به محیط ریست انجام گیرد.

10-       هر پژوهشی باید بر اساس و منطبق بر یک طرحنامه (پروپوزال) به انجام برسد. در کارآزماییهای بالینی باید علاوه بر طرح نامه، دستورالعمل (پروتکل) نیز تهیه و ارائه شود. طرحنامه و دستورالعمل باید شامل تمامی اجزای ضروری باشد. از جمله بخش ملاحظات اخلاقی، اطلاعات مربوط به بودجه، حمایت کنندهها، وابستگیهای سازمانی، موارد تعارض منافع بالقوهی دیگر، مشوقهای شرکت کنندگان، پیش بینی درمان و یا جبران خسارت افراد آسیب دیده در پژوهش .در مواردی که لازم است رضایتنامهی آگاهانه بهصورت کتبی اخذ شود، فرم رضایتنامه باید تدوین و به طرحنامه پیوست شده باشد. پیش از تصویب یا تأیید طرحنامه از سوی کمیتهی مستقل اخلاق در پژوهش، نباید اجرای پژوهش شروع شود.

11-       کمیتهی اخلاق در پژوهش علاوه بر بررسی و تصویب طرحنامه و دستورالعمل، این حق را دارد که طرحها را در حین و بعد از اجرا را از نظر رعایت ملاحظات اخلاقی مورد پایش قرار دهد. اطلاعات و مدارکی که برای پایش از سوی کمیتهی اخلاق درخواست میشود، باید از سوی پژوهشگران در اختیار این کمیته گذاشته شود.   

12-       انتخاب آزمودنیهای بالقوه از میان جمعیت بیماران یا هر گروه جمعیتی دیگر، باید منصفانه باشد، بهنحوی که توزیع بارها (خطرات یا هزینهها) و منافع شرکت در پژوهش، در آن جمعیت و کل جامعه، تبعیضآمیز نباشد.

13-       کسب رضایت آگاهانه و آزادانه در هر پژوهشی که بر روی آزمودنی انسانی اجرا میشود، الزامی است. این رضایت باید به شکل کتبی باشد. در مواردی که اخذ رضایت آگاهانهی کتبی غیر ممکن یا قابل صرفنظر باشد، باید موضوع با ذکر دلایل به کمیتهی اخلاق منتقل شود. در صورت تأیید کمیتهی اخلاق، اخذ رضایت کتبی قابل تعویق یا تبدیل به رضایت شفاهی یا ضمنی خواهد بود.

14-       اگر در طول اجرای پژوهش تغییری در نحوه اجرای پژوهش داده شود یا اطلاعات جدیدی به دست آید که احتمال داشته باشد که بر تصمیم آزمودنی مبنی بر ادامهی شرکت در پژوهش تاثیر گذار باشد، باید موضوع به اطلاع کمیتهی اخلاق رسانده شود و در صورت موافقت کمیته با ادامهی پژوهش، مراتب به اطلاع آزمودنی رسانده شود و رضایت آگاهانه مجددا اخذ گردد.

15-       پژوهشگر باید از آگاهانه بودن رضایت اخذشده اطمینان حاصل کند. برای این منظور، در تمامی پژوهشهای پزشکی، اعم از درمانی و غیردرمانی، پژوهشگر موظف است فرد در نظر گرفته شده بهعنوان آزمودنی را از تمامی اطلاعاتی که میتوانند در تصمیمگیری او مؤثر باشند، بهنحو مناسبی آگاه سازد. این اطلاعات مشتملند بر: عنوان و اهداف پژوهش، طول مدت پژوهش، روشی که قرار است بهکار گرفته شود (شامل احتمال تخصیص تصادفی به گروهمورد یا شاهد)، منابع تأمین بودجه، هر گونه تعارض منافع احتمالی، وابستگی  سازمانی پژوهشگر، و فواید و زیانهایی که انتظار میرود مطالعه در بر داشته باشد. همچنین، هر آزمودنی باید بداند که میتواند هر لحظه که بخواهد از مطالعه خارج شود و باید دربارهی خطرات و زیانهای بالقوهی ناشی از ترک زودرس پژوهش آگاه و پشتیبانی شود. پژوهشگر همچنین باید به تمامی سؤالات و دغدغههای این افراد، با حوصله و دقت پاسخ بدهد. این موارد باید در رضایتنامهی آگاهانه منعکس شود.

16-       پژوهشگر باید از آزادانه بودن رضایت اخذ شده اطمینان حاصل کند. رفتارهایی که به هر نحوی متضمن تهدید، اغوا، فریب و یا اجبار باشد موجب ابطال رضایت آزمودنی میشود. به فرد باید فرصت کافی برای مشاوره با افرادی که مایل باشد – نظیر اعضای فامیل یا پزشک خانواده - داده شود. همچنین، در پژوهشهایی که پژوهشگر مقام سازمانی بالاتری نسبت به آزمودنی  داشته باشد، دلایل این شیوهی جذب آزمودنی، باید توسط کمیتهی اخلاق  تأیید شود، در این موارد شخص ثالث و معتمدی باید رضایت را دریافت کند.

17-       پژوهشگر ارشد مسؤول مستقیم ارائهی اطلاعات کافی و به زبان قابل فهم برای آزمودنی ، اطمینان از درک اطلاعات ارائه شده، و اخذ رضایت آگاهانه است. در مواردی که بنا بهدلیلی، نظیر زیاد بودن تعداد آزمودنیها، این اطلاعرسانی از طریق شخص دیگری انجام میگیرد، این پژوهشگر ارشد است که مسؤول انتخاب فردی آگاه و مناسب برای این کار و حصول اطمینان از تأمین شرایط مذکور در این بند است.

18-       در پژوهشهایی که از مواد بدنی (شامل بافتها و مایعات بدن انسان)  یا دادههایی استفاده میشود که هویت صاحبان آنها معلوم یا قابل کشف و ردیابی است، باید برای جمعآوری، تحلیل، ذخیره‎سازی و /یا استفادهی مجدد از آنها رضایت آگاهانه گرفته شود. در مواردی که اخذ رضایت غیرممکن باشد یا اعتبار پژوهش را خدشهدار کند، میتوان در صورت بررسی مورد و تصویب کمیتهی اخلاق ، از دادهها یا مواد بدنی ذخیره شده، بدون اخذ رضایت آگاهانه استفاده کرد.

19-       عدم قبول شرکت در پژوهش، یا ادامه ندادن به همکاری، نباید هیچگونه تأثیری بر خدمات درمانی که در همان مؤسسه – نظیر بیمارستان – به فرد ارائه میشود، داشته باشد. این موضوع باید در فرایند اخذ رضایت آگاهانه، به آزمودنی اطلاع داده شود.

20-       در مواردی که آگاه کردن آزمودنی دربارهی جنبهای از پژوهش باعث کاهش اعتبار پژوهش می شود، ضرورت اطلاعرسانی ناکامل از طرف پژوهشگر باید توسط کمیتهی اخلاق تأیید شود. بعد از رفع عامل این محدودیت، باید اطلاعرسانی کامل به آزمودنی انجام گیرد.

21-       برخی از افراد یا گروههایی از مردم، نظیر ناتوانان ذهنی، کودکان، جنین و نوزاد، بیماران اورژانسی، یا زندانیانکه ممکن است بهعنوان آزمودنی در پژوهش شرکت کنند، نمیتوانند برای دادن رضایت، آگاهی یا آزادی لازم را داشته باشند. این افراد یا گروهها آسیبپذیر دانسته میشوند و باید مورد حفاظت ویژه قرار گیرند.

22-       از گروههای آسیبپذیر هیچگاه نباید (به دلایلی چون سهولت دسترسی ) به عناون آزمودنی ترجیحی استفاده شود. پژوهش پزشکی با استفاده از گروهها یا جوامع آسیبپذیر تنها در صورتی موجه است که با هدف پاسخگویی به نیازهای سلامت و اولویتهای همان گروه یا جامعه طراحی و اجرا شود و احتمال معقولی وجود داشته باشد که همان گروه یا جامعه از نتایج آن پژوهش سود خواهد برد.

23-       در پژوهش بر روی گروههای آسیبپذیر، وظیفهی اخذ رضایت آگاهانه مرتفع نمیشود. در مورد افرادی که سرپرست قانونی دارند، پژوهشگر موظف است که علاوه بر اخذ رضایت آگاهانه از سرپرست قانونی، متناسب با ظرفیت خود فرد، از وی رضایت آگاهانه اخذ کند. در هر حال، باید به امتناع این افراد از شرکت در پژوهش احترام گذاشته شود.

24-       اگر در حین اجرای پژوهش، آزمودنی دارای ظرفیت، ظرفیت خود را از دست بدهد یا آزمودنی فاقد ظرفیت، واجد ظرفیت شود، باید با توجه به تغییر حاصله، رضایت آگاهانه برای ادامهی پژوهش از سرپرست قانونی یا خود فرد اخذ شود. 

25-       پژوهشگر مسؤول رعایت اصل رازداری و حفظ اسرار آزمودنیها و اتخاذ تدابیر مناسب برای جلوگیری از انتشار آن است. همچنین، پژوهشگر موظف است که از رعایت حریم خصوصی آزمودنیها در طول پژوهش اطمینان حاصل کند. هرگونه انتشار دادهها یا اطلاعات بهدست آمده از بیماران باید بر اساس رضایت آگاهانه انجام گیرد.

26-       هر نوع آسیب یا خسارت ناشی از شرکت در پژوهش باید بر طبق قوانین مصوب جبران خسارت شود. این امر باید در هنگام طراحی پژوهش لحاظ شده باشد. نحوهی تحقق این امر ترجیحاً بهصورت پوشش بیمهای نامشروط باشد.

27-       در پایان پژوهش، هر فردی که بهعنوان آزمودنی به آن مطالعه وارد شده است، این حق را دارد که دربارهی نتایج مطالعه آگاه شود و از مداخلات یا روشهایی که سودمندیشان در آن مطالعه نشان داده شده است، بهرهمند شود.

28-       پژوهشگران موظفند که نتایج پژوهشهای خود را صادقانه ، دقیق، و کامل منتشر کنند. نتایج، اعم از منفی یا مثبت، و نیز منابع تأمین بودجه، وابستگی  سازمانی، و تعارض منافع – در صورت وجود – باید کاملاً آشکارسازی شوند. پژوهشگران نباید در هنگام عقد قرارداد انجام پژوهش، هیچ  گونه شرطی را مبنی بر حذف یا عدم انتشار یافتههایی که از نظر حمایت کنندهی پژوهش  مطلوب نیست، بپذیرند.

29-       نحوهی گزارش نتایج پژوهش باید ضامن حقوق مادی و معنوی تمامی اشخاص مرتبط با پژوهش، از جمله خود پژوهشگر یا پژوهشگران، آزمودنیها و مؤسسهی حمایت کنندهی  پژوهش باشد.

30-       گزارشها و مقالات حاصل از پژوهشهایی که مفاد این راهنما را نقض کردهاند، نباید برای انتشار پذیرفته شوند.

31-       روش پژوهش نباید با ارزشهای احتماعی، فرهنگی و دینی  جامعه در تناقض باشد

راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی در جمهوری اسلامی ایران

1- پژوهشگر باید به این امر مهم توجه داشته باشد که بافت‌ها و اعضای مورد استفاده، دارای منشأ انسانی‌اند و کرامت انسانی اقتضا می‌کند که جمع‌آوری، نگه‌داری، استفاده و نابودسازی آن‌ها توأم با رعایت ملاحظات و شؤون مرتبط باشد.

2- از اجزای بدنی دارای منشأ انسانی باید تنها در پژوهش‌هایی استفاده شود که اهداف ارزشمندی را در راستای مبارزه با بیماری‌ها و ارتقای سلامت انسان‌ها دنبال می‌کنند.

3- تمامی پژوهش‌ها بر روی عضو و بافت انسانی، پیش از اجرا، باید مورد تأیید کمیته‌ی اخلاق در پژوهش مرتبط قرار گیرد. کمیته‌ی اخلاق در پژوهش حق دارد که در تمامی مراحل پژوهش بر آن نظارت داشته باشد. پژوهشگران باید در این زمینه با کمیته‌ی اخلاق در پژوهش همکاری کنند.

4- رضایت آگاهانه‌ی فرد دهنده‌ی عضو یا بافت، یا جانشین قانونی او، شرط اساسی در تأیید اخلاقی هر پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی است. رضایت‌نامه باید با رعایت تمامی اصول مرتبط تهیه و هنگام ارسال طرح‌نامه برای تصویب، به آن پیوست شده باشد.

5- در مواردی که اخذ رضایت آگاهانه از دهنده‌ی نمونه‌ی ذخیره‌شده یا جانشین قانونی او امکان‌پذیر نباشد، به‌شرط وجود رضایت کلی اولیه بر استفاده‌ی پژوهشی، در صورت تأیید کمیته‌ی اخلاق در پژوهش می‌توان از آن نمونه برای پژوهش استفاده کرد. در چنین مواردی باید از نمونه‌هایی استفاده شود که به ‌نحو برگشت‌ناپذیر بی‌نام ‌شده باشد. ‌

6- تمامی اطلاعاتی که از صاحبان عضو یا بافت مورد پژوهش، جمع‌آوری و ثبت می‌شود، راز حرفه‌ای تلقی می‌‌شود؛ از این ‌رو، تمامی اصول و ملاحظات مربوط به رازداری و حفظ حریم شخصی، باید در مورد آن‌ها مراعات شود.

7- مرکز انجام دهنده‌ی پژوهش بر روی عضو و بافت باید مهارت و امکانات لازم برای حفظ رازداری را داشته باشد؛ در غیر این صورت، اطلاعات باید به شکل بی‌نام و غیرقابل ردیابی ثبت و ذخیره شود.

8- پژوهشگر باید از اعضاء و بافت‌هایی که به منظور پژوهش در اختیار او قرار می‌گیرد استفاده‌ی بهینه کرده، از هدر رفتن آن‌ها جلوگیری کند

9- پژوهشگر موظف است که تمهیدات لازم ایمنی، از جمله آزمون‌های غربالگری و وسایل محافظت‌کننده را برای جلوگیری از انتقال آلودگی از اجزای بدنی مورد استفاده به هر فرد دیگر، اعم از پژوهشگران، آزمودنی‌ها یا سایر افرادی که در فرایند پژوهش با این مواد سروکار خواهند داشت، پیش‌بینی و تأمین کند.

10- پژوهش بر روی عضو و بافت ممکن است به ایجاد روش‌ها و محصولاتی منجر شود که به استفاده‌ی تجاری از آن‌ها بینجامد. حقوق مالکیت معنوی نتایج حاصل از این‌گونه پژوهش‌ها باید مورد تأیید و حمایت قرار گیرد. احتمال استفاده‌ی تجاری از نتایج پژوهش و اشخاصی که احتمالاً از آن منتفع خواهند شد باید در رضایت‌نامه‌آورده شود.

11- زمان، نحوه و میزان اطلاع آزمودنی‌ها از نتایج پژوهش باید در رضایت‌نامه آورده شود. در هر حال، آزمودنی یا نماینده‌ی قانونی او باید به تمامی اطلاعاتی که در طول پژوهش درباره‌ی او به‌دست می‌آید، دسترسی داشته باشد.

12- در صورت کمبود بافت یا عضو، باید استفاده‌های درمانی بر استفاده‌های پژوهشی اولویت داده شود.

مشکل تهیه مواد و امکان طولانی شدن زمان دریافت آنها.

سعی می شودحتی المقدور از مواد و وسایلی استفاده شود که در کشور به صورت روتین موجود است.

کلبسیلاپنومونیه، آمینوگلیکوزیدها، ArmA-RmtC، ACC (6)–Ib , ACC (3) -IIa

1.            Tascini C, Tagliaferri E, Giani T, Leonildi A, Flammini S, Casini B, et al. Synergistic activity of colistin plus rifampin against colistin-resistant KPC-producing Klebsiella pneumoniae. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2013;57(8):3990-3.

2.            Sharif MR, Soltani B, Moravveji A, Erami M, Soltani N. Prevalence and Risk Factors associated with Extended Spectrum Beta Lactamase Producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae Isolates in Hospitalized Patients in Kashan (Iran). Electronic Physician. 2016;8(3):2081.

3.            Li B, Li M, Qu L, Wang M, Guo J. Prevalence and characteristics of extended-spectrum beta-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae isolated from pediatric inpatients with respiratory tract infections at a teaching hospital in China. Scandinavian journal of infectious diseases. 2014;46(3):200-3.

4.            Mirovic V, Tomanovic B, Lepsanovic Z, Jovcic B, Kojic M. Isolation of Klebsiella pneumoniae producing NDM-1 metallo-beta-lactamase from the urine of an outpatient baby boy receiving antibiotic prophylaxis. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2012;56(11):6062-3.

5.            Johnson JG, Spurbeck RR, Sandhu SK, Matson JS. Genome Sequence of Klebsiella pneumoniae Urinary Tract Isolate Top52. Genome announcements. 2014;2(4).

6.            Najjuka CF, Kateete DP, Kajumbula HM, Joloba ML, Essack SY. Antimicrobial susceptibility profiles of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolated from outpatients in urban and rural districts of Uganda. BMC Research Notes. 2016;9(1):1.

7.            Ahn C, Yoon SS, Yong TS, Jeong SH, Lee K. The Resistance Mechanism and Clonal Distribution of Tigecycline-Nonsusceptible Klebsiella pneumoniae Isolates in Korea. Yonsei Medical Journal. 2016;57(3):641-6.

8.            Rafiq Z, Sam N, Vaidyanathan R. Whole genome sequence of Klebsiella pneumoniae U25, a hypermucoviscous, multidrug resistant, biofilm producing isolate from India. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 2016;111(2):144-6.

9.            Shields RK, Clancy CJ, Hao B, Chen L, Press EG, Iovine NM, et al. Effects of Klebsiella pneumoniae Carbapenemase Subtypes, Extended-Spectrum β-Lactamases, and Porin Mutations on the In Vitro Activity of Ceftazidime-Avibactam against Carbapenem-Resistant K. pneumoniae. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2015;59(9):5793-7.

10.          Kaplan E, Sela N, Doron-Faigenboim A, Navon-Venezia S, Jurkevitch E, Cytryn E. Genomic and Functional Characterization of qnr-Encoding Plasmids from Municipal Wastewater Biosolid Klebsiella pneumoniae Isolates. Frontiers in microbiology. 2015;6.

11.          Liang C, Xing B, Yang X, Fu Y, Feng Y, Zhang Y. Molecular epidemiology of aminoglycosides resistance on Klebsiella pneumonia in a hospital in China. International journal of clinical and experimental medicine. 2015;8(1):1381.

12.          Almaghrabi R, Clancy CJ, Doi Y, Hao B, Chen L, Shields RK, et al. Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae strains exhibit diversity in aminoglycoside-modifying enzymes, which exert differing effects on plazomicin and other agents. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2014;58(8):4443-51.

13.          Liu J-H, Deng Y-T, Zeng Z-L, Gao J-H, Chen L, Arakawa Y, et al. Coprevalence of plasmid-mediated quinolone resistance determinants QepA, Qnr, and AAC (6′)-Ib-cr among 16S rRNA methylase RmtB-producing Escherichia coli isolates from pigs. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2008;52(8):2992-3.

14.          Al Sheikh YA, Marie MAM, John J, Krishnappa LG, Dabwab KHM. Prevalence of 16S rRNA methylase genes among β-lactamase-producing Enterobacteriaceae clinical isolates in Saudi Arabia. Libyan Journal of Medicine. 2014;9(1).

15.          Lee H, Yong D, Yum JH, Roh KH, Lee K, Yamane K, et al. Dissemination of 16S rRNA methylase-mediated highly amikacin-resistant isolates of Klebsiella pneumoniae and Acinetobacter baumannii in Korea. Diagnostic microbiology and infectious disease. 2006;56(3):305-12.

16.          Gerding D, Larson T, Hughes R, Weiler M, Shanholtzer C, Peterson L. Aminoglycoside resistance and aminoglycoside usage: ten years of experience in one hospital. Antimicrobial agents and chemotherapy. 1991;35(7):1284-90.

17.          Ma L, Lin C-J, Chen J-H, Fung C-P, Chang F-Y, Lai Y-K, et al. Widespread dissemination of aminoglycoside resistance genes armA and rmtB in Klebsiella pneumoniae isolates in Taiwan producing CTX-M-type extended-spectrum β-lactamases. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2009;53(1):104-11.

18.          Zhou Y, Yu H, Guo Q, Xu X, Ye X, Wu S, et al. Distribution of 16S rRNA methylases among different species of Gram-negative bacilli with high-level resistance to aminoglycosides. European journal of clinical microbiology & infectious diseases. 2010;29(11):1349-53.

19.          Yang J, Ye L, Wang W, Luo Y, Zhang Y, Han L. Diverse prevalence of 16S rRNA methylase genes armA and rmtB amongst clinical multidrug-resistant Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolates. International journal of antimicrobial agents. 2011;38(4):348-51.

20.          Kang HY, Kim J, Seol SY, Lee YC, Lee JC, Cho DT. Characterization of conjugative plasmids carrying antibiotic resistance genes encoding 16S rRNA methylase, extended-spectrum beta-lactamase, and/or plasmid-mediated AmpC beta-lactamase. The Journal of Microbiology. 2009;47(1):68-75.

21.          Fritsche TR, Castanheira M, Miller GH, Jones RN, Armstrong ES. Detection of methyltransferases conferring high-level resistance to aminoglycosides in Enterobacteriaceae from Europe, North America, and Latin America. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2008;52(5):1843-5.

22.اشرفیان فاطمه. تشخیص مولکولی ژن های 16sRNA methylase در سویه های کلبسیلا پنومونیه جدا شده از بیماران بستری شده در بیمارستان های طالقانی و مفید تهران. مجله داشنگاه علوم پزشکی مازندران1392

23-رستمی الهام، نجار پیرایه شهین، سیادت سید داوود، حقی فخری. تشحیص سویه های کلبسیلا پنومونیه تولید کننده آنزیم ACC(6)-Ib و ACC(3)-IIa جدا شده از بیمارستان های شهر تهران با PCR. فصلنامه علوم زیستی دانشگاه آزاد اسلامی واحد زنجان90;4(2).