بررسی ارتباط میان پلیمورفیسم های ژن رسپتور ویتامین دی، CCR5 و MCP1 و استعداد ابتلا به عفونت مزمن هپاتیت بی در جنوب شرق ایران-زاهدان

هپاتیت به دسته گسترده ای از اختلالات بالینی- پاتولوژیکی اطلاق می شود که از تخریب کبد به علت عوامل ویروسی، سمی، دارویی، بیماریها و یا تهاجم سیستم ایمنی به کبد بوجود می آیند. این بیماری از لحاظ بالینی به دو صورت حاد و مزمن بروز می کند. یکی از انواع هپاتیت ، نوع ویرال است و تاکنون 6 ویروس هپاتیت شامل E ، D ، C ، B ، A و G شناخته شده اند (1, 2). هپاتیت ویروسی یک مشکل بهداشتی بزرگ و شایع ترین علت بیمارهای کبد در جهان می باشد. بر اساس برآورد سازمان بهداشت جهانی  WHO حدود 2 میلیارد نفر از جمعیت جهان شواهد سرولوژیکی ابتلا به عفونت با ویروس هپاتیت  B [Hepatitis B Virus (HBV)] را دارند که حدود 360 میلیون نفر آنان به عفونت مزمن HBV مبتلا می باشند] ناقل مزمن: (Chronic Hepatitis B Virus Carrier)[. ناقلین مزمن در معرض عوارض درازمدت بیماری شامل سیروز یا نارسایی کبدی، کارسینوم هپاتوسلولار و مرگ قرار دارند. سالیانه حدود 500000-700000 مورد مرگ ناشی از HBV گزارش می شود (1, 3). عفونت ممکن است بدون علائم بالینی یا هپاتیت بالینی تظاهر نموده و یا به صورت عفونت مزمن (ناقل مزمن) درآید که ناقل مزمن مهمترین منبع حفظ و بقاء ویروس و انتقال به دیگران می باشد. مزمن شدن عفونت HBV افراد با سن زمان کسب عفونت رابطه معکوس دارد. بطوری که عفونت بیش از 90 درصد نوزادان و شیرخواران، 25-50 درصد کودکان 1-5 ساله و 6-10 درصد کودکان بزرگتر و بالغین مزمن می گردد. زمان کسب عفونت نسبت قابل توجهی از بزرگسالان، از عوارض مزمن هپاتیت B دوران کودکی آنان است  لذا پیشگیری از کسب عفونت HBV در دوران نوزادی و اوایل کودکی مناسب ترین استراتژی پیشگیری از عفونت هپاتیت B و عوارض ناشی از آن در بزرگسالی می باشد (1, 3, 4)

میزان شیوع و بروز عفونت HBV در مناطق مختلف جغرافیایی تفاوت قابل توجه دارد. راههای عمده انتقال عفونت شامل: انتقال عفونت از مادر آلوده به جنین و نوزادش (انتقال عمودی)، تماس طولانی مدت مادر و شیرخوار پس از زایمان (انتقال افقی)، تزریق خون و ترکیبات آلوده، تماس جنسی، تماس نزدیک و طولانی مدت با ناقل مزمن می باشد. ایران جزو کشورهای با آلودگی خفیف تا متوسط (International Endemicity) است که شیوع سرمی عفونت HBV 35 درصد و نسبت جمعیت ناقل مزمن 5-1.7 درصد است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منشاء و زمان کسب عفونت نیمی از افراد ایرانی آلوده به HBV در دوران نوزادی و از مادران ناقل مزمن بوده و حدود 56-51 درصد بیماران سیروتیک ایرانی شواهد عفونت مزمن HBV را دارند (8, 9).

در بسیاری از بیماری های التهابی و سرطان ها شبکه گسترده ای از کموکین ها و گیرنده های آنها بیان می شوند. مطالعاتی که روی مدل های حیوانی و انسانی انجام شده نشان می دهد که این دسته از مولکول ها اعمال متفاوتی در انواع عفونت ها، التهاب ها و تومورها انجام می دهند که می توان به این موارد اشاره کرد: بسیج سلول های ایمنی از جمله ماکروفاژها، سلول های T تنظیم کننده (Regulatory Lymphocyte T)، سلول های کشنده طبیعی (NK cell) و لنفوسیت های T عملکردی به محل التهاب، تحریک سلول های ایمنی موجود در محل التهاب و یا تومور برای ترشح مدیاتورهای خود از جمله سایتوکین های آنژیوژنز، تنظیم پاسخ های ضد التهابی، نقش مستقیم و غیر مستقیم به عنوان فاکتور رشد برای سلول های تومور و کمک به فرایند متاستاز (10). از جمله کموکین های مهم که محققین به خواص ضد التهابی و ضد توموری آنها پی برده اند کموکین های   CCL2(MCP-1) ، CCL3(MIP-1α)، CCL5(RANTES) می باشند. این کموکین ها اعمال خود را از طریق گیرنده های CCR2 و CCR5 انجام می دهند. مطالعات نشان می دهد که سیگنال های ناشی از CCR5 منجر به افزایش رونویسی و ترجمه ژن P53 می شود. P53 پروتئینی با خواص ضد التهابی است که در بسیاری از موارد، نقص در بیان و عملکرد آن منجر به ایجاد و گسترش التهاب ها و عفونت ها می شود (11). اتصال CCR5 به پروتئین CCL5  و کنترل آبشارهای تنظیمی عملکرد سیستم ایمنی نیز توسط ویتامین D تنظیم می شود (12).  بنابراین به نظر می رسد که هرگونه نقصی در پروتئین CCR5 و مولکول های درگیر در پیام رسانی داخل سلولی این گیرنده می تواند منجر به ایجاد و یا وخیمتر شدن التهاب و عفونت شود. مطالعات گذشته نشان می دهد که یک جهش در تنها اگزون ژن CCR5 و متعاقب آن حذف 32 نوکلئوتید از این ناحیه منجر به بیان کاهش یافته و غیر عملکردی این مولکول در سطح سلول می شود. این موتاسیون با کاهش میزان احتمال ابتلا به عفونت نقص ایمنی انسان (HIV) (13) و افزایش خطر ابتلا به عفونت هپاتیت سی(HCV) و افزایش وایرال لود (14) در این بیماران ارتباط مستقیم دارد. Woitas et al.  نشان داده اند که فراوانی ژنوتیپ هموزیگوت حذف 32 جفت بازی در بیماران مبتلا به HCV نسبت به افراد سالم بیشتر است (14). از طرفی فراوانی ژنوتیپ هتروزیگوت در افراد مبتلا به HBV نسبت به گروه سالم رایج تر است (12). اخیرا پلیمورفیسم دیگری در ناحیه تنظیم کننده بالا دستی ژن CCR5 که در نژاد های گوناگون رایج است گزارش شده است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مطالعات نشان داده است که پلیمورفیسم CCR5-59029 ارتباط معناداری با میزان پیشرفت عفونت AIDS دارد (16). در این راستا در افراد واجد ژنوتیپ AA  سرعت پیشرفت عفونت AIDS نسبت به افراد واجد ژنوتیپ GG بیشتر است. Chang et al نشان داده اند که پلیمورفیسم CCR5-59029 در ناحیه پروموتر نقش مهمی در کلیرنس عفونت HBV ایفا می کند (17). همچنین CCR5-59029A آلل منجر به افزایش خطر ابتلا به عفونت مزمن HBV می شود.

مکانیسم پیشرفت و یا مهار عفونت HBV بسیار پیچیده است. MCP-1 که یکی از لیگاندهای کموکین CCL5 است تاثیر مهمی بر پاتوژنز عفونت HBV دارد (18). سطح بیان پروتئین MCP-1 در افراد مبتلا به عفونت HBV در حد معناداری بیشتر از افراد سالم است (19). مطالعات ایمونوهیستوشیمی نیز نشان داده اند که میزان بیان این پروتئین در کبد افراد مبتلا به عفونت مزمن HBV بیشتر از افراد سالم است (20). ناحیه پروموتر ژن بیان کننده MCP-1 واجد پلیمورفیسم MCP1-2518 است که تنظیم بالادستی ترجمه و بیان MCP1 را کنترل می کند (21). در مطالعه ای که توسط Park et al  در کره انجام شد مشخص شد که پلیمورفیسم MCP1-2518 منجر به افزایش کلیرنس عفونت HBV می شود (22) اما Cheong et al. نتوانستند ارتباطی میان این پلیمورفیسم و عفونت HBV در بیماران کره ای پیدا کنند (23).

ویتامین D ترکیبی است که منجر به حفظ هموستاز مواد معدنی در بدن می شود. این ویتامین با تنظیم جذب کلسیم در روده و بازجذب آن توسط کلیه نقش مهمی در کنترل متابولیسم و عملکرد یون های کلسیم و فسفر ایفا می کند. از سوی دیگر، 1،25-دی هیدروکسی که فرم فعال ویتامین دی می باشد، در تنظیم سیستم ایمنی و رشد و تمایز سلول ها نقش دارد (24). این ترکیب به عنوان یک هورمون ایمونورگولیتور طی فعال سازی مونوسیت ها موجب تنظیم پاسخ های ایمنی بواسطه سلول شده و مهار تکثیر لنفوسیت ها، تولید آنتی بادی و سنتز سیتوکین ها و مرگ برنامه ریزی شده سلول ها را موجب می شود (25, 26). تنظیم بالا دستی فاکتور نکروز کننده تومور (TNF)، فاکتور رشد تومور (TGFβ) و اینترلوکین 4 (IL4) و نیز تنظیم پایین دستی اینترفرون گاما (IFNϒ) و IL12 نیز از جمله عملکرد های مهم 1،25-دی هیدروکسی می باشد 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 (27-29). همچنین ویتامین دی میزان تولید RANTES که لیگاند کموکین CCR5 می باشد را کنترل می کند (30). ویتامین دی بواسطه اتصال به رسپتور خود (VDR) که نوعی گیرنده هسته ای است، فعالیت می کند.VDR  یک پروتئین محلول با وزن 48 کیلو دالتون است که در سطح سلول های مونوسیت، لنفوسیت های T و B بیان می شود. پروتئین های VDR, CCR5, TNF فعالیت ویتامین دی را کنترل می کنند. ژن بیان کننده VDR شامل پلیمورفیسم های متعددی (Apa1 و Taq 1 )  است که نقش آنها در بسیاری از بیماری های ایمنی و نیز عفونت HBV قابل توجه است (12, 31). به عنوان مثال نتایج مطالعات Suneetha et al. تفاوت معناداری میان فراوانی آللی پلیمورفیسم VDR-Apa1 و میزان پیشرفت عفونت مزمن هپاتیت B نشان داده است (12). هچنین ارتباط پلیمورفیسم های ژن VDR با سایر بیماری های مزمن از قبیل سیروز کبدی، هپاتیت خود ایمنی، دیابت،بیماری کرون، توبرکلوزیس گزارش شده است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

Suneetha (35)و همکاران در مطالعه خود نشان دادند که ژنوتیپ هتروزیگوت CCR5-D32 با احتمال ابتلا به HBV و VDRaa با تشدید بیماری و نیز افزایش میزان ویرال لود ارتباط مستقیم دارد. در این مطالعه مشخص شد که فراوانی هاپلوتایپ  Wt/Wt-a/a-T/T در بیماران مبتلا به فیبروز ناشی از HBV بیشتر از افراد سالم است.

Woitas (12)و همکاران نشان دادند که حذف قطعه 32 در CCR5-D32 در بیماران مبتلا به HCV بیشتر از افراد سالم است.وی همچنین نشان داد افراد واجد این موتاسیون وایرال لود بیشتری دارند. با این وجود Promrat (36)و همکاران نتوانستند چنین ارتباط معناداری گزارش کنند. در این مطالعه مشخص شد که آلل CCR5 59029-A منجر به ایجاد پاسخ پایداربه درمان می شود.

Thio (37)و همکاران در مطالعه ای نشان دادند که CCR5-D32 منجر به کاهش خطر پیشرفت عفونت HBV  می شود.

با توجه به مطالعه ای که دکتر صالحی و همکاران در سال 1376 به منظور تعیین شیوع هپاتیتB  در 410 نفراز ساکنین زاهدان انجام دادند، نتایج نشان داد که عفونت هپاتیت B  در زاهدان نسبت به سایر نقاط کشورشیوع بیشتری دارد (33.9درصد)و عفونت HBV در سنین بالا، در جنس مذکر و در افراد با وضعیت اقتصادی پایین تر شایعتر است و بر اساس طبقه بندی جهانی این شهر جزو مناطق با میزان متوسط عفونت قرار دارد. در مطالعه دیگری که توسط همین محقق در سال های 1376 و1378 ،به منظور تعیین اتیولوژی هپاتیت حاد ویروسی در زاهدان و بر روی 273 بیمار مبتلا به هپاتیت حاد ویروسی انجام شد، نتایج نشان داد که در افراد بالای 30 سال هپاتیت B شایعتر است (38, 39). از این رو با توجه به شیوع فراوان هپاتیت B در زاهدان و نقش تاثیر گذار کموکین ها در پاتوژنز عفونت HBV ، همچنین فراوانی های متفاوت آللی و ژنوتیپی پلیمورفیسم های ژن CCR5-59029 ، CCR5-D32 ، MCP1-2518 ، VDR-Apa1 و VDR-Taq 1 در جوامع مختلف و نیز عدم بررسی ارتباط این پلیمورفیسم ها  با HBV در جمعیت جنوب شرق ایران، هدف از پژوهش حاضر تعیین فراوانی ژنوتیپی و آللی پلیمورفیسم های یاد شده و نیز تعیین غلظت سرمی این پروتئین ها در بیماران HBV  و مقایسه این فراوانی ها در افراد بیمار نسبت به افراد سالم است تا مشخص شود که آیا با توجه به شیوع بالای این عفونت در جمعیت شهر زاهدان  این SNP ها می تواند به عنوان یکی از عوامل ژنتیکی میزبان بر میزان استعداد ابتلا و ادامه ی عفونت HBV در جمعیت جنوب شرق ایران –زاهدان تاثیرگذار باشند یا خیر.

• فراوانی ژنوتیپ های پلی مورفیسم ژن CCR5-59029 در مبتلایان به عفونت مزمن HBV در مقایسه با افراد سالم متفاوت است.
• فراوانی ژنوتیپ های پلی مورفیسم ژن CCR5-D32 در مبتلایان به عفونت مزمن HBV در مقایسه با افراد سالم متفاوت است.
• فراوانی ژنوتیپ های پلی مورفیسم ژن MCP1-2518 در مبتلایان به عفونت مزمن HBV در مقایسه با افراد سالم متفاوت است.
• فراوانی ژنوتیپ های پلی مورفیسم ژن VDR-Apa1 در مبتلایان به عفونت مزمن HBV در مقایسه با افراد سالم متفاوت است.
• فراوانی ژنوتیپ های پلی مورفیسم ژن VDR-Taq 1 در مبتلایان به عفونت مزمن HBV در مقایسه با افراد سالم متفاوت است.
• غلظت سرمی پروتئین CCR5 در مبتلایان به عفونت مزمن HBV در مقایسه با افراد سالم متفاوت است.
• غلظت سرمی پروتئین  MCP1در مبتلایان به عفونت مزمن HBV در مقایسه با افراد سالم متفاوت است.

غلظت سرمی پروتئین VDR در مبتلایان به عفونت مزمن HBV در مقایسه با افراد سالم متفاوت است.

بررسی ارتباط میان پلیمورفیسم های ژن رسپتور ویتامین دی، CCR5 و MCP1 و استعداد ابتلا به عفونت مزمن هپاتیت بی در جنوب شرق ایران-زاهدان

• مقایسه فراوانی ژنوتیپ های پلی مورفیسم ژن CCR5-59029 در مبتلایان به عفونت مزمن HBV و افراد سالم.
• مقایسه فراوانی ژنوتیپ های پلی مورفیسم ژن CCR5-D32 در مبتلایان به عفونت مزمن HBV و افراد سالم.
• مقایسه فراوانی ژنوتیپ های پلی مورفیسم ژن MCP1-2518 در مبتلایان به عفونت مزمن HBV وافراد سالم.
• مقایسه فراوانی ژنوتیپ های پلی مورفیسم ژن VDR-Apa1 در مبتلایان به عفونت مزمن HBV و افراد سالم.
• مقایسه فراوانی ژنوتیپ های پلی مورفیسم ژن VDR-Taq 1 در مبتلایان به عفونت مزمن HBV و افراد سالم.
• مقایسه غلظت سرمی پروتئین CCR5 در مبتلایان به عفونت مزمن HBV و افراد سالم.
• مقایسه غلظت سرمی پروتئین  MCP1در مبتلایان به عفونت مزمن HBV و افراد سالم.
• مقایسه غلظت سرمی پروتئین VDR در مبتلایان به عفونت مزمن HBV و افراد سالم.

دانشگاه علوم پزشکی زاهدان، حوزه معاونت پژوهشی، مدیریت امورپژوهشی، پژوهشکده دانشگاه علوم پزشکی زاهدان

 پلی مورفیسم: چندشکلی

ویروس هپاتیت  B: Hepatitis B Virus (HBV )

آنتی ژن سطحی هپاتیت B: HBsAg  یا Hepatitis B surface Antigen

رسپتور کموکین نوع 5: CCR5

پروتئین میانجی مونوسیت 1 : MCP1

رسپتور ویتامین دی: VDR

واکنش زنجیره ای پلیمریزاسیون قطعه محدود شده: RFLP-PCR

Enzyme-linked immunosorbent assay : ELISA

موردی- شاهدی

بیماران مبتلا به هپاتیت B مراجعه کننده سازمان انتقال خون زاهدان (گروه مورد)

افراد سالم اهداء کننده خون مراجعه کننده به سازمان انتقال خون زاهدان (گروه شاهد)

بیمارانی که از نظر آزمایش HBsAg به روش ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay )  و یا HBV DNA مثبت باشند به عنوان گروه مورد انتخاب می شوند. افرادی که سایر بیماری های ایمنی و عفونی مانندHCV ، ایدز، مشکلات کلیوی داشته باشند از فرایند تحقیق خارج می شوند. در صورت مصرف داروهای هپاتوتوکسیک نیز بیماران از فرایند تحقیق خارج می شوند.

در این مطالعه افراد اهدا کننده ی خون بدون هیچ سابقه ابتلا HBV که جهت اهدا خون به سازمان انتقال خون زاهدان مراجعه خواهند کرد به عنوان گروه کنترل انتخاب می شوند.

با توجه به شیوع متوسط عفونت HBV مزمن در زاهدان و همچنین با توجه به حجم نمونه سایر مقالات ،حجم نمونه برای افراد مبتلا به HBV برابر 100 و گروه کنترل نیز به همان تعداد در نظر گرفته می شود.      

نمونه های مورد نظر  از بین افراد مبتلا به HBV که شاخص های ورود به مطالعه را داشته باشند انتخاب می شوند. گروه سالم از بین اهداکنندگان خون با شرایط ورود و عدم داشتن شرایط خروج، با همسان سازی سن و جنس انجام خواهد شد.

فرم اطلاعاتی ضمیمه 1

پس از انجام آزمایش های مولکولی بر روی نمونه سرم و  DNA استخراج شده از خون، با روش الایزا و PCR غلظت سرمی پروتئین ها وپلی مورفیسم ژنی بیماران تعیین می گردد.

در این مطالعه افراد اهدا کننده ی خون بدون هیچ سابقه ابتلا HBV که جهت اهدا خون به سازمان انتقال خون زاهدان مراجعه کرده اند به عنوان گروه کنترل انتخاب شدند. همچنین بیماران مبتلا به HBV مزمن که HBsAg و یا HBV DNA آنها مثبت است و HCV منفی دارند از افراد مراجعه کننده به آزمایشگاه های تشخیص بالینی سازمان انتقال خون زاهدان به صورت تصادفی انتخاب می شوند. شرکت کنندگان با پر کردن فرم رضایتنامه،رضایت آگاهانه کتبی خود را مبنی بر شرکت در این پژوهش اعلام می نمایند. همه بیمارانی که از نظر آزمایش HBsAg به روش ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ) و HBV DNA مثبت بوده به عنوان گروه مورد انتخاب شده و آنهایی که از نظر این دو آزمایش منفی باشند به عنوان گروه شاهد انتخاب می شوند.

5 میلی لیتر نمونه خون از هر فرد گرفته شده و به دو قسمت تقسیم می شود. بخشی از نمونه خون محیطی در لوله حاوی EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid ) به عنوان ماده ضد انعقاد از افراد تهیه و در دمای 80 – درجه سانتیگراد تا زمانی که استخراج DNA ژنومی بر روی نمونه های خون انجام شود فریز می گردد. استخراج DNA ژنومی با استفاده از روش نمک اشباع و به روش دستی انجام می شود. با استفاده ازدستگاه اسپکتروفوتومتر نسبت جذب نوری در طول موج260 نانومتر (طول موجی که DNA حداکثر جذب را دارد) به 280 نانومتر (طول موجی که در آن پروتئین حداکثر جذب را دارد) اندازه گرفته و نمونه هایی که بهترین خلوص را دارند(2>280/260 OD >1.8 )در 80- درجه سانتیگراد جهت استفاده در فرایند PCR فریز می شوند. پرایمرهای اختصاصی برای بررسی پلی مورفیسم های ژنی ذکر شده به روش  PCR و RFLP طراحی می شود. در مرحله بعد شرایط PCR برای تعیین این پلی مورفیسم ها بهینه می شود و سپس پلی مورفیسم ها ی ژنی ذکر شده در نمونه ها با این تکنیک آنالیز می شوند. بخشی دیگر از نمونه خون محیطی بلافاصله سانترفیوژ شده و سرم نمونه ها جدا و در دمای 80 – درجه سانتیگراد تا زمان انجام تست های الایزا فریز می گردد. کیت های الایزا از کمپانی های معتبر خریداری خواهد شد.

جهت مقایسه فراوانی پلی مورفیسم ها از آزمون کای اسکوئر و برای مقایسه متغیرهای کمی از آزمون T-Test استفاده می گردد. سطح معنی داری تفاوتها p<0.05 در نظر گرفته خواهد شد.

کدهای 1، 2، 3، 8، 10، 11، 13، 15، 18، 25، 28، مصوب کمیته کشوری اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی که در دفترچه راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش‌های دارای آزمودنی انسانی در جمهوری اسلامی ایران، دربردارنده‌ی اصول و مقررات اخلاقی‎ مطرح  و در سال 1392 در 31 بند تصویب شده است و همچنین کدهای 1، 2، 3، 4، 7 مربوط به دفترچه راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی در جمهوری اسلامی ایران از قسمت راهنمای عمومی در این طرح رعایت می شود. تمامی بیماران تحت مطالعه آگاهانه و برای مقاصد علمی  اقدام به دادن نمونه خواهند کرد. شرکت در این طرح هیچ گونه هزینه ای برای بیماران ندارد و نام و مشخصات بیماران گزارش نخواهد شد.

مشکلات مربوط به تهیه مواد اولیه و تجهیزات آزمایشگاهی مورد نیاز- عدم همکاری بیماران که با پی گیری و صرف زمان بیشتر قابل حل خواهد بود.

هپاتیت بی، کموکین، پلیمورفیسم، CCR5-59029، CCR5-D32، MCP1-2518، VDR-Apa1، VDR-Taq 1

1.             World Health Organization. Hepatitis B vaccines (2004). WKLY Epidemiol Rec.79:253-64.

2.             Harrison's, Principles of Internal Medicine (2005). 16 ed.

3.             Shepard CW, Simard EP, Finelli L, Fiore AE, Bell BP. Hepatitis B virus infection: epidemiology and vaccination. Epidemiol Rev. 2006;28:112-25.

4.             Hyams KC. Risks of chronicity following acute hepatitis B virus infection: a review. Clin Infect Dis. 1995;20:992-1000.

5.             Alavian SM, Fallahian F, Lankarani KB. The changing epidemiology of viral hepatitis B in Iran. J Gastrointestin Liver Dis. 2007;16(4):403-6.

6.             Alizadeh AH, Ranjbar M, Ansari S, MirArab A, Alavian SM, Mohammad K. Seroprevalence of hepatitis B in Nahavand, Islamic Republic of Iran. East Mediterr Health J. 2006;12(5):528-37.

7.             Merat S, Malekzadeh R, Rezvan H, Khalilian M. Hepatitis B in Iran. Arch Iranian Med. 2000;3:192-201.

8.             Shamszad M, Farzadegan H. Hepatitis B related cirrhosis and hepatocellular carcinoma in Iran. J Iran Med Council. 1982;8:228-33.

9.             Zali MR, Mohammad K, Noorbala AA, Noorimayer B, Shahraz S. Rate of hepatitis B seropositivity following mass vaccination in the Islamic Republic of Iran. East Mediterr Health J. 2005;11(1-2):62-7.

10.           Ehling J, Tacke F. Role of chemokine pathways in hepatobiliary cancer. Cancer Lett. 2015;26(15):00411-5.

11.           Aldinucci D, Lorenzon D, Cattaruzza L, Pinto A, Gloghini A, Carbone A, et al. Expression of CCR5 receptors on Reed-Sternberg cells and Hodgkin lymphoma cell lines: involvement of CCL5/Rantes in tumor cell growth and microenvironmental interactions. Int J Cancer. 2008;122(4):769-76.

12.           Suneetha PV, Sarin SK, Goyal A, Kumar GT, Shukla DK, Hissar S. Association between vitamin D receptor, CCR5, TNF-alpha and TNF-beta gene polymorphisms and HBV infection and severity of liver disease. J Hepatol. 2006;44(5):856-63.

13.           Huang Y, Paxton WA, Wolinsky SM, Neumann AU, Zhang L, He T, et al. The role of a mutant CCR5 allele in HIV-1 transmission and disease progression. Nat Med. 1996;2(11):1240-3.

14.           Woitas RP, Ahlenstiel G, Iwan A, Rockstroh JK, Brackmann HH, Kupfer B, et al. Frequency of the HIV-protective CC chemokine receptor 5-Delta32/Delta32 genotype is increased in hepatitis C. Gastroenterology. 2002;122(7):1721-8.

15.           Martin MP, Dean M, Smith MW, Winkler C, Gerrard B, Michael NL, et al. Genetic acceleration of AIDS progression by a promoter variant of CCR5. Science. 1998;282(5395):1907-11.

16.           McDermott DH, Zimmerman PA, Guignard F, Kleeberger CA, Leitman SF, Murphy PM. CCR5 promoter polymorphism and HIV-1 disease progression. Multicenter AIDS Cohort Study (MACS). Lancet. 1998;352(9131):866-70.

17.           Chang HY, Ahn SH, Kim DY, Shin JS, Kim YS, Hong SP, et al. [Association between CCR5 promoter polymorphisms and hepatitis B virus infection]. Korean J Hepatol. 2005;11(2):116-24.

18.           Meng ZF, Wang HJ, Yao X, Wang XY, Wen YM, Dai JX, et al. Immunization with HBsAg-Fc fusion protein induces a predominant production of Th1 cytokines and reduces HBsAg level in transgenic mice. Chin Med J. 2012;125(18):3266-72.

19.           Fierro NA, Roman S, Realpe M, Hernandez-Nazara Z, Zepeda-Carrillo EA, Panduro A. Multiple cytokine expression profiles reveal immune-based differences in occult hepatitis B genotype H-infected Mexican Nahua patients. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2011;106(8):1007-13.

20.           Shen HY, Deng YC, Wang QM, Li QS, Xu Z. [Expression of MCP-1 in the patients of chronic hepatitis B complicated with nonalcoholic fatty liver disease]. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 2012;28(9):975-8.

21.           Rovin BH, Lu L, Saxena R. A novel polymorphism in the MCP-1 gene regulatory region that influences MCP-1 expression. Biochem Biophys Res Commun. 1999;259(2):344-8.

22.           Park BL, Kim YJ, Cheong HS, Kim LH, Choi YH, Lee HS, et al. Association of common promoter polymorphisms of MCP1 with hepatitis B virus clearance. Exp Mol Med. 2006;38(6):694-702.

23.           Cheong JY, Cho SW, Choi JY, Lee JA, Kim MH, Lee JE, et al. RANTES, MCP-1, CCR2, CCR5, CXCR1 and CXCR4 gene polymorphisms are not associated with the outcome of hepatitis B virus infection: results from a large scale single ethnic population. J Korean Med Sci. 2007;22(3):529-35.

24.           Gurlek A, Pittelkow MR, Kumar R. Modulation of growth factor/cytokine synthesis and signaling by 1alpha,25-dihydroxyvitamin D(3): implications in cell growth and differentiation. Endocr Rev. 2002;23(6):763-86.

25.           Weitsman GE, Ravid A, Liberman UA, Koren R. Vitamin D enhances caspase-dependent and independent TNF-induced breast cancer cell death: the role of reactive oxygen species. Ann N Y Acad Sci. 2003:437-40.

26.           Adams LS, Teegarden D. 1,25-dihydroxycholecalciferol inhibits apoptosis in C3H10T1/2 murine fibroblast cells through activation of nuclear factor kappaB. J Nutr. 2004;134(11):2948-52.

27.           Abu-Amer Y, Bar-Shavit Z. Regulation of TNF-alpha release from bone marrow-derived macrophages by vitamin D. J Cell Biochem. 1994;55(4):435-44.

28.           Farquharson C, Law AS, Seawright E, Burt DW, Whitehead CC. The expression of transforming growth factor-beta by cultured chick growth plate chondrocytes: differential regulation by 1,25-dihydroxyvitamin D3. J Endocrinol. 1996;149(2):277-85.

29.           Cantorna MT, Woodward WD, Hayes CE, DeLuca HF. 1,25-dihydroxyvitamin D3 is a positive regulator for the two anti-encephalitogenic cytokines TGF-beta 1 and IL-4. J Immunol. 1998;160(11):5314-9.

30.           Fukuoka M, Ogino Y, Sato H, Ohta T, Komoriya K, Nishioka K, et al. RANTES expression in psoriatic skin, and regulation of RANTES and IL-8 production in cultured epidermal keratinocytes by active vitamin D3 (tacalcitol). Br J Dermatol. 1998;138(1):63-70.

31.           Bellamy R, Ruwende C, Corrah T, McAdam KP, Thursz M, Whittle HC, et al. Tuberculosis and chronic hepatitis B virus infection in Africans and variation in the vitamin D receptor gene. J Infect Dis. 1999;179(3):721-4.

32.           Fan L, Tu X, Zhu Y, Zhou L, Pfeiffer T, Feltens R, et al. Genetic association of vitamin D receptor polymorphisms with autoimmune hepatitis and primary biliary cirrhosis in the Chinese. J Gastroenterol Hepatol. 2005;20(2):249-55.

33.           McDermott MF, Ramachandran A, Ogunkolade BW, Aganna E, Curtis D, Boucher BJ, et al. Allelic variation in the vitamin D receptor influences susceptibility to IDDM in Indian Asians. Diabetologia. 1997;40(8):971-5.

34.           Simmons JD, Mullighan C, Welsh KI, Jewell DP. Vitamin D receptor gene polymorphism: association with Crohn's disease susceptibility. Gut. 2000;47(2):211-4.

35.           Salehi M, Saneimoghadam E. Prevalence of HBV infection in Zahedan. Tabibe-shargh. 2002;5(4):245-50.

36.           Salehi M, Saneimoghadam E, Khosravi S. Etiology of acute viral hepatitis in Zahedan. Journal of Research in Medical Sciences. 2002;26(4):245-8.

هپاتیت به دسته گسترده ای از اختلالات بالینی- پاتولوژیکی اطلاق می شود که از تخریب کبد به علت عوامل ویروسی، سمی، دارویی، بیماریها و یا تهاجم سیستم ایمنی به کبد بوجود می آیند. این بیماری از لحاظ بالینی به دو صورت حاد و مزمن بروز می کند. یکی از انواع هپاتیت ، نوع ویرال است و تاکنون 6 ویروس هپاتیت شامل E ، D ، C ، B ، A و G شناخته شده اند (1, 2). هپاتیت ویروسی یک مشکل بهداشتی بزرگ و شایع ترین علت بیمارهای کبد در جهان می باشد. بر اساس برآورد سازمان بهداشت جهانی  WHO حدود 2 میلیارد نفر از جمعیت جهان شواهد سرولوژیکی ابتلا به عفونت با ویروس هپاتیت  B [Hepatitis B Virus (HBV)] را دارند که حدود 360 میلیون نفر آنان به عفونت مزمن HBV مبتلا می باشند] ناقل مزمن: (Chronic Hepatitis B Virus Carrier)[. ناقلین مزمن در معرض عوارض درازمدت بیماری شامل سیروز یا نارسایی کبدی، کارسینوم هپاتوسلولار و مرگ قرار دارند. سالیانه حدود 500000-700000 مورد مرگ ناشی از HBV گزارش می شود (1, 3). عفونت ممکن است بدون علائم بالینی یا هپاتیت بالینی تظاهر نموده و یا به صورت عفونت مزمن (ناقل مزمن) درآید که ناقل مزمن مهمترین منبع حفظ و بقاء ویروس و انتقال به دیگران می باشد. مزمن شدن عفونت HBV افراد با سن زمان کسب عفونت رابطه معکوس دارد. بطوری که عفونت بیش از 90 درصد نوزادان و شیرخواران، 25-50 درصد کودکان 1-5 ساله و 6-10 درصد کودکان بزرگتر و بالغین مزمن می گردد. زمان کسب عفونت نسبت قابل توجهی از بزرگسالان، از عوارض مزمن هپاتیت B دوران کودکی آنان است  لذا پیشگیری از کسب عفونت HBV در دوران نوزادی و اوایل کودکی مناسب ترین استراتژی پیشگیری از عفونت هپاتیت B و عوارض ناشی از آن در بزرگسالی می باشد (1, 3, 4)

میزان شیوع و بروز عفونت HBV در مناطق مختلف جغرافیایی تفاوت قابل توجه دارد. راههای عمده انتقال عفونت شامل: انتقال عفونت از مادر آلوده به جنین و نوزادش (انتقال عمودی)، تماس طولانی مدت مادر و شیرخوار پس از زایمان (انتقال افقی)، تزریق خون و ترکیبات آلوده، تماس جنسی، تماس نزدیک و طولانی مدت با ناقل مزمن می باشد. ایران جزو کشورهای با آلودگی خفیف تا متوسط (International Endemicity) است که شیوع سرمی عفونت HBV 35 درصد و نسبت جمعیت ناقل مزمن 5-1.7 درصد است (5-7). منشاء و زمان کسب عفونت نیمی از افراد ایرانی آلوده به HBV در دوران نوزادی و از مادران ناقل مزمن بوده و حدود 56-51 درصد بیماران سیروتیک ایرانی شواهد عفونت مزمن HBV را دارند (8, 9).

در بسیاری از بیماری های التهابی و سرطان ها شبکه گسترده ای از کموکین ها و گیرنده های آنها بیان می شوند. مطالعاتی که روی مدل های حیوانی و انسانی انجام شده نشان می دهد که این دسته از مولکول ها اعمال متفاوتی در انواع عفونت ها، التهاب ها و تومورها انجام می دهند که می توان به این موارد اشاره کرد: بسیج سلول های ایمنی از جمله ماکروفاژها، سلول های T تنظیم کننده (Regulatory Lymphocyte T)، سلول های کشنده طبیعی (NK cell) و لنفوسیت های T عملکردی به محل التهاب، تحریک سلول های ایمنی موجود در محل التهاب و یا تومور برای ترشح مدیاتورهای خود از جمله سایتوکین های آنژیوژنز، تنظیم پاسخ های ضد التهابی، نقش مستقیم و غیر مستقیم به عنوان فاکتور رشد برای سلول های تومور و کمک به فرایند متاستاز (10). از جمله کموکین های مهم که محققین به خواص ضد التهابی و ضد توموری آنها پی برده اند کموکین های   CCL2(MCP-1) ، CCL3(MIP-1α)، CCL5(RANTES) می باشند. این کموکین ها اعمال خود را از طریق گیرنده های CCR2 و CCR5 انجام می دهند. مطالعات نشان می دهد که سیگنال های ناشی از CCR5 منجر به افزایش رونویسی و ترجمه ژن P53 می شود. P53 پروتئینی با خواص ضد التهابی است که در بسیاری از موارد، نقص در بیان و عملکرد آن منجر به ایجاد و گسترش التهاب ها و عفونت ها می شود (11). اتصال CCR5 به پروتئین CCL5  و کنترل آبشارهای تنظیمی عملکرد سیستم ایمنی نیز توسط ویتامین D تنظیم می شود (12).  بنابراین به نظر می رسد که هرگونه نقصی در پروتئین CCR5 و مولکول های درگیر در پیام رسانی داخل سلولی این گیرنده می تواند منجر به ایجاد و یا وخیمتر شدن التهاب و عفونت شود. مطالعات گذشته نشان می دهد که یک جهش در تنها اگزون ژن CCR5 و متعاقب آن حذف 32 نوکلئوتید از این ناحیه منجر به بیان کاهش یافته و غیر عملکردی این مولکول در سطح سلول می شود. این موتاسیون با کاهش میزان احتمال ابتلا به عفونت نقص ایمنی انسان (HIV) (13) و افزایش خطر ابتلا به عفونت هپاتیت سی(HCV) و افزایش وایرال لود (14) در این بیماران ارتباط مستقیم دارد. Woitas et al.  نشان داده اند که فراوانی ژنوتیپ هموزیگوت حذف 32 جفت بازی در بیماران مبتلا به HCV نسبت به افراد سالم بیشتر است (14). از طرفی فراوانی ژنوتیپ هتروزیگوت در افراد مبتلا به HBV نسبت به گروه سالم رایج تر است (12). اخیرا پلیمورفیسم دیگری در ناحیه تنظیم کننده بالا دستی ژن CCR5 که در نژاد های گوناگون رایج است گزارش شده است (15, 16). مطالعات نشان داده است که پلیمورفیسم CCR5-59029 ارتباط معناداری با میزان پیشرفت عفونت AIDS دارد (16). در این راستا در افراد واجد ژنوتیپ AA  سرعت پیشرفت عفونت AIDS نسبت به افراد واجد ژنوتیپ GG بیشتر است. Chang et al نشان داده اند که پلیمورفیسم CCR5-59029 در ناحیه پروموتر نقش مهمی در کلیرنس عفونت HBV ایفا می کند (17). همچنین CCR5-59029A آلل منجر به افزایش خطر ابتلا به عفونت مزمن HBV می شود.

مکانیسم پیشرفت و یا مهار عفونت HBV بسیار پیچیده است. MCP-1 که یکی از لیگاندهای کموکین CCL5 است تاثیر مهمی بر پاتوژنز عفونت HBV دارد (18). سطح بیان پروتئین MCP-1 در افراد مبتلا به عفونت HBV در حد معناداری بیشتر از افراد سالم است (19). مطالعات ایمونوهیستوشیمی نیز نشان داده اند که میزان بیان این پروتئین در کبد افراد مبتلا به عفونت مزمن HBV بیشتر از افراد سالم است (20). ناحیه پروموتر ژن بیان کننده MCP-1 واجد پلیمورفیسم MCP1-2518 است که تنظیم بالادستی ترجمه و بیان MCP1 را کنترل می کند (21). در مطالعه ای که توسط Park et al  در کره انجام شد مشخص شد که پلیمورفیسم MCP1-2518 منجر به افزایش کلیرنس عفونت HBV می شود (22) اما Cheong et al. نتوانستند ارتباطی میان این پلیمورفیسم و عفونت HBV در بیماران کره ای پیدا کنند (23).

ویتامین D ترکیبی است که منجر به حفظ هموستاز مواد معدنی در بدن می شود. این ویتامین با تنظیم جذب کلسیم در روده و بازجذب آن توسط کلیه نقش مهمی در کنترل متابولیسم و عملکرد یون های کلسیم و فسفر ایفا می کند. از سوی دیگر، 1،25-دی هیدروکسی که فرم فعال ویتامین دی می باشد، در تنظیم سیستم ایمنی و رشد و تمایز سلول ها نقش دارد (24). این ترکیب به عنوان یک هورمون ایمونورگولیتور طی فعال سازی مونوسیت ها موجب تنظیم پاسخ های ایمنی بواسطه سلول شده و مهار تکثیر لنفوسیت ها، تولید آنتی بادی و سنتز سیتوکین ها و مرگ برنامه ریزی شده سلول ها را موجب می شود (25, 26). تنظیم بالا دستی فاکتور نکروز کننده تومور (TNF)، فاکتور رشد تومور (TGFβ) و اینترلوکین 4 (IL4) و نیز تنظیم پایین دستی اینترفرون گاما (IFNϒ) و IL12 نیز از جمله عملکرد های مهم 1،25-دی هیدروکسی می باشد (27-29). همچنین ویتامین دی میزان تولید RANTES که لیگاند کموکین CCR5 می باشد را کنترل می کند (30). ویتامین دی بواسطه اتصال به رسپتور خود (VDR) که نوعی گیرنده هسته ای است، فعالیت می کند.VDR  یک پروتئین محلول با وزن 48 کیلو دالتون است که در سطح سلول های مونوسیت، لنفوسیت های T و B بیان می شود. پروتئین های VDR, CCR5, TNF فعالیت ویتامین دی را کنترل می کنند. ژن بیان کننده VDR شامل پلیمورفیسم های متعددی (Apa1 و Taq 1 )  است که نقش آنها در بسیاری از بیماری های ایمنی و نیز عفونت HBV قابل توجه است (12, 31). به عنوان مثال نتایج مطالعات Suneetha et al. تفاوت معناداری میان فراوانی آللی پلیمورفیسم VDR-Apa1 و میزان پیشرفت عفونت مزمن هپاتیت B نشان داده است (12). هچنین ارتباط پلیمورفیسم های ژن VDR با سایر بیماری های مزمن از قبیل سیروز کبدی، هپاتیت خود ایمنی، دیابت،بیماری کرون، توبرکلوزیس گزارش شده است (31-34).

با توجه به مطالعه ای که دکتر صالحی و همکاران در سال 1376 به منظور تعیین شیوع هپاتیتB  در 410 نفراز ساکنین زاهدان انجام دادند، نتایج نشان داد که عفونت هپاتیت B  در زاهدان نسبت به سایر نقاط کشورشیوع بیشتری دارد (33.9درصد)و عفونت HBV در سنین بالا، در جنس مذکر و در افراد با وضعیت اقتصادی پایین تر شایعتر است و بر اساس طبقه بندی جهانی این شهر جزو مناطق با میزان متوسط عفونت قرار دارد. در مطالعه دیگری که توسط همین محقق در سال های 1376 و1378 ،به منظور تعیین اتیولوژی هپاتیت حاد ویروسی در زاهدان و بر روی 273 بیمار مبتلا به هپاتیت حاد ویروسی انجام شد، نتایج نشان داد که در افراد بالای 30 سال هپاتیت B شایعتر است (35, 36). از این رو با توجه به شیوع فراوان هپاتیت B در زاهدان و نقش تاثیر گذار کموکین ها در پاتوژنز عفونت HBV ، همچنین فراوانی های متفاوت آللی و ژنوتیپی پلیمورفیسم های ژن CCR5-59029 ، CCR5-D32 ، MCP1-2518 ، VDR-Apa1 و VDR-Taq 1 در جوامع مختلف و نیز عدم بررسی ارتباط این پلیمورفیسم ها  با HBV در جمعیت جنوب شرق ایران، هدف از پژوهش حاضر تعیین فراوانی ژنوتیپی و آللی پلیمورفیسم های یاد شده و نیز تعیین غلظت سرمی این پروتئین ها در بیماران HBV  و مقایسه این فراوانی ها در افراد بیمار نسبت به افراد سالم است تا مشخص شود که آیا با توجه به شیوع بالای این عفونت در جمعیت شهر زاهدان  این SNP ها می تواند به عنوان یکی از عوامل ژنتیکی میزبان بر میزان استعداد ابتلا و ادامه ی عفونت HBV در جمعیت جنوب شرق ایران –زاهدان تاثیرگذار باشند یا خیر.

فرم اطلاعاتی ضمیمه 1