بررسی پلی مورفیسم ژن NOD2(rs2066844 ,rs2066845,rs5743278 ,rs2066847,rs2066842) در بیماران مبتلا به سل ریوی و مقایسه آن با افراد سالم در شهرستان زاهدان

مجموعه ای از علایم بالینی که به وسیله میکوباکتریوم توبرکلوزیس و به میزان کمتر توسظ مایکوباکتریوم بویس تولید می شود، توبرکلوزیس گفته می شود(1). WHO در سال 1993 بیان کرد که توبرکلوزیس یک اولویت سلامت جهانی است و به سمت مشکل جهانی بزرگی پیش می رود (2و3). تقریباً یک سوم جمعیت جهان (حدود دو میلیارد نفر) به میکروب سل آلوده و در خطر ابتلا به بیماری سل قرار دارند. هر ساله حدود 9 میلیون نفر به سل فعال مبتلا شده و حدود 5/1 میلیون نفر در اثر این بیماری جان می سپارند. بیش از 90 درصد موارد بیماری و مرگ ناشی از سل در کشورهای در حال توسعه رخ می دهد. کشورهایی که 75 درصد موارد بیماری در آنها به فعال ترین گروه سنی به لحاظ اقتصادی (54-15 سال) تعلق دارد(4). شیلی کشوری است که کمترین مقدار شیوع سل در نسبت به کشورهای امریکای جنوبی در آن دیده می شود ودلیل آن اوضاع جعرافیایی خاص آن است که آن را از امریکای جنوبی مثتثنی می کند(5). در ایران شایع ترین نوع سل، ریوی بوده ، به طوری که سل ریوی اسمیر خلط مثبت 53 درصد کل موارد سل را تشکیل می دهد. در میان استانها ، گلستان و سیستان و بلوچستان بیشترین میزانهای بروز و شیوع را در کشور دارا هستند. بر طبق آخرین آمار منتشره وزارت بهداشت، ( جمعیت تحت پوشش دانشگاهها ) میزان بروز سل به ترتیب در زابل و زاهدان 7/109 و 6/36 در 100000 نفر جمعیت در سال 88 گزارش شده است(6و7). چون بیشترین مهاجران افعان در ایران یافت می شود پور حسینی و هم کاران دریک گزارش اعلام کردند که 29 درصد افعانهای مهاجر در ایران مبتلا به این بیماری هستند(8). با وجود کشف باسیل سل 100 سال قبل، هنوز چالشهای مهمی برای کنترل مایکوباکتریوم توبرکلوزیس وجود دارد. شناخت عوامل ژنتیکی و ایمونولوژیکی که بر روی استعداد ابتلا انسان تأثیر گذار است می تواند منجر به رویکردهای جدیدی برای توسعه ساخت واکسنو پیشرفتهای تشخیصی جهت درمان افراد در معرض خطر بیماری باشد(8). سیستم ایمنی ذاتی به عنوان اولین خط دفاعی بدن در برابر باسیل سل محسوب می شود و در این راستا، پذیرنده های شناسایی کننده الگو Pathogen Recognition Receptors نقش مهمی را در شناسایی الگوهای مولکولی همراه پاتوژن Pathogen Associated Molecular Patterns بر عهده دارند. در میان خانواده پذیرنده های شناسایی کننده الگو، NOD like receptors یا NLR ها از اهمیت ویژه ای برخورداند. NOD2 از خانواده NLRها روی کروموزوم 16q21 کد می شود و در شناسایی مورامیل دی پپتید در غشاء سلولی باکتری ها نقش دارد که طی یک مسیر انتقال سیگنال نهایتا منجر به فعال شدن فاکتور NFĸB خواهد شد که تولید سیتوکین های التهابی در جهت کمک به حذف باکتری های درون سلولی را در پی دارد. در پاتوژنز توبرکلوزیس دومین ناحیه C مولکول NOD2 و دومین LRR ناحیه انتهایی C یک نقش تعیین کننده و مهم در هدف گیری غشاء، که می تواند بخشی از دیواره سلولی M.tuberculosis باشد، دارد؛ نظیر پپتیدهای مشتق شده از تجزیه پپتیدوگلیکان که جزء مورامیل دی پپتید آن را مورد شناسایی قرار می دهد(1). پلی موفیسم های ژن NOD2 با افزایش ریسک ابتلا به سارکوئیدوز ریوی و لپروزی توام هستند.

Azad      و همکارانش نشان دادند که سه SNP شایع غیر مترادف (Three common non-synonymous SNPs) از ژن NOD2 که نقشهای مهمی در توبرکلوزیس ایفا می نمایند عبارتند از Ala725Gly ، Arg702Trp و Pro268Ser (2).

     مطالعه روی یک جمعیت آمریکایی-آفریقایی مسلول و گروه شاهد با سکانس کردن اگزون 4 نواحی کد کننده ژن NOD2 نشان داد که واریانت های Pro268Ser و Arg702Trp نقش محافظتی در برابر سل دارند و حال آنکه Ala725Gly یک همراهی مثبت با استعداد ابتلا به سل دارد. هرچند هیچ همراهی بین این پلی مورفیسم ها و عفونت سلی در جمعیت آفریقای جنوبی وجود نداشت(3, 4).

     یک مطالعه مورد شاهدی نقش SNP های ژن NOD2 را در استعداد ابتلا به سل در جمعیت های Han چینی، Uygur و Kazak مورد تحقیق و بررسی قرار دادند و نشان دادند که پلی موفیسم Arg587Arg در NOD2 با استعداد ابتلا به سل مرتبط بوده و ممکن است بعنوان یک فاکتور خطر در پیشرفت بیماری سل در جمعیت Han Chinese مطرح باشد(5).

      مطالعه دیگری نشان داد که ماکروفاژهای موش های فاقد ژن NOD2 بطور معنی داری میزان کمتری از سایتوکاین ها را در مقایسه با گروه کنترل تولید می نمایند(6). این پژوهشگران همچنین مشاهده کردند که ماکروفاژهای جدا شده از افرادیکه برای جهش 3020insC ژن NOD2 هموزیگوت هستند، بدنبال تحریک با M.tuberculosis ، 65 تا 80 درصد سایتوکاین کمتر از افرادیکه از این نظر هتروزیگوت هستند و یا برای ژن وحشی هموزیگوت هستند؛ تولید می نمایند. این افراد در تولید سایتوکاین TNF دارای نقص هستند.

     در مطالعه ای که توسط Schnitzler F و همکارانش در سال 2015 انجام شد، ارتباط پلی مورفیسم ژن NOD2 با بیماری کرون و عوارض آن بررسی شد. آنها گزارش کردند که پلی مورفیسم NOD2(rs72796353) به عنوان یک فاکتور پیش بینی کننده در ایجاد فیستول های ناحیه مقعد در بیماران مبتلا به بیماری کرون مطرح می باشد(7).

    در یک بررسی که توسط Myalapora Ningappa و همکارانش در سال 2009  انجام شد، ارتباط پلی مورفیسم ژن NOD2(rs2066844) با سندروم روده کوچک بررسی شده و به این نتیجه رسیدند که وجود این پلی مورفیسم با نیاز به ترکیب پیوند کبد-روده در کودکان با سندروم روده کوچک ارتباط دارد(8).

     با توجه به اهمیت بیماری سل و شیوع قابل ملاحظه آن در منطقه و لزوم تشخیص و درمان به موقع و با عنایت به نقش گسترده پلی مورفیسمهای آن در استعداد ابتلا به بیماریهای مختلف و از جمله سل ریوی ، هدف این پژوهش بررسی وجود یا عدم وجود ارتباط میان چندین پلی مورفیسم در ژن  NOD2(rs2066844 ,rs2066845 ,rs2066847,rs2066842, rs5743278) با بیماری سل در زاهدان می باشد.

توزیع فراوانی پلی مورفیسم rs2066844  ژن NOD در افراد  مبتلا به سل ریوی با افراد سالم متفاوت است.

توزیع فراوانی پلی مورفیسم rs2066845 ژن NOD در افراد  مبتلا به سل ریوی با افراد سالم متفاوت است.

توزیع فراوانی پلی مورفیسم rs2066847 ژن NOD در افراد  مبتلا به سل ریوی با افراد سالم متفاوت است.

توزیع فراوانی پلی مورفیسم rs2066842 ژن NOD در افراد  مبتلا به سل ریوی با افراد سالم متفاوت است

توزیع فراوانی پلی مورفیسم rs5743278 ژن NOD در افراد  مبتلا به سل ریوی با افراد سالم متفاوت است

تعیین توزیع فراوانی پلی مورفیسم های rs2066844 ,rs2066845 ,rs2066847, rs2066842, rs5743278  ژن  NODبیماران مبتلا به سل ریوی درمقایسه باافراد سالم در شهرستان زاهدان

مقایسه توزیع فراوانی پلی مورفیسم rs2066844  ژن NOD در افراد  مبتلا به سل ریوی با افراد سالم

مقایسه توزیع فراوانی پلی مورفیسم rs2066845 ژن NOD در افراد  مبتلا به سل ریوی با افراد سالم

مقایسه توزیع فراوانی پلی مورفیسم rs2066847 ژن NOD در افراد  مبتلا به سل ریوی با افراد سالم

مقایسه توزیع فراوانی پلی مورفیسم rs2066842 ژن NOD در افراد  مبتلا به سل ریوی با افراد سالم

مقایسه توزیع فراوانی پلی مورفیسم rs5743278 ژن NOD در افراد  مبتلا به سل ریوی با افراد سالم

الف) مراکز تحقیقات ﮊنتیک   ب) مرکز تحقیقات سل   ج) کلیه مراکز دانشگاهی

rs2066844, rs2066845, rs2066847, rs2066842, rs5743278

مورد- شاهدی

کلیه بیماران مبتلا به سل که در سال 1394جهت ارزیابی و درمان به بیمارستان بوعلی شهرستان زاهدان مراجعه می کنند.

الف) سن بالای 16 سال

ب) عدم وجود هرگونه عفونت سیستمیک یا موضعی ( با یا بدون درگیری ریوی )

ج) عدم وجود هرگونه بیماری غیر عفونی سیستمیک حاد یا مزمن ( با یا بدون درگیری ریوی )

د) عدم وجود هرگونه نئوپلاسم تشخیص داده شده ( با یا بدون درگیری ریوی )

3-معیارهای ورود به گروه شاهد:

الف) سن بالای 16 سال

ب) عدم وجود هرگونه عفونت سیستمیک یا موضعی ( با یا بدون درگیری ریوی )

ج) عدم وجود هرگونه بیماری غیر عفونی سیستمیک حاد یا مزمن ( با یا بدون درگیری ریوی )

د) عدم وجود هرگونه نئوپلاسم تشخیص داده شده ( با یا بدون درگیری ریوی )

4-معیارهای خروج از مطالعه:

عدم همکاری بیمار در ادامه طرح

     حجم نمونه حداقل150 نفر شامل کلیه بیماران مسلول ریوی  تشخیص داده شده، تحت درمان یا درمان شده شهرستان زاهدان درسال 1394 ودر صورت نیاز از نمونه های سال قبل استفاده خواهد شد. به همین تعداد نیز از افراد سالم جامعه که به بیماری سل مبتلا نشده اند وسابقه هیچگونه بیماری سیستمیک ندارند (از افراد سالم طرح سندرم متابولیک ) انتخاب می شوند.

آسان و در دسترس( تصادفی ساده)

دراین مطالعه جهت جمع آوری اطلاعات از تکنیک (Observational)  یا مشاهده ای استفاده می شود واطلاعات کلی و مشخصات دموگرافیک فرد شامل سن، جنس، سابقه خانوادگی ابتلا به  بیماری سل و نتایج آزمایشگاهی با استفاده از معاینه ، شرح حال و اطلاعات پرونده در فرم های اطلاعاتی ثبت می شود.

هدف از انجام این مطالعه مورد-شاهدی مقایسه فراوانی پلی مورفیسم ژن NOD در بیماران مبتلا به سل و افراد سالم است. در این مطالعه تعداد 150 نفر از بیماران مبتلا به سل ریوی بالای 16 سال که در سال به بیمارستان بوعلی شهرستان زاهدان جهت ارزیابی و درمان مراجعه می کنند و 150 نفر از افراد سالم بالای 16 سال به عنوان گروه شاهد مورد مطالعه قرار خواهند گرفت. در گروه بیماران سل ریوی در ابتدا از کلیه بیماران مشکوک به سل ریوی ( دارای علایم سرفه همراه با خلط و کاهش وزن ، هموپتزی ، درد قفسه سینه ، بی اشتهایی ، خستگی و تعریق شبانه ) اسمیر مستقیم خلط و کشت باسیل مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ( به عنوان روش استاندارد تشخیصی ) انجام خواهد شد و با توجه به زمان بر بودن آماده شدن نتایج کشت ، در بیمارانی که حداقل 2 نمونه اسمیر خلط مثبت داشته باشند نمونه گیری خون انجام شده در ابتدا پس از کسب رضایت کامل از بیماران ، اطلاعات دموگرافیک بیماران شامل جنس ، سن و سابقه خانوادگی ابتلا به بیماری سل ثبت خواهد شد. سپس جهت نمونه گیری ( درافراد دارای معیارهای ورود به مطالعه ) 2 میلی لیتر خون وریدی در لوله های حاوی EDTA جمع آوری می گردد و نمونه خون در منفی20 درجه سانتی گراد نگهداری می شود. DNA سلول های خون محیطی به روشsalting out تخلیص می شود، پرایمرهای اختصاصی PCR RFLP طراحی شده و پس از بهینه سازی شرایط PCR محصول PCR توسط Restriction Enzyme هضم شده و سپس روی ژل آگاروز اکتروفورز شده و ژنوتیپ گروه شاهد و مورد با این روش مورد ارزیابی قرار می گیرد.

پس از گردآوری اطلاعات لازم داده ها در نرم افزار SPSS  وارد می شوند و با استفاده از آزمون های T-Test و Chi-square مورد تجزیه و تحلیل قرار خواهند گرفت.مقادیر OR و P-Value محاسبه خواهند شد

کدهای مصوب کمیته کشوری اخلاق در پژوهشهای علوم پزشکی رعایت می شود. بر اساس دفترچه راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی بخش راهنمای عمومی کدهای 1-2-3-4-5-6-7-8-9-10-11-12 و طبق دفترچه راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش‌های علوم پزشکی  دارای آزمودنی انسانی  کدهای 1-2-3-4-5-6-7-8-9-10-11-12-13-14-15-16-17-18-19-20-21-22-23-24-25-26-27-28-29-30-31 لحاظ گردیده است.

با رضایت کامل از بیماران نمونه گیری می شود و تعهد می شود نام و مشخصات بیماران در هیچ گزارشی قید نشود و انجام آزمایشات هیچگونه هزینه ای برای بیمار نخواهد داشت.

عدم همکاری بیماران جهت تهیه نمونه ها

نمونه گیری از سایر افراد بیمار

NOD2, Pulmonary tuberculosis, polymorphism

1.         Wang C, Chen ZL, Pan ZF, Wei LL, Xu DD, Jiang TT, et al. NOD2 polymorphisms and pulmonary tuberculosis susceptibility: a systematic review and meta-analysis. International journal of biological sciences. 2013;10(1):103-8.

2.         Azad AK, Sadee W, Schlesinger LS. Innate immune gene polymorphisms in tuberculosis. Infection and immunity. 2012;80(10):3343-59.

3.         Austin CM, Ma X, Graviss EA. Common nonsynonymous polymorphisms in the NOD2 gene are associated with resistance or susceptibility to tuberculosis disease in African Americans. The Journal of infectious diseases. 2008;197(12):1713-6.

4.         Moller M, Nebel A, Kwiatkowski R, van Helden PD, Hoal EG, Schreiber S. Host susceptibility to tuberculosis: CARD15 polymorphisms in a South African population. Molecular and cellular probes. 2007;21(2):148-51.

5.         Zhao M, Jiang F, Zhang W, Li F, Wei L, Liu J, et al. A novel single nucleotide polymorphism within the NOD2 gene is associated with pulmonary tuberculosis in the Chinese Han, Uygur and Kazak populations. BMC Infectious Diseases. 2012;12(1):1-6.

6.         Ferwerda G, Girardin SE, Kullberg BJ, Le Bourhis L, de Jong DJ, Langenberg DM, et al. NOD2 and toll-like receptors are nonredundant recognition systems of Mycobacterium tuberculosis. PLoS Pathog. 2005;1.

7.         Schnitzler F, Friedrich M, Wolf C, Stallhofer J, Angelberger M, Diegelmann J, et al. The NOD2 Single Nucleotide Polymorphism rs72796353 (IVS4+10 A>C) Is a Predictor for Perianal Fistulas in Patients with Crohn's Disease in the Absence of Other NOD2 Mutations. PloS one. 2015;10(7):e0116044.

8.         Ningappa M, Higgs BW, Weeks DE, Ashokkumar C, Duerr RH, Sun Q, et al. NOD2 gene polymorphism rs2066844 associates with need for combined liver-intestine transplantation in children with short-gut syndrome. The American journal of gastroenterology. 2011;106(1):157-65.