بررسی واریانت های (T(GSTT1 و (M(GSTM1 ژن گلوتاتیون S-ترانسفراز در کارسینوم سلول سنگفرشی دهان

کارسینوم سلول های سنگفرشی دهان (OSCC)  شایع ترین بدخیمی دهان است که 80-90% تمامی نئوپلاسم های دهان را شامل می شود و وقوع آن در دهه اخیر 50% افزایش یافته است. اگرچه فراوانی سرطان دهان در نقاط مختلف جهان بسیار متفاوت است، پدیرفته شده است که دهان از مناطق شایع بروز سرطان است و حتی در بعضی مناطق مانند جنوب شرق آسیا شایع ترین ناحیه برای بروز بدخیمی است(1). OSCC یک نئوپلاسم بدخیم با منشا اپیتلیوم مطبق سنگفرشی مخاط دهان است و دارای پاتوژنز مولتی فاکتوریال می باشد. عوامل اتیولوژیک و مستعد کننده زیادی برای وقوع این سرطان وجود دارد که مهم ترین آنها مصرف دخانیات، عادت مصرف مشروبات و در معرض اشعه ماوراء بنفش قرار گرفتن( به خصوص در ناحیه لب)، می باشند(1, 2). عوامل دیگر نظیر پاپیلوما ویروس انسانی (HPV)، عفونت کاندیدا، کمبودهای تغذیه ای و استعداد ژنتیک نیز با ایجاد آن مرتبطند(1).

اکثر موارد ابتلا به OSCCs در مراحل انتهایی بیماری و در فاز III و IV تشخیص داده می شوند که منجر به افزایش قابل توجه مرگ و میر وکاهش کیفیت زندگی در بیماران می شود. علیرغم پیشرفت در روش های درمانی، با استفاده از پروتکل های درمانی کنونی ( خارج کردن بافت بدخیم شده، رادیوتراپی و شیمی درمانی است) احتمال زنده ماندن 5 ساله بیماران تنها 53% است. علاوه بر این اغلب بیماران به میزان کمی به درمان پاسخ می دهند و میزان عود بالایی دارند(2).

 آنزیم های متابولیزه کننده کارسینوژن ها شامل دو گروه آنزیم  هستند : آنزیم های  فاز I  که  در سمیت زدایی  کارسینوژن ها و همچنین خنثی کردن آنها و یا تبدیل این مواد به ترکیبات الکتروفیلی که توسط آنزیم های فاز II  سمیت زدایی می شوند، نقش دارند. در فاز I آنزیمی  خانواده سیتوکروم P450 ایفا نقش می کنند. این آنزیم ها کارسینوژن های محیطی را به حدواسط های اپوکسید تبدیل می کند و به دنبال آن آنزیم های فازII مانند گلوتاتیون S-ترانسفراز ها این ترکیبات واسطه را طی فرایند گنژوگه کردن، به مواد محلول در آب تبدیل می کنند که به راحتی از بدن دفع می شود و بدن را از اثرات توکسیک این کارسینوژن ها محافظت می کند(3).

در پستانداران 8 خانواده از GSTs ها شناسایی شده اند، که بر اساس تشابه توالی ژنی و نوع سوبسترا به خانواده های آلفا (GSTa)، مو (GSTM)، تتا (GSTT)، پی (GSTP)، زتا (GSTZ)، سیگما (GSTS)، کاپا (GSTK)، و امگا (GSTO)، تقسیم می شوند. ازین میان پلی مورفیسم های دو ژن GSTT1 و GSTM1 بیشتر از سایر پلی مورفیسم ها مورد بررسی قرار گرفته اند. GSTM1 از دسته  GSTµ ها است که بر روی کروموزوم شماره 1 و در جایگاه 1p13.3 قرار دارد و در سمیت زدایی هیدروکربنهای آروماتیک های حلقوی و سایر موتاژن ها نقش دارد. ژن GSTT1 در جایگاه 22q11.2 قرار دارد و در متابولیسم ذرات کوچک موجود در دود سیگار مانند مونوهالومتان ها و اتیلن اکساید سهیم است(4).

GSTM1 و GSTT1 معمولا به صورت حذف های ژنی بروز می یابند. در افرادی که حذف هموزیگوت در الل های این ژن مشاهده می شود، هیچ محصول کاربردی تولید نمی گردد و فعالیت آنزیمی از دست می رود(5). حذف ژنی در این واریانت ها همراه با افزایش خطر در مواجهه به کارسینوژن های محیطی است و احتمال به وجود آمدن نئوپلاسم بدخیم را افزایش میدهد(6).

در مطالعه Zakiullah و همکارانش در سال 2015 که در  جمعیت پشتو در کشور پاکستان با هدف بررسی ارتباط بین اثر تنوع در ژن های GSTT1، GSTM1 و احتمال بروز سرطان دهان انجام شد، 200 بیمار مبتلا به سرطان دهان و 151 نفر سالم به عنوان شاهد مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد در ژنوتیپ های فاقد عملکرد ژن های GSTT1 و GSTM1 شانس بروز سرطان دهان سه برابر افزایش یافت. همچنین نتایج نشان داد در فرم همزمان حذف یک الل از هر کدام از این واریانت ها نیز شانس سرطان افزایش قابل توجهی می یابد(5).

Kruger و همکارانش در مطالعه ای با هدف بررسی ارتباط پلی مورفیسم GSTM1/GSTT1 و پیشرفت OSCC در سال 2015 با بررسی 100 مورد بیمار مبتلا به کارسینوم سلول های سنگفرشی دهان و 93 مورد سالم انجام دادند به این نتیجه رسیدند که وجود این پلی مورفیسم در افراد سیگاری احتمال پیشرفت سرطان را افزایش می دهد و از آن میتوان برای شناسایی افراد با ریسک بالا پیشرفت سرطان دهان استفاده کرد(6).

در سال 2015 Choudhury و همکارانش در هند به بررسی اثر ترکیبی پلی مورفیسم ژنی در سیتوکروم P450 1A1(CYP1A1) ، گلوتاتیون S-ترانسفراز (GSTs) و سیگار کشیدن و تنباکو جویدنی، بر ریسک ابتلا به سرطان سر و گردن پرداختند. نتایج نشان داد در افراد سیگاری که دارای ژنوتیپ فاقد عملکرد در ژن GSTM1 و GSTT1 و همچنین CYP1A1 TC/CC هستند به میزان معناداری احتمال ابتلا به سرطان سر و گردن افزایش می یابد(3).

Zhang و همکارانش در سال 2011 در چین، مطالعه ای مروری با هدف بررسی ارتباط گلوتاتیون S- ترانسفراز M1(GSTM1) و گلوتاتیون S- ترانسفراز T1(GSTT1) و سرطان دهان طراحی کردند. نتایج این مطالعه نشان داد واریانت فاقد عملکرد  در ژن GSTM1 با احتمال ابتلا به سرطان دهان در نژاد آسیایی مرتبط بود اما در نژاد سفیدپوست ارتباطی مشاهده نشد. در حالیکه ارتباطی با واریانت فاقد عملکرد  در ژن GSTT1  و  ابتلا به سرطان دهان مشاهده نشد(7).

Buch و همکارانش در مطالعه ای مورد- شاهدی که با هدف بررسی ارتباط تنوع در جایگاه ژنی آنزیمهای متابولیک و سرطان های دهان و اوروفارنکس در سال 2008 با حضور 203 بیمار مبتلا به کارسینوم سلول های سنگفرشی و 416 فرد سالم به عنوان گروه کنترل انجام دادند، ارتباط معناداری بین تنوع ژنتیکی درآنزیمهای GSTT1 و GSTM1 و بروز سرطان دهان نیافتند(8).

در مطالعات مختلف ارتباط بین این پلی مورفیسم و احتمال ابتلا به سرطان های مختلف مانند دهان، ریه، مثانه و سینه به اثبات رسیده است(5). با توجه به تنوع ژنتیکی و وجود نتایج ضد و نقیض در جمعیت های مختلف و عدم وجود اطلاعات کافی در خصوص ارتباط عملکرد گلوتاتیون S- ترانسفراز M1(GSTM1) و گلوتاتیون S- ترانسفراز T1(GSTT1) با کارسینومای دهان ، بر آن شدیم تا جایگاه ژنتیکی مورد نظر را در جمعیت این منطقه در نمونه های OSCC موجود در آرشیو بخش پاتولوژی دهان دانشکده دندانپزشکی زاهدان بررسی کرده و آن را با افراد سالم مقایسه کنیم.

1. فراوانی واریانتهای T(GSTT1) ژن گلوتاتیون S-ترانسفراز در کارسینوم سلول سنگفرشی دهان با گروه کنترل متفاوت است.
2. فراوانی واریانتهای M(GSTM1) ژن گلوتاتیون S-ترانسفراز در کارسینوم سلول سنگفرشی دهان با گروه کنترل متفاوت است.

تعیین واریانت های T(GSTT1) و M(GSTM1) ژن گلوتاتیون S-ترانسفراز در کارسینوم سلول سنگفرشی دهان

1. مقایسه واریانتهای T(GSTT1) ژن گلوتاتیون S-ترانسفراز در کارسینوم سلول سنگفرشی دهان با گروه کنترل
2. مقایسه واریانتهای M(GSTM1) ژن گلوتاتیون S-ترانسفراز در کارسینوم سلول سنگفرشی دهان با گروه کنترل

مرکز تحقیقات دندانپزشکی، مرکز تحقیقات ژنتیکی کانسرها

گلوتاتیون s-ترانسفراز ها(GSTs): خانواده ای چند ژنی از آنزیم های متابولیک دخیل در فاز-2 سم زادیی ترکیبات الکتروفیل طیف وسیعی از سموم مانند کارسینوژن ها، داروهای درمانی، سموم محیطی، محصولات استرس های اکسیداتیو، هیدروکربن های آروماتیک سه حلقه ای و بنزوپیرن ها نقش دارند(3).

مورد - شاهدی

بلوک های پارافینی کارسینوم سلول سنگفرشی دهان، در آرشیو بخش پاتولوژی دانشکده دندانپزشکی زاهدان  و نمونه های خون افراد سالم جهت گروه کنترل

معیار خروج: بلوک های پارافینی با  تشخیص کارسینوم سلول سنگفرشی دهان که بافت کافی برای بررسی وجود نداشته باشد، حاوی نکروز و التهاب باشد یا به درستی فیکس نشده باشد.

تمام نمونه های بیوپسی مناسب بخش پاتولوژی دهان دانشکده دندانپزشکی زاهدان است که طی سالهای ۱۳۸۳ تا ۱۳۹3 جمع آوری شده اند که شامل حدودا 40 نمونه OSCC می باشد  و گروه کنترل 50 نمونه ازخون افراد سالم موجود در بانک خون وارد مطالعه خواهد شد.

سرشماری برای گروه مورد و تصادفی ساده برای گروه کنترل

فرم ثبت اطلاعات (ضمیمه شماره۱)

برای بررسی واریانتهای ژنی از نمونه های OSCC بعنوان گروه مورد و از  DNA نمونه های خون افراد سالم موجود در بانک خون از لحاظ سن وجنس با نمونه های OSCC همسان سازی شده اند بعنوان گروه کنترل استفاده می شود. از بلوک پارافینی مربوط به هر نمونه سه برش جداگانه تهیه خواهد شد و در میکروتیوب های ۵/۱ میلی لیتری جهت استخراج DNA به آزمایشگاه فرستاده خواهد شد. DNA نمونه ها توسط کیتهای اختصاصی استخراج شده و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی واریانت های GSTM1(M) و GSTT1(T) در ژن GST با روش PCR  مورد ارزیابی کیفی قرار خواهند گرفت.

داده های بدست آمده از مطالعه با استفاده از آزمون Chi square مورد تحلیل قرار خواهد گرفت. در این راستا از نرم افزار آماری SPSS نسخه 21 استفاده می شود.

جدول- مقایسه واریانت های T(GSTT1) و M(GSTM1) ژن گلوتاتیون S-ترانسفراز در گروه های مورد مطالعه

کدهای اخلاقی پژوهش برروی عضو و بافت انسانی (فصل 4- زیست­بانک­ها): کدهای4-3-2-1. (ضمیمه 2 )

ندارد

کارسینوم سلول سنگفرشی دهان، حذف ژنی، گلوتاتیون S-ترانسفراز

1- Pires FR, Ramos AB, Oliveira JB, Tavares AS, Luz PS, Santos TC. Oral squamous cell carcinoma: clinicopathological features from 346 cases from a single Oral Pathology service during an 8-year period. J Appl Oral Sci. 2013;21(5):460-7.

2- Rivera C, Venegas B. Histological and molecular aspects of oral squamous cell carcinoma (Review). Oncol Lett. 2014;8(1):7-11.

3- Choudhury JH, Singh SA, Kundu S, Choudhury B, Talukdar FR, Srivasta S, et al. Tobacco carcinogen-metabolizing genes CYP1A1, GSTM1, and GSTT1 polymorphisms and their interaction with tobacco exposure influence the risk of head and neck cancer in Northeast Indian population. Tumor biol. 2015;36(8):5773-83.

4- Sharma A, Pandey A, Sardana S, Sehgal A, Sharma JK. Genetic polymorphisms of GSTM1 and GSTT1 genes in Delhi and comparison with other Indian and global populations. Asian Pacific J Cancer Prev. 2012;13(11):5647-52.

5- Zakiullah, Ahmadullah, Khisroon M, Saeed M, Khan A, Khuda F, et al. Genetic susceptibility to oral cancer due to combined effects of GSTT1, GSTM1 and CYP1A1 gene variants in tobacco addicted patients of Pashtun ethnicity of Khyber Pakhtunkhwa province of Pakistan. Asian Pacific J Cancer Prev. 2015;16(3):1145-50.

6- Kruger M, Pabst AM, Mahmoodi B, Becker B, Kammerer PW, Koch FP. The impact of GSTM1/GSTT1 polymorphism for the risk of oral cancer. Clin oral investig. 2015;19(8):1791-7.

7- Zhang ZJ, Hao K, Shi R, Zhao G, Jiang GX, Song Y, et al. Glutathione S-transferase M1 (GSTM1) and glutathione S-transferase T1 (GSTT1) null polymorphisms, smoking, and their interaction in oral cancer: a HuGE review and meta-analysis. Am J Epidemiol. 2011;173(8):847-57.

8-Buch SC, Nazar-Stewart V, Weissfeld JL, Romkes M. Case-control study of oral and oropharyngeal cancer in whites and genetic variation in eight metabolic enzymes. Head Neck. 2008; 30(9):1139-47.

-

بررسی واریانت های T(GSTT1) و M(GSTM1) ژن گلوتاتیون S ترانسفراز در کارسینوم سلول سنگفرشی دهان

کد نمونه : .....

سن : ...  سال              

جنس :        مرد □            زن □                

گروه مورد مطالعه :                         گروه OSCC □                     گروه کنترل □

واریانت T(GSTT1) ژن گلوتاتیون S-ترانسفراز:

فاقد عملکرد  □                  هتروزیگوت □                    نرمال□

واریانت M(GSTM1) ژن گلوتاتیون S-ترانسفراز:

فاقد عملکرد  □                  هتروزیگوت □                    نرمال□