بررسی اثر عصاره هیدروالکلی انجدان رومی بر الگوی بیان ژن ZNF703و نقش آن در القای آپوپتوز در رده سلول سرطان پستان MCF-7

سرطان پستان بیماری است که در آن سلولهای بدخیم از بافت پستان منشا گرفته و به طور نامنظم و فزاینده ای تکثیر مییابد و بدون اینکه موجب عکس العمل تدافعی و تهاجمی و سیستم ایمنی بدن شوند از سیستم ایمنی و دفاعی بدن عبور می کنند.سرطان پستان اکثر اوقات بصورت یک توده ی بدون درد و سفتی در قسمت فوقانی و خارجی پستان شروع میشود و بطور کلی میتواند در هر جایی از پستان از جمله نوک آن ایجاد گردد،سرطان پستان ممکن است به غدد لنفاوی ناحیه گودی زیر بغل و بعد از آن در سر تا سر بدن گسترش پیدا  کند(1).سرطان پستان به عنوان دومین سرطان کشنده در میان زنان آمریکایی و نیز اولین سرطان کشنده در میان زنان اروپایی شناخته شده است(2و3).و دومین عامل شایع مرگ و میر پس از بیماریهای قلبی و عروقی در کشورهای کمتر توسعه یافته بشمار میرود(4).به طوری که سالانه بیش از 50200 زن در جهان به علت ابتلا به این سرطان جان خود را از دست میدهند(5).           
روشهای تشخیصی:اگرچه شایعترین و قطعی ترین روش تشخیص سرطان پستان،بیوپسی توده پستانی و تشخیص ضایع با روشهای معمول آسیب غدد بافتی میباشد(6)در مقاطع مختلف زمانی روشهای مختلف پرتونگاری[سنوگرافی،ماموگرافی]و سیتولوژی ابداع و کارایی آنها در این راستا مورد تحقیق و پژوهش قرار گرفته است (7).
روشهای درمانی:برای فردی که سرطان پستان دارد راههای درمانی شامل جراحی،اشعه درمانی،هورمون درمانی و شیمی درمانی که بستگی به مرحله بیماری از یک یا چند مرحله درمانی استفاده می شو د(8).بنابر این با در نظر گرفتن عدم پاسخ مطلوب به درمان و رشد سریع بیماری تلاش برای تهیه داروهایی با کارایی بیشتر و سمیت کمتر ضروری است (9). در سالهای اخیر استفاده از داروهای گیاهی برای پیشگیری و درمان سرطان مطرح شده است،در این روش نه تنها سلولهای توموری کنترل می شود بلکه به سلول سالم نیز آسیب نمی رساند (10).هدف اصلی از درمان سرطان توسط مواد طبیعی و شیمیایی کند کردن یا مهار فرایند سرطان زایی میباشد،این نگرش بطور هدفمند روی مسیرهای سیگنالینگ  سلول متمرکز می باشد(11).

اپوپتوز:نوعی مرگ سلولی است که در پاسخ به عامل های تنش زای گوناگونی در بدن رخ می دهد(12).اپوپتوز در مراحل متفاوت تکامل زیستی یک موجود زنده ایفای نقش کرده و اگر از تنظیم خارج شودبیماریهای گوناگونی را موجب میشود.برای نمونه فعالیت بیش از حد اپاپتوز سبب بیماریهای دژنره کننده مانند الزایمر و پارکینسون می گردد(13).از سوی دیگر چنان چه فعالیت کاهش یابد سلول به سمت سرطانی شدن پیش می رود(14).مشخص شده است که این پدیده یک مرحله فعال و وابسته به انرژی در سلول بوده و سلولهایی که دچار مرگ برنامه ریزی شده می شوند دارای شاخص های ویژه ای هستند برای مثال غشای سلول دست نخورده باقی می ماند.DNA به صورت اینترنوکلئوزمی با الگویی خاص نردبانی قطعه قطعه می شود و غشا و محتویات درونش به شکل حباب در اختیار سیستم بیگانه خواری قرار می گیرد(15).

درانسان اپوپتوز دارای مسیر بیرونی یا وابسته به میتوکندری می باشد که در هر کدام از این مسیرها کاسپازهای مختلفی دخالت دارند.کاسپازها جزو خانواده سیستئین –اسپارتات پروتئازها و واسطه ی مهم برای روند اپوپتوز می باشد(16).مسیر خارجی اپوپتوز از طریق گیرندهای مرگ FAS,TNF منجر به فعال شدن کاسپاز8 می شود.کاسپاز 8 فعال شده می تواند یه طور مستقیم کاسپازهای اجرایی از جمله کاسپاز 3 را فعال کند(17).مسیر داخلی یا میتوکندریایی با بهم خوردن نفوذپذیری غشا میتوکندری و ازاد شدن شماری از مولکولهای موجود در غشا میتوکندری مانند سیتوکرمC باعت فعال شدن کاسپاز9 می شود و در نهایت باعت فعال شدن کاسپازهای اجرایی مانند کاسپاز3 میشوند(18).

 گیاه انجوان رومی با نام علمی Levisticum officinale  بوته استوار و چند ساله از تیره چتریان Apiaceaeگونه ای مهم و در عین حال فراموش شده ای از گیاهان بومی ایران است که در جنوب شرق ایران (کرمان،شیب جنوبی کوه هراز با ارتفاع 3200 متر از سطح دریا )رویش دارد،ارتفاع گیاه 20تا30 سانتیمتر است،برگهای سبز تیره درخشان با سطح تحتانی کمرنگ با دمبرگ بلند و سطحی صاف و براق هستند(19).ریشه،میوه،برگ و حتی پیکر رویشی این گیاه خاصیت دارویی دارد.ریشه و اندام هوازی این گیاه حاوی اسانس می باشد که مقدار اسانس در قسمتهای مختلف گیاه متفاوت می باشد،مواد تشکیل دهنده اسانس را فتالیدها و ترپنوئیدها تشکیل می دهد(20).این گیاه آرامبخش،ضد میکروب،ضد اسپاسم بوده و از ریشه آن برای بهبود عفونتها و التهابهای دستگاه گوارش با دفع سنگ کلیه و مثانه و همچنین جلوگیری از شن سازی کلیه استفاده می شود (21).فلاونوئیدها از فراوانترین ترکیبات فنلی گیاه می باشد که بر تخریب انواع رادیکالهای آزاد اکسید شونده موثر هستند،با توجه به اینکه انجوان رومی حاوی ترکیبات فنلی است بنابر این خاصیت آنتی اکسیدانی آن بدیعی است یکی از مهمترین زمینه های استفاده از ترکیبات آنتی اکسیدانی خاصیت ضد التهابی می باشد(22).
ژنهای زیادی به همراه عوامل محیطی متفاوتی در ایجاد سرطانها دخالت دارند که هر یک نقش مهمی در افزایش خطر ابتلا به انواع سرطان ایفا می کنند(23).تحقیقات نشان میدهد که ژنهایی که در مسیر سیگنالینگ،کنترل چرخه سلولی و متابولیسم هورمونهای استروئیدی وجود دارند با سرطانها ارتباط دارند(24).
پروتئین ZNF703 انسانی که به نام Zpo1 ,lik zink fingr  معروف است عضوی از خانواده ژنهای NET است که ژن آن بر کرموزوم8 بازوی کوچکP12 قرار دارد(25.26).ZNF703 دارای شش دومین است که در مسیر تکاملی حفظ شده اند سه مورد از آنها مختص پروتوئینهایNET هستند(26). یک عامل رونویسی آنکوژن است که بسیاری از ژنهایی را که در فرایند مختلف فنوتیپ سرطان از جمله تکثیر سلولی،افزایش نوسازی سلول و تهاجم نقش دارند را تنظیم می کند (27.28).مطالعات نشان داده که تغییر در میزان بیان ZNF703 می تواند بر میزان بیان ژن سلول اثر گذارد و به آنها اجازه دهد تا از فرایند تکثیر طبیعی سلولی رها یافته و به جای اینکه به سلول بالغ تمایز یابد به سمت تکثیر بی رویه و بدون تمایز پیشروند (29.30)افزایش بیان ZNF703 باعث سرکوب بیانE-cadherin و افزایش متاستاز به ریه می شود(31).کاهش E-Cadherin که عامل چسبیدن سلولهای اپی تلیال طبیعی پستان به هم می شود،باعث افزایش قدرت تکثیر و تهاجم سلولهای سرطانی پستان شده که این امر به نوبه خود تغییرات مزانشیال و متاستاز را به همراه خواهد داشت (32).این موارد نشان میدهد که ZNF703 نقش مهمی در ایجاد و پیشرفت سرطان پستان دارد(33).همچنین دو مطالعه در چین نشان داده که ZNF703 به عنوان یک آنکوژن عمل می کند و باعث تسریع و پیشرفت بدخیمی در سرطان معده و پیش اگهی بد در سرطان کولورکتال می گردد(34).       
بنابر این با توجه به شیوع بالای سرطان پستان در کشورهای در حال توسعه و روند رو به رشد آن در کشور ایران و تهاجمی بودن روشهای درمانی موجود نیاز به استفاده از ترکیبات و روشهای نوین به ویژه از ترکیبات  گیاهی موجود در طبیعت در کنترل و درمان این سرطان بیش از پیش احساس می شود.

از آنجا که فعالیت ژن ZNF703  و بیانش در برخی از رده های سلولهای سرطانی افزایش می یابد هدف این مطالعه  بررسی اثر عصاره هیدرو الکلی انجوان رومی بر الگوی  بیان ژنZNF703 ونقش ان در القای اپوپتوز در رده سلول سرطان پستانMCF-7 می باشد .

بازنگری متون:

1-در مطالعه ای که SERKAN SERTEL و همکارانش در سال( 2011 ) انجام گرفت مشخص گردید اسانس گیاه انجدن رومی اثر بازدارنده بر رشد سلولهای سرطان سنگفرشی سر و گردن[HNSCC]انسانی دارد(35)

2-در مطالعاتی که َA.Bogucka-kocka  وهمکارانش در سال(2008 )جهت ارزیابی فعالیت اپاپتوتیک عصاره Levisticum officinal انجام دادند .مشخص گردید .این گیاه دارای خاصیت  القای اپاپتوتیک بر روی رده سلولهایی لوسمی انسانی دارد(36).

3- در مطالعه ای که خیر اندیش وهمکارش در سال (1393)انجام دادند, پیشنهاد دادند  که  گیاه کرفس کوهی از خانواده چتریان می تواند به عنوان یک گیاه  ضدسرطان برای   سلولهای سرطان سینه MCF-7  در نظر گرفته شود(37).

1. - سئوالات و/ یا فرضیات پژوهش  :

1- درصد القا مرگ سلولی در رده سلول سرطان پستان MCF-7  تیمار شده با عصاره هیدروالکلی  گیاه انجدان رومی در مقایسه با سلول های تیمار نشده در یک الگوی وابسته به دوز (100,75,50,25,0 میکروگرم/میلی لیتر) وزمان(72,48,24 ساعت) متفاوت است.

2-در صد القای آپوپتوز در رده سلول سرطان پستان MCF-7   تیمار شده با  عصاره هیدروالکلی گیاه انجدان رومی  در مقایسه با سلو ل های تیمار نشده دریک الگوی وابسته به دوز (100,75,50,25,0 میکروگرم/میلی لیتر ) و زمان(72,48,24 ساعت) متفاوت است.

3-میزان بیان ژن ZNF703 رده سلول سرطان پستان MCF-7تیمار شده با عصاره هیدروالکلی  گیاه انجدان رومی در مقایسه با سلول های تیمار نشده متفاوت است

تعیین  اثر عصاره هیدروالکلی انجدان رومی بر الگوی بیان  ژنZNF703و نقش آن در القای آپوپتوز در رده سلول سرطان پستان  MCF-7

1-مقایسه  درصد القا مرگ سلولی در رده سلول سرطان پستان MCF-7  تیمار شده با عصاره هیدروالکلی  گیاه انجدان رومی در مقایسه با سلول های تیمار نشده در یک الگوی وابسته به دوز (100,75,50,25,0 میکروگرم /میلی لیتر) و زمان(72,48,24 ساعت ).

2-مقایسه در صد  القای آپوپتوز در رده سلول سرطان پستان MCF-7  تیمار شده با  عصاره هیدروالکلی گیاه انجدان رومی در مقایسه با سلو ل های های تیمار نشده  در یک الگوی وابسته به دوز (100,75,50,25,0 میکروگرم /میلی لیتر) وزمان (72,48,24 ساعت)

3-  مقایسه میزان بیان ژن ZNF703 رده سلول سرطان پستان MCF-7تیمار شده با عصاره هیدروالکلی  گیاه انجدان رومی در مقایسه با سلول های تیمار نشده

مراکز درمانی و داروسازی

دانشگاه علوم پزشکی زاهدان

سرطان پستان :تکثیر غیر کنترلی سلولهایی ابی تلیال بافت بستان
ژنZNF703:یک عامل رونویسی آنکوژن است که بسیاری از ژنهایی را که در فرایند مختلف فنوتیپ سرطان از جمله تکثیر سلولی،افزایش نوسازی سلول و تهاجم نقش دارند را تنظیم میکند.
گیاه انجوان رومی:با نام علمی Levisticum officinale از تیره چتریان Apiaceae میباشد،این گیاه از گیاهان دارویی بومی ایران است که در جنوبشرق ایران[کرمان،شیب جنوبی کوه هراز با ارتفاع 3200 متر از سطح دریا]رویش دارد،با برگهای سبز تیره درخشان با سطح تحتانی کمرنگ با دمبرگ بلند و سطحی صاف و براق میباشد.
 

مداخله ایinvitro

سلولهای رده سرطان پستان MCF-7در محیط کشت RPMI

در پلیت با 96 چاهک که برای هر چاهک 5000 سلول MCF-7 در حجم 200 میکرولیتر از محیط کشت

ندارد

جهت بررسی میزان مرگ سلولی رده MCF-7تیماره شده با عصاره هیدروالکی گیاه انجدان رومی از تست MTT استفاده خواهد شد .

جهت بررسی میزان آپوپتوز رده MCF-7  تیماره شده با عصاره گیاه هیدروالکی انجدان رومی از تست فلوسیتومتری استفاده خواهد شد.

جهت بررسی میزان بیان ژن ZNF703از تکنیک Real-Time PCR استفاده خواهد شد.

- روش اجرای طرح(با جزئیات بطور کامل شرح داده شود):

 گیاه انجوان رومی که توسط مرکز پژوهشی گیاهان دارویی و زینتی دانشگاه سیستان و بلوچستان مورد شناسایی قرار گرفت. با استفاده از دستگاه سوکسله عصاره هیدروالکلی گرفته خواهد شد به صورتی که قسمت های هوایی این گیاه ابتدا آسیاب شده سپس به مقدار 20 گرم از گیاه مربوطه درون محفظه شیشه ای دستگاه سوکسله تحت اثر الکل 70 % جهت عصاره گیری قرار می گیرد. سپس جهت تبخیر حلال از دستگاه Freeze Dryer بعد از بهینه سازی شرایط دما وفشار عمل تبخیر حلال انجام می شود.

 سلولهای MCF-7در محیط کشت   RPMI1640 کشت داده می شوند و در انکوباتور حاوی CO2 5% و دمای 37 درجه سانتی گراد  قرار داده می شوند. و پس از پاساژ ، سلول ها برای تیمار با عصاره هیدرو الکلی گیاه انجوان رومی آماده می شوند.

1-سنجش مرگ سلولی با استفاده ازMTT assay:

سلول ها به دو گروه تیمار شونده و بدون تیمار تقسیم می شوند و سلول های MCF-7  در غلظت(100,75,50,25,0 μg/ml) و زمان های مختلف ( 72,48,24ساعت) تیمار می شوند تا دوز موثر بر مرگ سلولی مشخص شود. برای این کار از تست MTT استفاده می شود بدین صورت که :

MTT نمک زرد تترازولیوم محلول در اب است که توسط سوکسینات دهیدروژناز میتوکندریایی سلولهای زنده وفعال احیا وبه ترکیب رنگی فورمازان نا محلول تبدیل می شود که این رنگ با حلال الی حل میگردد. شدت رنگ حاصله در طول موج 570 نانومتر متناسب با میزان سلولهای زنده است.

در این روش ابتدا سلولهای موجود در فلاسک تریپسینه شده وپس از شمارش سلولی , سلولها به پیلیت 96 تایی منتقل منتقل شدند.به هر چاهک پیلیت 96 تایی 200 میکرولیتر محیط کشت کامل همراه با سلول افزوده می شود. سپس سلولها به مدت 24 ساعت در این شرایط انکوبه می شوند تا سلول ها کاملا به کف ظرف چسبیده ودر فاز رشد لگاریتمی قرار گیرند. پس از این زمان محیط کشت چاهک ها تخلیه شده و محیط کشت حاوی غلظت های مختلف تیمار مورد نظر به ان اضافه می شود . پس از زمان مورد نظر (72,48,24 ساعت) به هر چاهک 20 میکرولیتر محلول MTT اضافه و به مدت 4 ساعت در انکوباتور انکوبه می شود. میزان جذب به طور مستقیم با تعداد سلول های زنده متناسب است.

نتایج بر حسب درصد سلولهای زنده نسبت به کنترل از رابطه زیر محاسبه می گردد:

درصد سلول های زنده= (میانگین جذب سلول های تیمارشده/میانگین جذب سلول های شاهد)

 برای هر کدام از گروههای کنترل و تیمار(با غلظت های متفاوت )حدقل سه چاهک در نظر می گیریم تا میانگین جذب بدست اید وحدقل تستMTT سه بار جهت نتایج تایید تکرار می شود.

2- بررسی آپوپتوز: بررسی آپوپتوز با استفاده از روش Flow Cytometry: استفاده از فلوسایتومتری روش متداول در آنالیز سلولها از لحاظآپوپتوز و تعیین درصد سلول های آپوپتوزی می باشد. در این مرحله از کیت تشخیص آپوپتوز Annexin  استفاده خواهد شد.

بمنظور بررسی بیان ژن٬  ابتدا mRNA از سلول با استفاده از کیت اختصاصی تخلیص می شود، پس از تخلیص با استفاده از کیت اختصاصی٬ cDNA ساخته می شود. سپس با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن مورد نظر و تکنیک Real-time PCR بیان نسبی ژن  ZNF703 در مقایسه با  House keeping gene برای هر نمونه محاسبه می شود

به منظور تجزیه و تحلیل داده ها از آزمون واریانس دو طرفه نان پارامتریکANOVA  و Post Hoc Tukey استفاده خواهد شد. نتایج به صورت Mean ± SD گزارش می شود و p<0.05 معنی دار در نظر گرفته می شد.

راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی

در جمهوری اسلامی

1- پژوهشگر باید به این امر مهم توجه داشته باشد که بافت‌ها و اعضای مورد استفاده، دارای منشأ انسانی‌اند و کرامت انسانی اقتضا می‌کند که جمع‌آوری، نگه‌داری، استفاده و نابودسازی آن‌ها توأم با رعایت ملاحظات و شؤون مرتبط باشد.

2- از اجزای بدنی دارای منشأ انسانی باید تنها در پژوهش‌هایی استفاده شود که اهداف ارزشمندی را در راستای مبارزه با بیماری‌ها و ارتقای سلامت انسان‌ها دنبال می‌کنند.

3- تمامی پژوهش‌ها بر روی عضو و بافت انسانی، پیش از اجرا، باید مورد تأیید کمیته‌ی اخلاق در پژوهش مرتبط قرار گیرد. کمیته‌ی اخلاق در پژوهش حق دارد که در تمامی مراحل پژوهش بر آن نظارت داشته باشد. پژوهشگران باید در این زمینه با کمیته‌ی اخلاق در پژوهش همکاری کنند.

4- رضایت آگاهانه‌ی فرد دهنده‌ی عضو یا بافت، یا جانشین قانونی او، شرط اساسی در تأیید اخلاقی هر پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی است. رضایت‌نامه باید با رعایت تمامی اصول مرتبط تهیه و هنگام ارسال طرح‌نامه برای تصویب، به آن پیوست شده باشد.

5- در مواردی که اخذ رضایت آگاهانه از دهنده‌ی نمونه‌ی ذخیره‌شده یا جانشین قانونی او امکان‌پذیر نباشد، به‌شرط وجود رضایت کلی اولیه بر استفاده‌ی پژوهشی، در صورت تأیید کمیته‌ی اخلاق در پژوهش می‌توان از آن نمونه برای پژوهش استفاده کرد. در چنین مواردی باید از نمونه‌هایی استفاده شود که به ‌نحو برگشت‌ناپذیر بی‌نام ‌شده باشد. ‌

6- تمامی اطلاعاتی که از صاحبان عضو یا بافت مورد پژوهش، جمع‌آوری و ثبت می‌شود، راز حرفه‌ای تلقی می‌‌شود؛ از این ‌رو، تمامی اصول و ملاحظات مربوط به رازداری و حفظ حریم شخصی، باید در مورد آن‌ها مراعات شود.

7- مرکز انجام دهنده‌ی پژوهش بر روی عضو و بافت باید مهارت و امکانات لازم برای حفظ رازداری را داشته باشد؛ در غیر این صورت، اطلاعات باید به شکل بی‌نام و غیرقابل ردیابی ثبت و ذخیره شود.

8- پژوهشگر باید از اعضاء و بافت‌هایی که به منظور پژوهش در اختیار او قرار می‌گیرد استفاده‌ی بهینه کرده، از هدر رفتن آن‌ها جلوگیری کند

9- پژوهشگر موظف است که تمهیدات لازم ایمنی، از جمله آزمون‌های غربالگری و وسایل محافظت‌کننده را برای جلوگیری از انتقال آلودگی از اجزای بدنی مورد استفاده به هر فرد دیگر، اعم از پژوهشگران، آزمودنی‌ها یا سایر افرادی که در فرایند پژوهش با این مواد سروکار خواهند داشت، پیش‌بینی و تأمین کند.

10- پژوهش بر روی عضو و بافت ممکن است به ایجاد روش‌ها و محصولاتی منجر شود که به استفاده‌ی تجاری از آن‌ها بینجامد. حقوق مالکیت معنوی نتایج حاصل از این‌گونه پژوهش‌ها باید مورد تأیید و حمایت قرار گیرد. احتمال استفاده‌ی تجاری از نتایج پژوهش و اشخاصی که احتمالاً از آن منتفع خواهند شد باید در رضایت‌نامه‌آورده شود.

11- زمان، نحوه و میزان اطلاع آزمودنی‌ها از نتایج پژوهش باید در رضایت‌نامه آورده شود. در هر حال، آزمودنی یا نماینده‌ی قانونی او باید به تمامی اطلاعاتی که در طول پژوهش درباره‌ی او به‌دست می‌آید، دسترسی داشته باشد.

12- در صورت کمبود بافت یا عضو، باید استفاده‌های درمانی بر استفاده‌های پژوهشی اولویت داده شود. 

- زیست‌بانک‌ها

1- ذخیره‌سازی اعضاء، بافت‌ها یا اجزای بدنی با منشأ انسانی باید با اخذ رضایت آگاهانه باشد. در رضایت‌نامه باید نحوه و مدت نگه‌داری و استفاده‌های احتمالی آتی آورده شود.

2- فرد حق دارد هر وقت که بخواهد درخواست کند که نمونه‌هایش از زیست‌بانک خارج شوند. این در صورتی است که هویت دهنده ی نمونه مشخص یا قابل ردیابی باشد.

3- در صورتی که هویت فرد دهنده‌ی نمونه، مشخص یا قابل ردیابی باشد، برای هر پژوهش جدید باید از فرد یا نماینده‌ی قانونی او رضایت آگاهانه گرفته شود.

4- در مورد نمونه‌هایی که هویت دهنده‌ی آن‌ها قابل ردیابی نباشد، می‌توان با استناد به رضایت‌نامه‌ی کلی اولیه، پژوهش‌های جدید را بدون اخذ رضایت‌نامه انجام داد.

5- در استفاده از بافت‌های ذخیره شده در زیست‌بانک‌ها - در صورتی که امکان استفاده‌ی درمانی و پژوهشی وجود داشته باشد - باید اولویت به مصارف درمانی داده شود. در هر حال، انجام پژوهش نباید به میزان و کیفیت استفاده‌های درمانی لطمه‌ای وارد کند.

تاخیر در دریافت لوازم کشت و کیت ها و برای رفع مشکل باید ثبت سفارش زود و پیگیری های مربوطه انجام شود

Breast cancer،Levisticum officnale,ZNF703

• 1-Akbare-Irazaghi Z,Homaee F,Khayamzadeh M,Movahedi M,Akbari ME.           

Aranian womane.parity and breastfeeding are preventive measures against       breatscancer:2011:18(1):51-5.

2-Robbins SL,Kumar B.Robbins and cotran pthologic basis ofdisease:       
Saunders-Eiseviers  philadelphia:2010.

3-Kline TS,kline IK,Howell Lp.brest:williams &wilkins:1999.

4-wilson Km,Devinney B,et il.sabatino SA,Lawrence B,Elder R,mercer SL               
effectiveness of interventions to increase screening for brest,cervivcal and colorectel cancer:nine updated systematic teviews for the goide to community prebentive services.american.118-97:(1)43; 'gournal of preventive medicine.2012

5-Izquietdu I,Gispert R,saladie F,espinas G.analisis d li incidrncia,la           
supeivencia y li mortalidad segon las principales localizaciones tumorales,1985-2019:cancer de mama.medicina clinical 2008:131:50-2

.
6-kaufman Z,shpitz V,shapiro M,rona R,lew S,dinbar A.triple approach in the and,diagnosis of dominant brest masses:combined phwsical eyamination,mammography.fine-needll aspiration.gournal of sorgical oncology.1994;56(4):254-7.

7-lamb G,anderson T,dixon M,levack PA.role of fine needle aspiration cytology.in brest cancer screening. Gournal of clinical pathology.1987:40(4);254-7.

 8-Blum JI,Dieras V,Russo L,Mucci P,Horton J,Rutman O,et al.Multicenter,

Phase II study of capecitabine in taxane-pretreated metastatic breast carcinoma patients.cancer.2001;92(7):1759-68.

9-Newman DJ, Cragg GM, Snader KM. Natural products as sources of new drugs over the period 1981-2002. Journal of natural products. 2003;66(7):1022-37.

10-Hashemi M, Nouri Lang M, Entezari M, Nafisi S, Nowrouzi H. Evaluation of induced apoptosis of apigenin in 3 lines of human B cell lymphoma in vitro. 2. 2009;19(2):87-92.

11-Aggarwal BB, Sundaram C, Malani N, Ichikawa H. Curcumin: the Indian solid gold. Advances in experimental medicine and biology. 2007;595:1-75.

12-Reed JC.Apopotosis-based therapies. Nature rwviewe Drug discovery. 2002;1(2);111-21.

13-offen D,Eikon H,Melamed E,Apopotosis as a general cell death pathway in neurode generative diseases. Gournal transmission sapplementam,200(58);153-66.

14-Mahmood Z,shukiay.Death receptor;targets for cancer therapy. Experimental cell research.2010;316(6);1889-99.

15-Leist M,jaattela M,four death and a funeral ;from caspases to alternative mechanisms. Nature reviews molecular cellbiology.2001;2(8);651-52.

16-Francis SH,turko IV. Corbin JD.cyclic nuceotid phosphodesterases;relating struture and function,prog nuclic acid Res molbiol 2001;65;1-52.

17-Lugnier C.cyclic nucieotide phosphodesterase(PDE) superfamily;a new target for the developpment  of specific thraprapeutic agents .pharmacol ther2006 mar;109(3);366-98.

1999MAY14;274(20);13729-32.

18-corbin JD, francis SH,cyclic GMP phosphodiesterase-5 ;target of sidenal,J biochem 1999 may 14;274(20);13729-32.

19اترتیمارهای ضدعفونی سطحی و چینه سرمایی بر جوانه زنی بذر انجوان رومی در شرایط درون شیشه ای :راحله خطیب زاده-مجید عزیزی-حسین ارویی-محمد فارسی نشریه علوم باغبانی جلد27 .شماره2.سال1392.ص138-120.

20-:مطالعه اتر ریز نمونه وسطوح تنظیم کنندهایی رشد بر کانالزایی در گیاه دارویی انجوان رومی در محیط کشت

MSتغییر یافته.      

فصلنامه علمی-بزوهشی تحقیقات گیاهی دارویی ومعطر ایران:1392 ص.138-.120.

21- امید بیگی-تولیدو فراوریی گیاهان دارویی جلدسوم.انتشارات استان قدس رضوی.چاب چهارم(1385).297

22-رضایی.م.برسی روشهایی استخراج و شناسایی انتی اکسیدانهایی کرفس کوهی.بیست و یکمین کنگره ملی علوم و غذایی ایران.دانشگاه شیراز 7تا9ابان1393

23-Etebary M,Jahanzadeh I,Mohagheghi M,Azizi E,Immunohisochemical analasis of P53 and its

correlation to the other prognostic factor in breast cancer.Acta Medica Iranica.2002;40(2):88-94.

24-Easton DF,pooley KA,Dunning AM,Pharoah PD,Thompson D,Ballinger DG,et al.Genome-wide association study identifies novel breast cancer susceptibility ioca.Nature.2207;447(7148):1087-93

25-J.Brown,S.Dutta,K.Bharti et al ,Expression profiling during ocular deveiopment identifies 2 Nlz gemes with a critical role in optic fissure closure ,proceeding of american,vol.106,no.5,pp.1462-1467,2009.

26-Pereira-castor I,costa AM,oliveira MJ,barbosa I,rocha AS,Azevedo L,and da costa LT;characterization of human NLZI/ZNF703 identifies conserved domains essential for proper subcellular localization and transcriptional repression.J cell biochem. 114;120-133.(2013).

27-sircoulomb F,nicolas N,ferrari A,et at.ZNF703 gene amplification at 8p12 specifies luminal B breast cancer .EMBO.MOL med 3;153-166,2011.

28-slorach EM,chou J,werb Z, zeppoI is a novel metastasis promotor that represses E-cadheren expression and regulates p120-catenin isofrom expression and localizition genes Dev 25:.471-484,2011.

29-Holland.DG,Burleigh A.Git,M.A.Goldgraben,P.A.prrez-mancer,S.F.chin,et al.ZNF703 is a common luminal B breast cancer oncogene that differentially regulates luminal and basal progenitors in human mammary epithelium.EMBO Mol.Med3:167-180,2011.

30-sircouiomd F,Nicolas N,ferrari A.finetti P,Bekhouche I,,et at .ZNF703 gene amplification at 8p12 specifies luminal B cancer. EMBO,Mol.Med.3;153-166,2011.

31-slorach E.M.chou J.Werb Z.Zepp o1 is a novel metastasis promoer that represses E-cadherin expression and regulates p120-catenin isoform expression and localization .genes Dev.25;471-484.2011

32-Anderews,J.L,A.C.Kim,and J.R.hens.the role and function of cadherins in the mammary gland breast cancer Res(2012).14;203.

33-perou,C.M.,T.sorlie,M.B.Eisen,M.van de Riin ,S.S. Jeffrey,C.A.Rees,et al.Molecular portraits of human breast tumours. Nature(2000); 406;747-752.

34-Kwek,S.S.,R.Roy,H.zhou,J.Climent,J.A.Martinez-Climent,J.Fridiyand,et al. co-amplified genes at 8p12 and 11q13 in breast tumor cooperate with two major pathways in oncogenesis.28;1892-1903.2009

35-Serkan Sertel,TOLGA EICHHORN,PETER K.PLINKERT and THOMAS EFFERTH.chemical comoposition and antiproliferative activity of essential oil from the leaves of a medicinal herb,leevisticum offcinale,against UMSCC1 head and neck squamous carcinoma cells.

ANTICANCER RESEARCH 2011;31:185-19.

36-A.BOgucka-Kocka,H.D.Smolarz,J.Kocki .Appoptotic activities of ethanol extracts from some Apiaceae on human leukaemia cell lines.Fitorerapia.2008;79(7)487-97.

37-ملیحه خیر اندیش.ماندانا بهبهانی:برسی تاتیر سمیت گیاه کرفس کوهی رویش یافته در دو منطقه کئوهرنگ وفریدشهر بررده سلول سرطان سینه انسانی Mcf7و

سلولهای تک هسته یی خون محیطی انسان :جلد3وشماره4-(11-1393).