بررسی اثر عصاره هیدروالکلی انجدان رومی بر الگوی بیان ژن فسفو دی استراز 5 و نقش آن در القای آپوپتوز در رده سلول سرطان پستان MDA-MB-468

سرطان یک مشکل عمده بهداشت عمومی در بسیاری از مناطق جهان است و در حال حاضر شایع ترین علت مرگ و میر بعد از بیماری های قلبی در آمریکا است وانتظار می رود در چند سال آینده به اولین عامل مرگ و میر تبدیل شود (1). سرطان پستان شایع ترین سرطان در زنان است تقربیا یکی از 8 زن در آمریکا به سرطان پستان مبتلا می شود در سال 2015 حدود 1,384,155 مورد سرطان مهاجم پستان در ایالات متحده شناسایی شده که 459,000 مورد از آن منجر به مرگ شد (2). مصرف الکل، چاقی و سن بالای 40 سال خطر ابتلا به سرطان پستان را افزایش می دهد (5-4). درمان اصلی جهت این سرطان جراحی می باشد، پرتودرمانی، ایمنی درمانی، ژن درمانی، شیمی درمانی و هورمون درمانی هم از سایر روش های درمانی هستند (6-8). اکثر این درمان ها موثر نبوده و عوارض جانبی نامطلوب دارد (9). در نتیجه امروزه داروهای گیاهی به علت عدم عوارض جانبی نسبت به داروهای شیمیایی مورد توجه قرار گرفته اند (10). هدف اصلی از درمان سرطان توسط مواد طبیعی و شیمیایی کند کردن یا مهار فرایند سرطانزایی می باشد (11). لذا در سال های اخیر درمان های انتخابی سلول های سرطانی به وسیله القای آپوپتوز هدف اصلی تحقیقات سرطان نیز بوده است (12).

 انجدان رومی با نام علمی Levisticum officinale از تیره Apiaceae می باشد که بوته ای و چند ساله با ساقه ای به ارتفاع 20 تا 200 سانتی متر است برگ های سبز تیره و درخشان دارد و بو و طعم آن شباهت زیادی به کرفس دارد. پراکندگی جغرافیایی آن اروپا، ایران و افغانستان را در بر می گیرد انجدان رومی  در جنوب شرق ایران، در کرمان می روید و نام عمومی آن lovage است (13).

این گیاه حاوی ترکیبات شیمیایی زیادی از قبیل بتا-فلاندرن، آلفا –ترپینیل استات ، β-Myrcene،  Ligustilide و α-Pinene است (14).از این گیاه برای درمان گلودرد، تب، بیماری سنگ کلیه و مجاری ادراری استفاده می شود و یک ادرار آور قوی است و به عنوان خلط آور و اشتها آور نیز استفاده میشود. از ریشه های این گیاه دارو های ضد نفخ و ضد تشنج تهیه می کنند و از آن می توان برای ضد عفونی زخم استفاده کرد (15, 16).

آپوپتوز نوعی مرگ سلولی است که در شرایط عادی برای از بین بردن سلول های اضافی و مضر انجام میشود (17, 18).  برای هموستاز بافت ضروری است و اختلال در آن باطیف گسترده ای از اختلالات شامل سرطان،  بیماری های دژنراتیو عصبی، بیماری های خود ایمنی و دیابت ارتباط دارد (18).برای توسعه و پشرفت سرطان آپوپتوز باید مهار شود و القای آپوپتوز نقش مهمی در درمان سرطان دارد (19).درآپوپتوز  سلول و هسته چروکیده می شوند، کروماتین فشرده شده، اجسام آپوپتوتیک ایجاد می شود که به وسیله سلول مجاور و یا فاگوسیتها فاگوسیت  می شوند. در این فرایند DNA به صورت آنزیمی به قطعات اینتر نوکلئوزومی 180-bp باالگویی خاص نردبانی قطعه قطعه شکسته می شود که یک مشخصه بیوشمیایی آپوپتوز است (20, 21). تحقیقات نشان داده که دو مسیر برای آپوپتوز وجود دارد مسیر بیرونی یا وابسته به رسپتور و مسیرداخلی یا وابسته به میتوکندری (22). در هردو مسیر کاسپازها نقش دارند که کاسپازها جزو خانواده سیستئین - آسپارتات پروتئازها هستند واسطه ی مهم برای روند آپوپتوز می باشد (21). در مسیر خارجی رسپتور مرگ که عضو خانواده فاکتور نکروز تومورTNF است  توسط سیگنال فعال شده و کاسپاز 8 را فعال می کند. کاسپاز8 می تواند به طور مستقیم کاسپازهای اجرایی از جمله کاسپاز 3 را فعال کند. (23). در مسیر داخلی پروتئین های پش آپوپتوزی مثل BAK و bax باعث بهم خوردن نفوذپذیری غشاء میتوکندری و آزاد شدن شماری از مولکول های موجود در غشاء میتوکندری مانند سیتوکروم c می شوند که باعث فعال شدن کاسپاز 9 می شود و در نهایت با فعال شدن کاسپازهای اجرایی مانند کاسپاز 3 مرگ سلول رخ می دهد (21).

فسفودی استرازها گروهی از آنزیم ها هستند که cAMP وcGMP را هیدرولیز می کنند. درنتیجه در تنظیم غلظت داخل سلولی این نوکلئوتیدهای و پاسخ هایی که ایجاد می کنند نقش دارند (24). سه نوع از فسفودی استراز وجود دارد :خانواده های 1، 2، 3 و 10 ، که هم cGMP و cAMP را هیدرولیز می کنند، خانواده های 4 ،7 و 8 ، cAMP را هیدرولیز می نمایند و خانواده های 5، 6 و9 که به طور اختصاصی موجب هیدرولیز cGMP می شوند (25, 26).  فسفودی استرازها در تنظیم عملکرد قلب، سنتز استروئیدهای غده آدرنال و در پدیده انتقال نور نقش دارند (1, 27). فسفودی استراز 5 cGMP را هیدرولیز می کند. cGMP درشل شدن عضلات معده و مهار تجمع پلاکت ها و بینایی نقش دارد این آنزیم معمولا در سیتوپلاسم و در عضلات معده، پلاکتها و کلیه قرار دارد. شواهد نشان داده cGMP نقش مهمی در تکثیر سلولی، تمایز و آپوپتوز دارد cGMP توسط گوانیلات سیکلاز سنتز می شود و پروتئین کیناز G را فعال می کند و توسط فسفودی استراز هیدرولیز می شود (28, 29). افزایش بیان فسفو دی استراز 5 و کاهش cGMP که همراه با پروتئین کیناز Gاست در سرطان های مختلف مثل سرطان پستان، سرطان کولون و سرطان سلول های سنگفرشی دهان مشاهده می شود (30, 29). درنتیجه پیشنهاد شده که فسفودی استراز 5 در ایجاد سرطان نقش دارد و مهار فعالیت آن ممکن است نقش ضد سرطانی داشته باشد.  اخیرا اثرات مهار فسفو دی استراز 5 در توسعه سرطان پوست نشان داده شده و پیشنهاد شده که مهار فسفودی استراز 5 می تواند به کاهش خطر توسعه سرطان کولون و لنفوسیت منجر شود. مطالعات نشان داده که بیان فسفودی استراز 5 در سلول های سرطان پستان نسبت به سلول های سالم و تومور های خوش خیم به مقدار قابل توجهی بالا است و ارتباط مثبتی بین افزایش فسفو دی استراز 5 و درجه تومور و درگیری غدد لنفاوی وجود دارد. افزایش فعالیت پروتئین کیناز G که توسط cGMP فعال می شود می تواند آپوپتوز و توقف رشد را در 2 رده سلولی MCF-7 و MDA-MB-468  القا کند و مهار کنندهای مهار فسفو دی استراز 5 مثل sulindac sulfide , trequinsin و MY5445 می توانند رشد را در سلول های سرطان پستان متوقف کند این اثر احتمالا به این دلیل است که با مهار فسفو دی استراز 5 سطح cGMP افزایش می یابد که باعث فعال شدن پروتئین کیناز G شده، پروتئین کیناز G می تواند باعث فسفریله شدن بعضی از پروتئین های درگیر در رشد و تکثیر سلول مثل بتا کاتنین شده که با فسفیریلاسون غیر فعال شده و ممکن است بعضی از پروتئین هایی که در آپوپتوز نقش دارند را با فسفریله کردن فعال کند (31-34). 

عصاره گیاهان دارویی در مسیر های متفاوتی از سیگنالینگ سلولی اثر دارند. درمورد عصاره گیاه انجدان رومی اطلاعات مفید در مورد مکانیسم های مسیر سیگنالینگ مشاهده نشده. در این تحقیق بر مسیر سیگنالینگ  cGMP  فوکوس شده است.  باتوجه به این که اثر ضد سرطانی این گیاه و تاثیر آن در القاء آپوپتوز بر روی سلول های سرطان سر و گردن و سرطان گلبول سفید مورد بررسی قرار گرفته است (35,38).احتمال دارد گیاه انجدان رومی روی سرطان پستان هم تاثیر داشته باشد. کارهای تحقیقاتی زیادی لازم است تا این گیاه در درمان سرطان مورد تایید و استفاده قرار گیرد.

با توجه به اینکه اثر عصاره هیدروالکلی انجدان رومی بر بیان  فسفودی استراز 5 و مسیر سیگنالینگ cGMP  در سلول های سرطانی پستان تا کنون مشاهده نشده است هدف این مطالعه بررسی اثر عصاره این گیاه بر روی الگوی بیان ژن فسفودی استراز 5 و نقش آن در القای آپوپتوز در رده سلول سرطان پستان MDA-MB-468 ER- خواهد بود.

بازنگری متون:

 مطالعات نشان داده روغن  گیاه Levisticum officinale-Koch خاصیت آنتی اکسیدانی، ضدالتهاب وضد تومور دارد (16, 35, 36).

در بررسی که توسط SR Abd El-Hamid و همکاران در سال 2009 بر روی روغن گیاه Levisticum officinale انجام دادند متوجه شدند که روغن این گیاه خاصیت ضد سرطانی علیه سلول های  HepG2 و MCF7 دارد (37).

 A. Bogucka-Kocka و همکاران درسال 2008 گزارش کردند که عصاره Levisticum officinale دارای خاصیت آپوپتوزی بر روی رده های سلولی سرطان گلبول سفید (human leukaemia)است (38).

در بررسی که توسط Sertel و همکاران در سال 2011 انجام گرفت مشخص گردید عصاره Levisticum officinale اثر مهاری بر رشد سلولهای سرطانی رده سلولی UMSCC1 در سلول های سارکومای سر و گردن دارد (35).

1-درصد القا مرگ سلولی در رده سلول سرطان پستان MDA-MB-468  تیمار شده با عصاره هیدروالکلی  گیاه انجدان رومی در مقایسه با سلول های تیمار نشده در یک الگوی وابسته به دوز (0؛25؛50؛75؛100 میکروگرم/میلی لیتر) و زمان (24؛48؛72 ساعت) متفاوت است.

2. در صد القای آپوپتوز در رده سلول سرطان پستان MDA-MB-468  تیمار شده با عصاره هیدروالکلی گیاه انجدان رومی  در مقایسه با سلول های  تیمار نشده در یک  الگوی وابسته به دوز (0؛25؛50؛75؛100 میکروگرم/میلی لیتر) و زمان (24؛48؛72 ساعت) متفاوت است .

3.میزان بیان ژن فسفو دی استراز 5 رده سلول سرطان پستان MDA-MB-468  تیمار شده با عصاره هیدروالکلی  گیاه انجدان رومی در مقایسه با سلول های تیمار نشده متفاوت است.

4- میزان cGMP  در رده سلول سرطان پستان MDA-MB-468  تیمار شده با عصاره هیدروالکلی  انجدان رومی با سلول های تیمار نشده متفاوت است .

تعیین اثرات عصاره هیدروالکلی انجدان رومی بر الگوی بیان ژن انزیم فسفو دی استراز 5 و نقش آن در القای آپوپتوز در رده سلول سرطان پستان MDA-MB-468

1.مقایسه میزان در صد مرگ سلولی در رده سلول سرطان پستان MDA-MB-468  تیمار شده با عصاره هیدروالکلی گیاه انجدان رومی با سلول های تیمار نشده  در یک الگوی وابسته به دوز  (0؛25؛50؛75؛100 میکروگرم/میلی لیتر) و زمان (24؛48؛72 ساعت)

2.مقایسه در صد القای آپوپتوز در رده سلول سرطان پستان MDA-MB-468  تیمار شده با عصاره هیدروالکلی گیاه انجدان رومی با سلول های تیمار نشده در یک الگوی وابسته به دوز (0؛25؛50؛75؛100 میکروگرم/میلی لیتر) و زمان(24؛48؛72 ساعت)  

3. مقایسه میزان بیان ژن فسفو دی استراز  5 در رده سلول سرطان پستان MDA-MB-468  تیمار شده با عصاره هیدروالکلی  انجدان رومی  با سلول های تیمار نشده

4. مقایسه میزان cGMP  در رده سلول سرطان پستان MDA-MB-468  تیمار شده با عصاره هیدروالکلی انجدان رومی  با سلول های تیمار نشده

مراکز درمانی و داروسازی

سرطان پستان : سرطان پستان ، ناشی از رشد خارج از قاعده سلول‌های غیرطبیعی در پستان است.

فسفو دی استراز 5 : آنزیم های شناخته شده ای هستند که مسئول تجزیه cGMP به 5'- GMP می باشند.

انجدان رومی: انجدان رومی با نام علمی Levisticum officinale از قبیله Apiales و تیره Apiaceae می باشد. این گیاه در جنوب شرق ایران، در کرمان می روید و نام عمومی آن lovage است  می روید . گیاهی است علفی و دارای ساقه ضخیم استوانه است به قطر سه تا چهار سانتیمتر و به ارتفاع یک تا دو متراست. این گیاه برگهایی ضخیم، گوشت دار، برگچه‌هایی با ظاهر لوزی شکل و دندانه‌های نامساوی به رنگ سبز تیره و منتهی به دمبرگ استوانه‌ای مشخص دارد.

آپوپتوز: آپوپتوز مرگ فیزیولوژیک سلولی است که در شرایط طبیعی سبب حذف سلول های پیر، آسیب دیده، اضافی و مضر می شود و برای تکامل و هوموستاز بافتی ضروری است .

مداخله ای  invitro

سلولهای ردهMDA-MB-468  در محیط کشت RPMI

در پلیت با 96 چاهک که برای هر چاهک 5000 سلول MDA-MB-468 در حجم 200 میکرولیتر از محیط کشت

ندارد

جهت بررسی میزان مرگ سلولی رده MDA-MB-468  تیماره شده با عصاره هیدروالکی گیاه انجدان رومی از تست MTT استفاده خواهد شد .

جهت بررسی میزان آپوپتوز رده MDA-MB-468  تیماره شده با عصاره گیاه هیدروالکلی انجدان رومی از کیت انکسین و با استفاده  از دستگاه  فلوسیتومتری انجام خواهد  شد.

جهت بررسی میزان بیان ژن فسفودی استراز 5 از تکنیک Real-Time PCR استفاده خواهد شد.

جهت بررسی میزان cGMP درون سلولی با استفاده از کیت R&D  بر طبق دستور کار کیت  استفاده  خواهد  شد.

گیاه انجدان رومی که توسط مرکز پژوهشی گیاهان دارویی و زینتی دانشگاه سیستان و بلوچستان مورد شناسایی قرار گرفت. با استفاده از دستگاه سوکسله عصاره هیدروالکلی گرفته خواهد شد به صورتی که قسمت های هوایی این گیاه ابتدا آسیاب شده، سپس به مقدار 20 گرم از گیاه مربوطه درون محفظه شیشه ای دستگاه سوکسله قرار داده شده و برای تهیه عصاره 300 میلی لیتر الکل 70 % به آن اضافه می شود. سپس جهت تبخیر حلال از دستگاه Freeze Dryer بعد از بهینه سازی شرایط دما و فشار عمل تبخیر حلال انجام می شود.

سلول های MDA-MB-468 در محیط کشت RPMI1640 وتحت شرایط  CO2 5% در انکوباتور و دمای 37 درجه سانتی گراد  قرار داده می شوند. و پس از پاساژ ، سلول ها برای تیمار با عصاره هیدرو الکلی گیاه انجدان رومی آماده می شوند.

 سنجش مرگ سلولی با استفاده ازMTT assay:

سلول ها به دو گروه تیمار شونده و بدون تیمار تقسیم می شوند و سلول های MDA-MB-468  در غلظت (0؛25؛50؛75؛100 میکروگرم/میلی لیتر) و زمان های مختلف (24؛48؛72 ساعت) تیمار می شوند تا دوز موثر بر مرگ سلولی مشخص شود. برای این کار از تست MTT استفاده می شود بدین صورت که :

 MTT نمک زرد تترازولیوم محلول در آب است که توسط سوکسینات دهیدروژناز میتوکندری های سلولهای زنده و فعال، احیا و به ترکیب رنگی فورمازان نامحلول تبدیل می شود که این رنگ با حلال آلی حل میگردد. شدت رنگ حاصله در طول موج 570 نانومتر متناسب با میزان سلولهای زنده است.

در این روش ابتدا سلول های موجود در فلاسک تریپسینه شده و پس از شمارش سلولی، سلول ها به پلیت 96 تایی منتقل شدند. به هر چاهک پلیت 96 تایی 200 میکرولیتر محیط کشت کامل همراه با سلول افزوده می شود. سپس سلول ها به مدت 24 ساعت در این شرایط انکوبه می شوند تا سلول ها کاملا به کف ظرف چسبیده و در فاز رشد لگاریتمی قرار گیرند. پس از این زمان، محیط کشت چاهک ها تخلیه شده و محیط کشت حاوی غلظت های مختلف تیمار مورد نظر به آن اضافه می شود. پس از زمان مورد نظر (24،48و72 ساعت) ،به هر چاهک 20 میکرولیتر محلول MTT اضافه و به مدت 4 ساعت در انکوباتور انکوبه می شود. سپس محیط با سرنگ و سوزن به دقت خارج شده و به هر چاهک 200 میکرولیتر DMSO افزوده می شود و سپس میزان جذب نمونه ها در طول موج 570 نانومتر توسط دستگاه الایزا ریدر خوانده می شود. میزان جذب به طور مستقیم با تعداد سلول های زنده متناسب است. نتایج بر حسب درصد سلول های زنده نسبت به کنترل از رابطه زیر محاسبه می گردد:

درصد سلول های زنده= (میانگین جذب سلول های تیمار شده/ میانگین جذب سلول های شاهد) ×100

برای هر کدام از گروه های  کنترل و تیمار (با غلظت های متفاوت )حداقل سه چاهک در نظر می گیریم تا میانگین جذب  بدست اید و حداقل تست MTT سه بار جهت تایید  نتایج تکرار می شود .

بررسی آپوپتوز: بررسی آپوپتوز با استفاده از روش Flow Cytometry: استفاده از فلوسایتومتری روش متداول در آنالیز سلولها از لحاظ آپوپتوز و تعیین درصد سلول های آپوپتوزی می باشد. در این مرحله از کیت تشخیص آپوپتوز Annexin  استفاده خواهد شد.

به منظور بررسی بیان ژن٬ابتدا mRNA از سلول با استفاده از کیت اختصاصی تخلیص می شود، پس از تخلیص با استفاده از کیت اختصاصی٬ cDNA ساخته می شود. سپس با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن مورد نظر و تکنیک Real-time PCR بیان نسبی ژن  فسفو دی استراز 5 در مقایسه با  House keeping gene برای هر نمونه محاسبه می شود

میزان cGMP درون سلولی با استفاده از کیت R&D  بر طبق دستور کار کیت اندازه گیری می شود .

به منظور تجزیه و تحلیل داده ها از آزمون واریانس دو طرفه ANOVA  و Post Hoc Tukey استفاده خواهد شد. نتایج به صورت Mean ± SD گزارش می شود و p<0.05 معنی دار در نظر گرفته می شد.

راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی

در جمهوری اسلامی ایران

1- پژوهشگر باید به این امر مهم توجه داشته باشد که بافت‌ها و اعضای مورد استفاده، دارای منشأ انسانی‌اند و کرامت انسانی اقتضا می‌کند که جمع‌آوری، نگه‌داری، استفاده و نابودسازی آن‌ها توأم با رعایت ملاحظات و شؤون مرتبط باشد.

2- از اجزای بدنی دارای منشأ انسانی باید تنها در پژوهش‌هایی استفاده شود که اهداف ارزشمندی را در راستای مبارزه با بیماری‌ها و ارتقای سلامت انسان‌ها دنبال می‌کنند.

3- تمامی پژوهش‌ها بر روی عضو و بافت انسانی، پیش از اجرا، باید مورد تأیید کمیته‌ی اخلاق در پژوهش مرتبط قرار گیرد. کمیته‌ی اخلاق در پژوهش حق دارد که در تمامی مراحل پژوهش بر آن نظارت داشته باشد. پژوهشگران باید در این زمینه با کمیته‌ی اخلاق در پژوهش همکاری کنند.

4- رضایت آگاهانه‌ی فرد دهنده‌ی عضو یا بافت، یا جانشین قانونی او، شرط اساسی در تأیید اخلاقی هر پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی است. رضایت‌نامه باید با رعایت تمامی اصول مرتبط تهیه و هنگام ارسال طرح‌نامه برای تصویب، به آن پیوست شده باشد.

5- در مواردی که اخذ رضایت آگاهانه از دهنده‌ی نمونه‌ی ذخیره‌شده یا جانشین قانونی او امکان‌پذیر نباشد، به‌شرط وجود رضایت کلی اولیه بر استفاده‌ی پژوهشی، در صورت تأیید کمیته‌ی اخلاق در پژوهش می‌توان از آن نمونه برای پژوهش استفاده کرد. در چنین مواردی باید از نمونه‌هایی استفاده شود که به ‌نحو برگشت‌ناپذیر بی‌نام ‌شده باشد. ‌

6- تمامی اطلاعاتی که از صاحبان عضو یا بافت مورد پژوهش، جمع‌آوری و ثبت می‌شود، راز حرفه‌ای تلقی می‌‌شود؛ از این ‌رو، تمامی اصول و ملاحظات مربوط به رازداری و حفظ حریم شخصی، باید در مورد آن‌ها مراعات شود.

7- مرکز انجام دهنده‌ی پژوهش بر روی عضو و بافت باید مهارت و امکانات لازم برای حفظ رازداری را داشته باشد؛ در غیر این صورت، اطلاعات باید به شکل بی‌نام و غیرقابل ردیابی ثبت و ذخیره شود.

8- پژوهشگر باید از اعضاء و بافت‌هایی که به منظور پژوهش در اختیار او قرار می‌گیرد استفاده‌ی بهینه کرده، از هدر رفتن آن‌ها جلوگیری کند

9- پژوهشگر موظف است که تمهیدات لازم ایمنی، از جمله آزمون‌های غربالگری و وسایل محافظت‌کننده را برای جلوگیری از انتقال آلودگی از اجزای بدنی مورد استفاده به هر فرد دیگر، اعم از پژوهشگران، آزمودنی‌ها یا سایر افرادی که در فرایند پژوهش با این مواد سروکار خواهند داشت، پیش‌بینی و تأمین کند.

10- پژوهش بر روی عضو و بافت ممکن است به ایجاد روش‌ها و محصولاتی منجر شود که به استفاده‌ی تجاری از آن‌ها بینجامد. حقوق مالکیت معنوی نتایج حاصل از این‌گونه پژوهش‌ها باید مورد تأیید و حمایت قرار گیرد. احتمال استفاده‌ی تجاری از نتایج پژوهش و اشخاصی که احتمالاً از آن منتفع خواهند شد باید در رضایت‌نامه‌آورده شود.

11- زمان، نحوه و میزان اطلاع آزمودنی‌ها از نتایج پژوهش باید در رضایت‌نامه آورده شود. در هر حال، آزمودنی یا نماینده‌ی قانونی او باید به تمامی اطلاعاتی که در طول پژوهش درباره‌ی او به‌دست می‌آید، دسترسی داشته باشد.

12- در صورت کمبود بافت یا عضو، باید استفاده‌های درمانی بر استفاده‌های پژوهشی اولویت داده شود. 

- زیست‌بانک‌ها

1- ذخیره‌سازی اعضاء، بافت‌ها یا اجزای بدنی با منشأ انسانی باید با اخذ رضایت آگاهانه باشد. در رضایت‌نامه باید نحوه و مدت نگه‌داری و استفاده‌های احتمالی آتی آورده شود.

2- فرد حق دارد هر وقت که بخواهد درخواست کند که نمونه‌هایش از زیست‌بانک خارج شوند. این در صورتی است که هویت دهنده ی نمونه مشخص یا قابل ردیابی باشد.

3- در صورتی که هویت فرد دهنده‌ی نمونه، مشخص یا قابل ردیابی باشد، برای هر پژوهش جدید باید از فرد یا نماینده‌ی قانونی او رضایت آگاهانه گرفته شود.

4- در مورد نمونه‌هایی که هویت دهنده‌ی آن‌ها قابل ردیابی نباشد، می‌توان با استناد به رضایت‌نامه‌ی کلی اولیه، پژوهش‌های جدید را بدون اخذ رضایت‌نامه انجام داد.

5- در استفاده از بافت‌های ذخیره شده در زیست‌بانک‌ها - در صورتی که امکان استفاده‌ی درمانی و پژوهشی وجود داشته باشد - باید اولویت به مصارف درمانی داده شود. در هر حال، انجام پژوهش نباید به میزان و کیفیت استفاده‌های درمانی لطمه‌ای وارد کند.

تاخیر در دریافت لوازم کشت و کیت ها و برای رفع مشکل باید ثبت سفارش از قبل انجام شود

Breast cancer, Levisticum ,phosphodiesterase 5, apoptosis,

1.    Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2015. CA: a cancer journal for clinicians. 2015;65(1):5-29.

2.    Tao Z, Shi A, Lu C, Song T, Zhang Z, Zhao J. Breast cancer: epidemiology and etiology. Cell biochemistry and biophysics. 2015;72(2):333-8.

3.    Kelsey JL, Gammon MD. The epidemiology of breast cancer. CA: a cancer journal for clinicians. 1991;41(3):146-65.

4.    Trinh T, Christensen S, Brand J, Cuzick J, Czene K, Sjölander A, et al. Background risk of breast cancer influences the association between alcohol consumption and mammographic density. British journal of cancer. 2015;113(1):159-65.

5.    Nowikiewicz T, Kurylcio A, Polkowski W, Zegarski W. Imaging methods for the local lymphatic system of the axilla in early breast cancer in patients qualified for sentinel lymph node biopsy. Przegla̜d Menopauzalny= Menopause Review. 2016;15(1):52.

6.    Russo J, Rivera R, Russo IH. Influence of age and parity on the development of the human breast. Breast Cancer Res Treat. 1992;23(3):211-8.

7.    Schwarts SI. Principles of surgery. 6 ed. New York: McGrow Hill Company; 1994. 531-93 p.

8.    Townsend CM, Jr. Treatment of breast cancer. Clin Symp. 1997;49(1):1-32.

9.    Newman DJ, Cragg GM, Snader KM. Natural products as sources of new drugs over the period 1981-2002. Journal of natural products. 2003;66(7):1022-37.

10.   Hashemi M, Nouri Lang M, Entezari M, Nafisi S, Nowrouzi H. Evaluation of induced apoptosis of apigenin in 3 lines of human B cell lymphoma in vitro. 2. 2009;19(2):87-92.

11.   Aggarwal BB, Sundaram C, Malani N, Ichikawa H. Curcumin: the Indian solid gold. Advances in experimental medicine and biology. 2007;595:1-75.

12.   Liamarkopoulos E, Gazouli M, Aravantinos G, Tzanakis N, Theodoropoulos G, Rizos S, et al. Caspase 8 and caspase 9 gene polymorphisms and susceptibility to gastric cancer. Gastric cancer : official journal of the International Gastric Cancer Association and the Japanese Gastric Cancer Association. 2011;14(4):317-21.

13.   زاده خ, ارانی ع, آروئی, فارسی. اثر تیمارهای ضدعفونی سطحی و چینه سرمایی بر جوانه زنی بذر انجدان رومی تحت شرایط درون شیشه ای. علوم باغبانی. 2013;27.

14.   Reza VRM, Abbas H. The essential oil composition of Levisticum officinalis from Iran. Asian J Biochem. 2007;2:161-3.

15.   امید ح, محمدکاظم س, احمد ا, محمدتقی ع. آنالیز و مقایسه اسانس گل و میوه در گیاه دارویی انجدان رومی (Levisticum officinale Koch. Cv. Budakalaszi).

16.   Schenk RU, Hildebrandt A. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Canadian Journal of Botany. 1972;50(1):199-204.

17.   Taylor RC, Cullen SP, Martin SJ. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nature reviews Molecular cell biology. 2008;9(3):231-41.

18.   Sorisky A, Magun R, Gagnon A. Adipose cell apoptosis: death in the energy depot. International Journal of Obesity & Related Metabolic Disorders. 2000;24.

19.   Lopez J, Tait S. Mitochondrial apoptosis: killing cancer using the enemy within. British journal of cancer. 2015;112(6):957-62.

20.   ZHANG JH, Ming X. DNA fragmentation in apoptosis. Cell research. 2000;10(3):205-11.

21.   Friedlander RM. Apoptosis and caspases in neurodegenerative diseases. New England Journal of Medicine. 2003;348(14):1365-75.

22.   Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic pathology. 2007;35(4):495-516.

23.   Fulda S, Debatin K. Extrinsic versus intrinsic apoptosis pathways in anticancer chemotherapy. Oncogene. 2006;25(34):4798-811.

24.   Maurice DH, Ke H, Ahmad F, Wang Y, Chung J, Manganiello VC. Advances in targeting cyclic nucleotide phosphodiesterases. Nature reviews Drug discovery. 2014;13(4):290.

25.   Lugnier C. Cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE) superfamily: a new target for the development of specific therapeutic agents. Pharmacol Ther. 2006;109(3):366-98.

26.   Corbin JD, Francis SH. Cyclic GMP phosphodiesterase-5: target of sildenafil. J Biol Chem. 1999;274(20):13729-32.

27.   Zhang KY, Card GL, Suzuki Y, Artis DR, Fong D, Gillette S, et al. A glutamine switch mechanism for nucleotide selectivity by phosphodiesterases. Molecular cell. 2004;15(2):279-86.

28.   Puzzo D, Sapienza S, Arancio O, Palmeri A. Role of phosphodiesterase 5 in synaptic plasticity and memory. Neuropsychiatric disease and treatment. 2008;4(2):371.

29.   Piazza GA, Keeton AB, Tinsley HN, Whitt JD, Gary BD, Mathew B, et al. NSAIDs: old drugs reveal new anticancer targets. Pharmaceuticals. 2010;3(5):1652-67.

30.   Tiwari AK, Chen Z-S. Repurposing phosphodiesterase-5 inhibitors as chemoadjuvants. Frontiers in pharmacology. 2013;4.

31.   Shi Z, Tiwari AK, Ashby Jr CR, Chen Z-S, Fu L-W. Anti-cancer Role of Phosphodiesterase-5 Inhibitors.

32.   Peak TC, Richman A, Gur S, Yafi FA, Hellstrom WJ. The Role of PDE5 Inhibitors and the NO/cGMP Pathway in Cancer. Sexual Medicine Reviews. 2016;4(1):74-84.

33.   Fallahian F, Karami‐Tehrani F, Salami S, Aghaei M. Cyclic GMP induced apoptosis via protein kinase G in oestrogen receptor‐positive and‐negative breast cancer cell lines. FEBS Journal. 2011;278(18):3360-9.

34.   Barone I, Catalano S, Campana A, Giordano C, Gyorffy B, Tarallo R, et al. Expression and Function of Phosphodiesterase Type 5 in Human Breast Cancer Cell Lines and Tissues: Implications for Targeted Therapy. Clinical Cancer Research. 2015:clincanres. 1900.2015.

35.   Sertel S, Eichhorn T, Plinkert PK, Efferth T. Chemical Composition and antiproliferative activity of essential oil from the leaves of a medicinal herb, Levisticum officinale, against UMSCC1 head and neck squamous carcinoma cells. Anticancer research. 2011;31(1):185-91.

36.   Moradalizadeh M, Akhgar M, Rajaei P, Faghihi-Zarandi A. Chemical composition of the essential oils of Levisticum officinale growing wild in Iran. Chemistry of Natural Compounds. 2012;47(6):1007-9.

37.   El-Hamid SA, Abeer Y, Hendawy S. Anti-inflammatory, antioxidant, anti-tumor and physiological studies on Levisticum officinale-Koch plant. Planta Medica. 2009;75(09):PE62.

38.   Bogucka-Kocka A, Smolarz H, Kocki J. Apoptotic activities of ethanol extracts from some Apiaceae on human leukaemia cell lines. Fitoterapia. 2008;79(7):487-97.