بررسی پلی مورفیسم‌های ژنی (Interleukin-1 Receptor Antagonist (IL1RN), Interleukin-4 Receptor Antagonist (IL4RN), Interleukin-18 in (-137 C/G ,-607 A/C), CD14 (-159C/T در بیماران مبتلا به عفونت مزمن ویروس هپاتیت B و مقایسه آن با افراد سالم

ویروس هپاتیت (HBV) B یک DNA ویروس است که از طریق روابط جنسی، خون و همچنین از مادر به جنین انتقال می‌یابد (1). هپاتیت به دسته گسترده ای از اختلالات بالینی- پاتولوژیکی اطلاق می شود که از تخریب کبد به علت عوامل ویروسی، سمی ، دارویی، بیماریها و یا تهاجم سیستم ایمنی به کبد بوجود می‌آیند. این بیماری از لحاظ بالینی به دو صورت حاد و مزمن بروز می‌کند. داروهایی نظیر متیل دوپا، ایزونیازید و آمیودارون و بیماریهایی نظیر ویلسون از علل ایجاد هپاتیت هستند. یکی از انواع هپاتیت، نوع ویرال است و تاکنون 6 ویروس هپاتیت شامل G و E، D،  C،B ،A شناخته شده اند (2). ویروس hepatitis B(HBV)، متداولترین علت بروز بیماری‌های حاد و مزمن کبدی در سراسر جهان خصوصا آسیا وآفریقا می‌باشد که تخمین زده شده است که بیش از 350 میلیون نفر در سراسر جهان حامل این ویروس می‌باشند. در حال حاضر hepatitis B یکی از مشکلات عمده سلامت در کشور ما می باشد و نزدیک به 2 الی 7 درصد افراد جامعه به نوعی با این بیماری درگیر هستند. بسیاری از مطالعات نشان داده‌اند که ویروس هپاتیت B بطور مستقیم برای هپاتوسیت‌های آلوده، کشنده (سیتوپاتیک) نیست و سیستم ایمنی در آن موثر است. این ویروس از سیستم ایمنی ذاتی فرار می‌کند و سیستم ایمنی اکتسابی نقش عمده‌ای در پاتوژننز بیماری و پاکسازی ویروس دارد (3). یکی از مطالعات مولکولی تاثیرگذار در یافتن ژن دخیل در فرایند این بیماری، بررسی پلی‌مورفیسم تک نوکلئوتیدی، به عنوان یک نشانگر است. در صورتی که فراوانی این نشانگر در جمعیت بیماران نسبت به جمعیت افراد سالم به میزان معنی‌داری بیشتر باشد، می‌توان گفت که نشانگر مورد نظر با بیماری ارتباط دارد (4). ایران جزو کشورهای با آلودگی خفیف تا متوسط (International Endemicity) است که شیوع سرمی عفونت HBV 35 درصد و نسبت جمعیت ناقل مزمن 5-1.7 درصد است (5). منشاء و زمان کسب عفونت نیمی از افراد ایرانی آلوده به HBV در دوران نوزادی و از مادران ناقل مزمن بوده (5) و حدود 56-51 درصد بیماران سیروتیک ایرانی شواهد عفونت مزمن HBV را دارند (6).

همچنین مطالعا ت ژنتیکی بر روی حاملین متعدد مشخص کرده اند که ژن های آنتی ژن لکوسیت انسان HLA) ) و ژن های سیتوکین های مختلف نظیر:  (TNF- Alpha, TNF-gamma,  IL-12,  IL-18, TGF-beta,  IL-10,  IL-1,  IL-4) با حساسیت به HBV یا دوام آن و یا شدت بیماری مرتبط هستند. سیتوکین ها نقش مهمی را در دفاع در برابر عفونت ویروسی ایفا می کنند،

IL-1 نیز یکی از سیتوکین ها می‌باشد که از مهمترین عوامل پیش التهابی به شمار می رود و نقشی مرکزی در التهاب و در انهدام ویروسی دارد (7و8). مهمترین اعضای خانواده IL-1 شاملIL-1alpha, IL-1beta, IL-1RN) )می باشند که همگی پلی مورفیک هستند. این پلی مورفیسم ها در نواحی تنظیمی ژن ها قرار دارند و اهمیت عملکردی بالقوه ای در تنظیم تولید پروتئین IL-1 دارند و با گسترش برخی بیماری ها مرتبط هستند (9و10). در مطالعاتی که بر روی بیماران مبتلا به hepatitis Bدر ژاپن صورت گرفته مشخص شده است که ارتباطی بین پلی مورفیسم های IL-1beta و سیروز مرتبط با hepatitis B وجود دارد. در مطالعه دیگری که در همین کشور صورت گرفته مشخص شده است که پلی مورفیسم های این ژن ممکن است با پیش بینی ریسک بیماری هایی با اساس التهابی مرتبط باشند. در زمینه پلی مورفیسم های ژن IL-1RN نیز برخی مطالعات بیان می دارنــــد که افـــــراد با آلل 2 اینترون ژن   IL-1RN  ممکن است به عفونت HBV مقاوم باشند (12و11). در مورد ارتباط پلی مورفیسم های ژن  IL-1alphaبا این بیماری نیز ظاهرا مطالعه ای صورت نگرفته است.

IL-4  از سیتوکین های اصلی دستگاه ایمنی در فعال سازی لنفوسیت های B برای تولید پادتن است. از سوی دیگر این سیتوکین اثر مهاری مهمی بر عملکرد لنفوسیت های T سیتوتوکسیک و سلول های NK به عنوان دو سلول اصلی و مهم در مبارزه با عفونت های ویروسی دارد (13) ، بنابراین هر تغییر ژنتیکی مؤثر بر بیان و عملکرد این سیتوکین می تواند بر نوع و قدرت پاسخ های ایمنی سلولی در برابر HBV نیز تأثیر بگذارد.

Cui و همکاران نشان دادند که هر چند برخی پلی مورفیسم های IL4 مانند rs2243250 و rs2070874 با پاسخ بالا به واکسن هپاتیت B مرتبط اند ولی هیچ ارتباطی بین پلی مورفیسم ژنتیکی IL4  و استعداد ابتلا به عفونت HBV وجود ندارد (14).

در مطالعه ی دیگر Napoli و همکاران نشان دادند که بیان پایین IL4 با آسیب کبدی پیشرونده در عفونت هپاتیت C مزمن ارتباط دارد (15).

اینترلوکین 18 به عنوان یک سیتوکین القا کننده اینترفرون گاما نقش مهمی در پاسخ Th1 بازی می کند و نشان داده شده است که تولید آنتی بادی در پاسخ به IL18 از آسیب کبدی در مدل های حیوانی جلوگیری می کند (16).  IL18 توسط سلول‌های مختلفی از جمله سلول‌های کوپفر، ماکروفاژهای فعال شده، مونوسیت ها و سلول های دندرتیک تولید می شود (17).

تحقیقات انجام شده توسط kimura و همکاران نشان داده است که IL18 از تکثیر HBV در کبد موش‌های ترانس ژنیک جلوگیری می‌کند (18).

تغییرات نوکلئوتیدی مختلفی در ناحیه پروموتر ژن اینترلوکین 18 سنتز این سیتوکین را تحت تاثیر قرار می دهد که از این بین دو SNP در موقعیت A/C 607- و G/C137- فعالیت پروموتر این ژن را تغییر می دهند (19).

تحقیقات نشان داده اند که بین ژنوتیپ  A/A 607- و احتمال ابتلا به هپاتیت B مزمن ارتباط وجود دارد (21،20). علاوه بر آن آلل c در موقعیت 137- نقش محافظتی را در برابر پیشرفت عفونت مزمن HBV بازی می کند (22).

در مطالعه Selim و همکاران نشان داده شده است که میانگین سطح سرمی اینترلوکین 18 در بیماران مبتلا به عفونت های هپاتیت مزمن و سیروز افزایش است و در بیماران مبتلا به عفونت کاهش یافته است (23).

CD14 یک ژن مهم در سیستم ایمنی ذاتی است که سبب فعالسازی پاسخ های التهابی و ایمنی در برابر عوامل خارجی می گردد.  میزان CD14 مرتبط با شدت فیبروز یا سیروز کبدی میباشد که اسیبهای کبدی مرتبط با HBV هستند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 

Yan و همکاران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 ارتباط مستقیمی بین پلی مورفیسم CD14-159C/T و آسیب سیروزی مرتبط با HBV پیدا کردند. همچنین در یک مطالعه در تهران آقای علیزاده و همکاران (31) ارتباط معنی داری بین پلی مورفیسم CD14-159C/T و هپاتیت مزمن B پیدا کردند.

در این مطالعه ارتباط پلی‌مورفیسم‌ ژنی

 Interleukin-1 Receptor Antagonist (IL1RN), Interleukin-4 Receptor Antagonist (IL4RN), Interleukin-18 in  (-137 C/G ,-607 A/C), CD14 (-159C/T)

با هپاتیت B در بیماران شهر زاهدان مورد بررسی قرار خواهد گرفت.

فراوانی پلی مورفیسم ژنی IL-1R 86-bp VNTR در بیماران مبتلا به عفونت مزمن هپاتیت B و افراد شاهد متفاوت است. 

فراوانی پلی مورفیسم ژنی IL-4R 470-bp VNTR در بیماران مبتلا به عفونت مزمن هپاتیت B و افراد شاهد متفاوت است. 

فراوانی پلی مورفیسم ژنی IL18 (-137 C/G) در بیماران مبتلا به عفونت مزمن هپاتیت B و افراد شاهد متفاوت است. 

فراوانی پلی مورفیسم ژنی IL18 (-607 A/C) در بیماران مبتلا به عفونت مزمن هپاتیت B و افراد شاهد متفاوت است. 

فراوانی پلی مورفیسم ژنی CD14 (-159C/T rs2569190) در بیماران مبتلا به عفونت مزمن هپاتیت B و افراد شاهد متفاوت است. 

بررسی پلی‌مورفیسم‌ های ژنی

Interleukin-1 Receptor Antagonist (IL1RN), Interleukin-4 Receptor Antagonist (IL4RN), Interleukin-18 in  (-137 C/G ,-607 A/C), CD14 (-159C/T)

در افراد مبتلا به عفونت مزمن هپاتیت B و مقایسه آن با افراد سالم

مقایسه پلی مورفیسم ژنی IL-1R 86-bp VNTR در افراد مبتلا به عفونت مزمن هپاتیت B و افراد سالم

مقایسه پلی مورفیسم ژنی IL-4R 470-bp VNTR در افراد مبتلا به عفونت مزمن هپاتیت B و افراد سالم

مقایسه پلی مورفیسم ژنی IL18 (-137 A/C) در افراد مبتلا به عفونت مزمن هپاتیت B و افراد سالم

مقایسه پلی مورفیسم ژنی IL18 (-607 A/C) در افراد مبتلا به عفونت مزمن هپاتیت B و افراد سالم

مقایسه پلی مورفیسم ژنی CD14 (-159C/T rs2569190) در افراد مبتلا به عفونت مزمن هپاتیت B و افراد سالم 

دانشگاه علوم پزشکی زاهدان، حوزه معاونت پژوهشی، مدیریت امورپژوهشی، پژوهشکده دانشگاه علوم پزشکی زاهدان

 پلی‌مورفیسم : اختلاف توالی بازهای DNA در افراد یا گروه­های مختلف

عفونت مزمن هپاتیت B: هر فرد HBS Ag مثبت یا HBV DNA مثبت به بیش از 6 ماه (ناقل مزمن یا هپاتیت مزمن)

آنتی‌ ژن سطحی هپاتیت B:HBsAg  یا Hepatitis B surface Antigen

اینترلوکین 1: سیتوکین اصلی پیش التهابی

اینترلوکین 4: سیتوکین اصلی دستگاه ایمنی در فعال سازی لنفوسیت های B

اینترلوکین 18: یک سیتوکین القا کننده اینترفرون گاما

CD14: یک ژن مهم در سیستم ایمنی ذاتی

مورد-شاهدی

معیارهای ورود به مطالعه:

افراد مبتلا به عفونت مزمن با ویروس هپاتیتB ( بیش از 6 ماه HBS Ag و یا HBV DNA - PCR مثبت دارند) بعنوان گروه مورد در نظر گرفته خواهند شد.

افراد با عملکرد کبد نرمال و بدون سابقه بیماری قبلی کبدی و سرولوژی منفی HDV و HCV به عنوان گروه شاهد انتخاب شدند.

معیارهای خروجی به مطالعه: ویروس نقص ایمنی انسانی (HIV) و یا عفونت HCV، HDVو یا داشتن هر گونه شواهدی از بیماری بالینی کبد مانند سیروز های صفراوی اولیه ، HCC، تاریخچه سوء استفاده از الکل و یا پیوند قبلی کبد است.

با توجه به شیوع متوسط عفونت HBV مزمن در زاهدان و همچنین با توجه به حجم نمونه سایر مقالات، حجم نمونه برای افراد مبتلا به HBV برابر 200 و گروه کنترل نیز به همان تعداد در نظر گرفته شده است.

علت انتخاب این حجم نمونه دسترسی به این حجم از بیماران و با توجه به مطالعات مشابه نیز این حجم قابل قبول میباشد.

:P1 نسبت یا سهم پیامد مورد نظر در گروه اول (مورد)

:P2 نسبت یا سهم پیامد مورد نظر در گروه دوم (شاهد)

:α  خطای نوع اول (مورد) که معمولاً در سطح 05/0 ثابت در نظر گرفته می‌شود.

:β خطای نوع دوم (شاهد) که معمولاً در سطح 05/0 ثابت درنظر گرفته می‌شود.

روش نمونه‌گیری  آسان و در دسترس

 (5 سی‌سی نمونه خون از تعداد مورد نظر بیماران مبتلا به عفونت مزمن هپاتیت B ( موارد شناخته شده و دارای پرونده)و نیز همان تعداد افراد سالم  از دنورهای که پرونده درسازمان انتقال خون دارند گرفته می‌شود.)

مشاهده و بررسی‌های آزمایشگاهی (فرم ضمیمه 1)

نمونه خون تام  در 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری می‌شود . در ادامه DNA ژنومی از خون تام به روش salting out تخلیص می‌شود. پس از استخراج DNA از خون تام، مقدار کمی آن با دستگاه اسپکتروفوتومتر اندازه‌گیری می‌شود. مقدار کمی DNA با روش اندازه‌گیری جذب نوری (OD) در طول موج nm 260 بدست می‌آید. ابتدا OD دستگاه اسپکتروفتومتر را با آب مقطر صفر کرده، و سپس OD نمونه خوانده می‌شود. اگر جذب نوری نمونه در nm 260 برابر یک شود (1=OD)، بدین معنی است که غلظت DNA برابر با µg/ml 50 است (این مقدار برای RNA برابر است با  µg/ml 40 است). به منظور اندازه‌گیری غلظت Total DNA، µl 10 از محلول حاوی DNA با ml490 آب مقطر به حجم µl500 رسانده و جذب نوری آن توسط دستگاه اسپکتروفوتومتر در طول موج‌های nm 260 و nm280 خوانده شد. غلظت DNA با استفاده از رابطه زیر محاسبه می‌شود.

پرایمرهای اختصاصی جهت بررسی پلی‌مورفیسم ژنی که قبلا به روشTetra-ARMS or Allele-Specific PCR) PCR ) طراحی شده اند مورد استفاده قرار خواهند گرفت و سپس شرایط PCR بهینه می‌شود و بررسی پلی‌مورفیسم  ژنی با این روش مورد ارزیابی قرار می‌گیرد.

همه تحلیل های آماری اجرا شده توسط نرم افزار SPSS، نسخه 18 (SPSS Inc, Chicago IL, USA) انجام می‌شود.

و برای توصیف نتایج بصورت  میانگین و..  از آزمونهای آماری کای اسکوئر و T student test ,جهت تجزیه و تحلیل استفاده خواهد شد

ارتباط میان ژنوتیپ با حساب نسبت شانس (OR) و فاصله اطمینان ٪95 (CI ٪95) از تجزیه و تحلیل رگرسیون لجستیک محاسبه خواهد شد. مقادیر-P زیر 05/0 معنی‌دار در نظر گرفته می‌شود. (ضمیمه 2)   

کدهای دفترچه راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش‌های دارای آزمودنی انسانی در جمهوری اسلامی ایران:

کدهای1، 2، 3، 8، 10، 11، 13، 15، 18، 25، 28، مصوب کمیته کشوری اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی که دربردارنده‌ی اصول و مقررات اخلاقی‎ مطرح  و در سال 1392 در 31 بند تصویب شده است.

 همچنین کدهای دفترچه راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی در جمهوری اسلامی ایران:

کدهای 1، 2، 3، 4، 7 از قسمت راهنمای عمومی در این طرح رعایت می شود.

تمامی بیماران تحت مطالعه آگاهانه و برای مقاصد علمی اقدام به دادن نمونه خواهند کرد. شرکت در این طرح هیچ گونه هزینه ای برای بیماران ندارد و نام و مشخصات بیماران گزارش نخواهد شد.

- عدم همکاری بیمار که باید نمونه گیری از بیمارانی که رضایت دارند انجام شود و نیاز به زمان بیشتری خواهد داشت.

 -مشکل تهیه مواد و امکان طولانی شدن زمان دریافت آن‌ها که در این صورت مدت زمان اجرای طرح باید تمدید شود.

پلی‌مورفیسم، عفونت مزمن هپاتیت B ، اینترلوکین 1 (IL1RN) ، اینترلوکین 4 (IL4RN) ، اینترلوکین 18 (-137 C/G ,-607 A/C) و  (CD14 (-159C/T

Gene polymorphism,  Chronic hepatitis B, Interleukin-1 Receptor Antagonist (IL1RN), Interleukin-4 Receptor Antagonist (IL4RN), Interleukin-18 in  (-137 C/G ,-607 A/C), CD14 (-159C/T)

1. Dienstag J.L. Hepatitis B virus infection. N Engl J Med 2008; 359(14): 1486-500.

RanJbar M, Alizadeh AM, Hajilooi M, Mousavi M. Polymorphisms of IL-1RN genes in patients with chronic hepatitis B in Iran. World J Gastroenterology. 2006;12(31):5044-7. Meiler C, Muhlbauer M, Johann M, Hartmann A, Schnabl B, Wodarz N, Schmitz G, Scholmerich J, Hellerbrand C. Different effects of a CD14 gene polymorphism on disease outcome in patients with alcoholic liver disease and chronic hepatitis C infection. World journal of gastroenterology 2005; 11(38): 6031-6037 [PMID: 16273620 PMCID: 4436730.

 Foley JE, Mariotti J, Ryan K, Eckhaus M, Fowler DH. Th2 Cell Therapy of Established Acute Graft-Versus-Host Disease Requires IL-4 and IL-10 and Is Abrogated by IL-2 or Host-Type Antigen-Presenting Cells. Biology of Blood and Marrow Transplant.14(9):959-972. Cui W, Sun CM, Deng BC, Liu P. Association of polymorphisms in the interleukin-4 gene with response to hepatitis B vaccine and susceptibility to hepatitis B virus infection: a meta-analysis. Gene. 2013;525(1):35-40. Napoli J, Bishop G A, McGuinness P H, et al. Progressive liver injury in chronic hepatitis C infection correlates with increased intrahepatic expression of Th1- associated cytokines. Hepatology 1996; 24: 759–65. Dinarello CA. IL-18: a Th1-inducing, proinflammatory cytokine and new member of the IL-1 family. J Allergy Clin Immunol 1999; 103:11–24. Okamura H, Tsutsui H, Komatsu T et al. Cloning of a new cytokine that induces IFN-c production by T cells. Nature 1995; 378:88–91. Kimura K, Kakimi K, Wieland S, Guidotti LG, Chisari FV. Interleu­kin-18 inhibits hepatitis B virus replication in the livers of trans­genic mice. J Virol. 2002;76(21):10702–7. Giedraitis V, He B, Huang WX, Hillert J. Cloning and mutation analysis of the human IL-18 promoter: a possible role of poly­morphisms in expression regulation. J Neuroimmunol. 2001;112(1- 2):146–52. Hirankarn N, Manonom C, Tangkijvanich P, Poovorawan Y. Asso­ciation of interleukin-18 gene polymorphism (-607A/A genotype) with susceptibility to chronic hepatitis B virus infection. Tissue Antigens. 2007;70(2):160–3. Li N, Gao YF, Zhang TC, Chen P, Li X, Su F. Relationship between in­terleukin 18 polymorphisms and susceptibility to chronic hepa­titis B virus infection. World J Hepatol. 2012;4(3):105–9. Zhang PA, Wu JM, Li Y, Yang XS. [Relationship of interleukin-18 gene promoter polymorphisms with chronic hepatitis B in Chinese Han population]. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 2005;22(5):528–32. Selim HS , ElBarrawy MA, Taha HA, Abd ElHafiz DA. Evaluation of Interleukin18 as a Non Invasive Marker of Liver Fibrosis among Chronic Hepatitis C Virus Patients. J Egypt Public Health Assoc. 2009;84(5-6):391-403

seropositivity following mass vaccination in the Islamic Republic of Iran. East Mediterr Health J 2005; 11(1-2): 62-67.

Ahn SY, Han K, Park J, Lee C, Kang S, Chon C, et al. Association   between hepatitis B   virus  infection   and HLA-DR type in Korea. Hepatology. 2000;31:1371-3. Ben-Ari Z, Mor E, Papo O, r BK, Sulkies J, bur AT, et al. Cytokine gene polymorphisms in patients infected with hepatitis B virus. Am J Gastroenterology 2003;98(1):144-50. Nieters A, Yuan J, Sun C, Zhang Z, Stoehlmacher J, Govindarajan S, et al. Effect of cytokine genotypes on the hepatitis B virus-hepatocellular carcinoma association. . cancer. 2005;4(103):740-8. Almarri A, Batchelor J. HLA and hepatitis B infection. Lancet. 1994;344(8931):1194-5.

Shamszad M, Farzadegan H. Hepatitis B related cirrhosis and hepatocellular carcinoma in Iran. J Iran Med Council 1982; 8: 228-233.

Zali MR, Mohammad K, Noorbala AA, Noorimayer B, Shahraz S. Rate of hepatitis B

Alizadeh AH, Ranjbar M, Ansari S, MirArab A, Alavian SM, Mohammad K, et al.  Seroprevalence of hepatitis B in Nahavand, Islamic Republic of Iran. East Mediterr Health J 2006;12(5): 528-537.

Azimzadeh P., Mohebbi S.R, Romani S, Kazemian SH, Mirtalebi H, Vahedi M, et al. Role of TGF-_1 codon 10 polymorphism in chronic hepatitis C patients. Journal of Babol University of Medical Sciences 2011; 13(4): 26-33 [Persian].

1) Harrison's principles of internal medicine. (Diseases of the liver and bile ducts). Mohamadi M. Arjomand Publications. Chisari F.V, Isogawa M, Wieland SF. Pathogenesis of hepatitis B virus infection. Pathol Biol (Paris) 2010; 58(4): 258-66.

پلی مورفیسم‌های ژنی

Interleukin-1 Receptor Antagonist (IL1RN), Interleukin-4 Receptor Antagonist (IL4RN), Interleukin-18 in  (-137 C/G ,-607 A/C), CD14 (-159C/T)

در بیماران مبتلا به عفونت مزمن هپاتیت B (بیمارانی که از نظر آزمایش HBsAg  به روش ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay )  و  یا HBV DNA مثبت باشند) بررسی و با افراد سالم(افراد سالم اهداء کننده خون مراجعه کننده به سازمان انتقال خون زاهدان) مقایسه خواهد شد.

-تعیین  فراوانی پلی مورفیسم ژنی

 Interleukin-1 Receptor Antagonist (IL1RN), Interleukin-4 Receptor Antagonist (IL4RN), Interleukin-18 in  (-137 C/G ,-607 A/C), CD14 (-159C/T)

 در مبتلایان به عفونت مزمن HBV  و افراد سالم

-مقایسه پلی‌مورفیسم‌ ژنی

Interleukin-1 Receptor Antagonist (IL1RN), Interleukin-4 Receptor Antagonist (IL4RN), Interleukin-18 in  (-137 C/G ,-607 A/C), CD14 (-159C/T)

در افراد مبتلا به ویروس هپاتیت B و افراد سالم

ضمیمه 1

فرم اطلاعاتی طرح پژوهشی

بررسی پلی‌مورفیسم‌ های ژنی

Interleukin-1 Receptor Antagonist (IL1RN), Interleukin-4 Receptor Antagonist (IL4RN), Interleukin-18 in  (-137 C/G ,-607 A/C), CD14 (-159C/T)

در افراد مبتلا به عفونت مزمن هپاتیت B و مقایسه آن با افراد سالم

اطلاعات زمینه ای:

گروه شاهد

شماره: .......                        

 نام ونام خانوادگی: ............

              سن(سال) : ..............           

جنس: مرد                   زن

 قومیت: بلوچ                   فارس                    افغان    

گروه مورد             

شماره: .......                        

 نام ونام خانوادگی: ............

              سن(سال) : ..............           

جنس: مرد                   زن

 قومیت: بلوچ                   فارس                    افغان    

علائم بالینی بیمار:

Immunology test:

HBs Antigene (quality)                     Negative                positive        

HBV DNA                                       Negative                positive              

HBs Antibody (mIU/ml)………………………………….

Anti HCV                                         Negative                positive       

Anti HDV                                         Negative                positive                      

HIV                                                  Negative                positive                       

AST

ALT

Polymosrphisms:

IL-1R VNTR                   1 VNTR repeat             2VNTR repeat            3 VNTR repeat

IL-4R VNTR                   1 VNTR repeat             2VNTR repeat            3 VNTR repeat

IL-18(-137 C/G)               CC                                CG                     GG

IL-18(-607 A/C)               AA                                AC                     CC

CD14( -159 (C/T)             GG                                GA                     AA

                                                                                                                          ضمیمه 2 

ویژگی های بالینی جمعیت مورد مطالعه

توزیع فراوانی ژنوتیپ های مشاهده شده ومورد انتظار در جمعیت مورد مطالعه. برای تعادل هاردی وینبرگ

فراوانی‌ژنوتیپ‌های Interleukin-1 Receptor Antagonist (IL1RN) و CCL5 -403 G>A and CCR5 Δ32, CD14 -159C/T, IFN-γ in (874 A/T and 5644 A/T)  در گروه مورد ‌وگروه کنترل