بررسی مولکولار هرپس سیمپلکس تیپ6 و 7 انسانی در بیماران مبتلا به مالتیپل اسکلروزیس(MS) مراکز درمانی شهر زاهدان

بسیاری از بیماری های مزمن در انسان ممکن است مکانیسم عملکردی خود را تغییر داده و با نشان دادن یک سازوکار متفاوت، سبب بروز بیماری های خود ایمن و در نهایت درگیری شدید سیستم ایمنی فرد شوند(1).

شیوع عفونت با هرپس ویروس های انسانی تیپ 6 ،7  همگی دارای ،  DNA دورشته ای هستند و از اعضا خانواده هرپس ویریده به شمار می روند. عفونت با هرپس ویروس های انسانی تیپ 6 و 7 به ناحیه جغرافیایی خاصی محدود نیست و در سراسر جهان رخ می دهد. هرپس ویروس های انسانی تیپ 6، سبب ایجاد بیماری ششم (رزئولا اینفانتوم) در اطفال 4 ماهه تا 2 ساله می شود.هرپس ویروس هاس تیپ 7 نیز علائم مشابه با شدت کمتر دارند. مولتیپل اسکلروزیس (M.S) شایعترین اختلال عصبی و از بیشترین میزان بروز در جوانان برخوردار است . علایم اولیه عموماً پیش از 55 سالگی آغاز می شود و در سن 20 تا 40 سالگی به اوج خود می رسد(2) . نسبت بیماری در زنان به مردان 2 برابر می باشد. حدود300 هزار نفر را در آمریکا مبتلا کرده است . علت بیماری ناشناخته است اما ظن به نوعی مکانیسم ایمنی علیه آنتی ژنهای میلینی وجود دارد(3). این بیماری برای اولین بار در سال 1867 در کشور آمریکا توسط دکتر موریس و همکاران  و سپس در سال 1873 در کشور انگلیس شناسایی و معرفی شد(4).

MS یک دمتیله کننده التهابی است که می تواند سبب بروز اختلالات عصبی در CNS شود. این اختلالات در سنین بین 20تا40 سال بیشتر دیده می شود(5). در این بیماری گلبول های سفید، ترکیبات پروتئینی غلاف میلین مانند پروتئین عمومی میلین(MBP)، PLP و اولیگوپروتئین های دندروسیتی را مورد هدف قرار داده و باعث تخریب آنها می شود، که این تخریب موجب ظهور علائم بالینی در شخص بیمار می شود(6).  ارتباط قوی بین بیماری و DR2-HLA وجود دارد عفونت ها ی ویروسی  یا سایر فاکتورها ممکن است باعث فعال شدن T-cell و آنتی بادی برعلیه سیستم عصبی مرکزی شده ، که باعث شکست سد مغزی – نخاعی می شود(7-9). علائم بالینی به صورت ضعف ، بی حالی یا ناهنجاری در یک اندام، فقدان ناگهانی یا تاری دید در یک چشم (نوریت اپتیک) ، دوبینی ، عدم تعادل یا اختلال عملکرد مثانه می باشد(10) . این علائم گذرا بوده و بعد از چند روز یا هفته از بین می روند . ممکن است چند ماه تا چند سال فاصله بین حمله اولیه تا شروع علائم عصبی باشد(11) . عود بیماری با عفونت آغاز شده و در زنان بیشتر در طی سه ماهه بعد از زایمان اتفاق می افتد . براساس سیر بیماری به انواع عود کننده –فروکشی کنندهRelapsing-remitting، پیشرونده ی ثانویه Secondary-progressive وPrimary progressive تقسیم می شود(12).

برخی عوامل عفونت زا ی  باکترایی و ویروسی ممکن است با بروز بیماری مالتیپل ایکلروزیس در ارتباط باشند بطوریکه در سال 1940 یک عامل عفونی نامشخص در بروز و افزایش روند این بیماری معرفی شد(6). در کنار عوامل میکروبی باکتریایی، عفونتهای ویروسی یکی از عوامل تشدید کننده M.S می باشد  بطوریکه گروههای متعدد ویروس به عنوان ایتولوژی یا تشدید کننده ی آن معرفی شده اند که می توان به ویروس هرپس سیمپلکس(H.S.V)،ابشتین بار ویروس(E.B.V)، واریسلا زوستر(V.Z.V)،هرپس ویروس انسانی (H.H.V)، اوریون ،سرخک و علل عفونی دیگر مانند کلامیدیا و بیماری لایم نیز در مطالعات پیدا شده اند(13-15).

هرپس ویروسها از عوامل نسبتاً شایع عفونت در کودکان بوده و بیماریهای سیستمیک ایجاد می کنند اما گرفتـاری سیستم عصبی مهمترین تظاهر آن است.در افـرادمبتلا بـه نقص ایمنی این عفونت میتواند کشنده باشد(16)(17). هرپس ویروس انسانی تیپ 6 یا H.H.V-6 در حدود 12 سال پیش توسط گروهی از محققین در ایالات متحده از فردی مبتلا به ایدز جدا گردید. پس از کشف هرپس ویروس انسانی تیپ4 (EBV) در 1964 ، HHV- 6 توسط Salahuddin و همکاران در سال 1986 جدا گردید(18). در ابتدا بعنوان یک ویروس B لنفوتروپیک معرفی گردید ولی با بررسیهای بعدی ثابت شد که این ویروس T لنفوتروپیک می باشد. با تحقیقات گسترده نقش ویروس در بیماریهای مختلف به اثبات رسید که از جمله مهمترین این بیماریها می توان به روزیولااینفنتوم (یکی از تب های اگزانتمی دوران کودکی) اشاره نمود. با مطالعات سرواتیدمیولوژیکی انجام شده مشخص گردید که بیش از 95% بزرگسالان دارای آنتی بادی ضد (HHV-6) می باشند که دلالت بر تماس این افراد در گذشته با این ویروس می نماید.

برخی گزارشات نشان میدهد که بین ایجاد این بیماری و هرپس ویروس انسانی تیپ 6 ارتباط وجود دارد(19)(20).

در مطالعه Sander vj و همکارانش در آمریکا که حضور هرپس ویروس را در نمونه های مغزی بیماران M.S با بیماران کنترل با PCR بررسی کردند، مواردHSV،HHV6،VZVدر بیماران M.S در مقایسه با گروه کنترل بیشتر بوده است(21). در مطالعه Christensen T و همکارانش در دانمارک،EBV،HHV6وVZV ارتباط با M.S داشته اند.(22). EBVوHHV-6 در هردو گروه کنترل و مبتلا تفاوتی نداشته است ولی درمورد HSV-1 فقط در گروه مبتلا یافت شد(23). در مطالعه Siddharama در هند عفونت با کلامیدیا پنوموینه ،HHV-6 ،EBV در پیشرفت بیماری M.S نقش داشته است(24). در مطالعه P.Sundstrom و همکارانش در سوئد ارتباط بین HHV-6با M.Sوجود داشت ولی ارتباطی میان HSV، VZVو سرخک با M.S یافت نشد(25). در مطالعه Khaki M وهمکارانش در اراک ارتباط بین M.S و سرخک و اوریون بوده است و همه بیماران از نظر آنتی بادی EBV و پاراانفلوانزا منفی بوده اند.(26) در مطالعه Ben Fredj N و همکارانش در تونس مشخص شد 2HSV-1,HSV-CMV,HHV-8 در هر دو گروه بیماران M.S و گروه کنترل منفی بوده است(27). اما EBV,HHV-7,HHV6,VZV در هر دو گروه مثبت بوده اند که میزان آنها در گروه بیماران M.S بالاتر بوده که از میان این ویروس ها EBV وHHV-7 درصد بالاتری را به خود اختصاص داده اند.

هدف ازاین مطالعه تعیین وجود ویروس هرپس انسانی تیپ 6و7 به روش RT PCR - P.C.R ، در نمونه های CSF بیماران مبتلا به M.S می باشد.

1. فراوانی DNA هرپس سیمپلکس انسانی  تیپ6 در C.S.F بیماران مبتلا به M.S چقدر است؟
2. فراوانی DNA هرپس سیمپلکس انسانی  تیپ 7در C.S.F بیماران مبتلا به M.S   چقدر است؟

تعیین مولکولار هرپس سیمپلکس تیپ6  و 7 انسانی در بیماران مبتلا به مالتیپل اسکلروزیس(MS) مراکز درمانی شهر زاهدان

1. تعیین  فراوانی DNA هرپس سیمپلکس انسانی  تیپ6 در C.S.F بیماران مبتلا به M.S
2. تعیین فراوانی DNA هرپس سیمپلکس انسانی تیپ 7 در CSF  بیماران مبتلا به M.S

مرکز تحقیقات بیماری های عفونی-گرمسیری دانشگاه علوم پزشکی زاهدان

P.C.R: از حساس ترین روش های تشخیصی برای بررسی های مولکولی و ردیابی ژن های وابسته به عوامل بیماری زا می باشد.

: یکی از ویروس های خانواده هرپس ویریده می باشد که در گروه 6این خانواده قرار میگیرد و توانایی ایجاد بیماری در انسان را دارد.H.H.V-6

توصیفی - مقطعی

جامعه مورد مطالعه شامل کل بیماران مبتلا به M.S می باشد .

معیارهای ورود بیماران: تب توام با یکی از علایم(تهـوع اسـتفراغ، سـردرد، تـشنج، خـواب آلـودگی) وجـود علایـم گرفتاری سیـستم عـصبی مرکـزی در هنگـام ورود شـامل علایم مننژه مثبت(سـفتی گـردن، کرنیـگ وبرودزنـسکی) افزایش فشارداخل جمجمه، یافته هایعـصبی غیرطبیعـی و.... بود.

معیارهای خـروج بیمـاران شـامل مثبـت بـودن کشت باکتریـایی ( ازخـون، مـایع نخـاع یـا سـایر نـواحی استریل بدن) تغییرات مایع نخاع به نفع مننژیت باکتریال، وجود سایر بیماریها به جز مننگو آنسفالیت آسپتیک.

 .با توجه به اینکه کل بیماران msدر دسترس به نظر میرسد چیزی در حدود90نفر باشند لذا در این مطالعه 85   بیمار با تشخیص قطعی بیماری مولتیپل اسکلروزیس مورد مطالعه قرار خواهند گرفت.

این مطالعه  بـر روی مـایع نخـاع بـه دست آمده85 بیمار بین1 ماه تا 4 ماه بستری در بخــش های مختلف مراکز درمانی شهر زاهدان انجام گرفت. بیماران مبتلا به تب همـراه بـا اختلالات CNS با روش نمونه گیری مستمرـ آسان انتخاب شدند. بیمارانی که بعد از معاینات اولیه ویا تغییرات تصویر برداری و یـا وجـود تغییـرات بـه نفـع مننژیـت باکتریـال تشخیص نهایی با علل غیر ویروسی مطـرح شـده بودنـد از ابتدا حذف شدند. از سایر موارد درگیـری سیـستم عـصبی فقط بیمارانی وارد مطالعه شدند که با نظر پزشک نیـاز بـه انجام پونکسیون مایع نخاع داشتند. پس از انجام آزمایشات تکمیلی مانند کشت در محیط باکتک ، پـی سـی آر و . . . (در صـورتی که بـا تـست هـای موجـود بـه تـشخص نرسـیده بودنـد ) پرسشنامه تکمیل گردید.

جهت جمع آوری داده ها از فرم های اطلاعاتی استفاده می شود

تهیه نمونه

بعد از انجام کارهای معمول در امر ضد عفونی کردن، 2 سی سی از نمونه مایع مغزی نخاعی داخل یک فایلکن ریخته می شود و به مرکز تحقیقات بیماریهای عفونی ارسال می شود.در ضمن تمام مشخصات مربوط به بیمار در پرسشنامه درج می گردد. . تشخیص عفونتهای باکتریال با استفاده از کشت خـون و مایع نخاع بود کـه عـلاوه بـرکـشت معمـولی درمحـیط (Becton Dickenson Company )باکتک نیزکشت داده شـد تـــست لاتکـــس ســـریع بـــروی مـــایع نخـــاع بـــا اســتفاده از BD Directigen و تــست کومبــو مننژیــت صــورت نیــز ( Becton Dickinson, Maryland, USA) گرفت. نمونه در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری می شوند تا زمانی که تعداد نمونه ها به 80 عدد برسد.سپس از حالت فریز در آورده و مهیا می شوند.

انجام آزمایش P.C.R و استخراج DNA

جهت انجام تست استخراج DNA: نمونه مایع مغزی نخاعی از80- درجه سانتیگراد در آورده و برای استخراج آماده می شوند بدین صورت که برای استخراج از کیت کیاژن یا اینوتیروژن استفاده می شود.کیت های نامبرده از نمایندگی های داخل کشور تهیه می شوند.

ابتدا با اسـتفاده از کیـت High pure template PCR kit (Rosche, Germany)  و با توجه به دستورالعمل موجود در آن ، ژنوم ویـروس از 200 میکرولیتر مایع مغـزی- نخـاعی اسـتخراج شـد و در 100 میکرولیتر از بـافر Elution قـرار گرفـت DNA. اسـتخراج شده نهایتاً تا زمان انجام آزمایـشات در فریـزر 80- درجـه سـانتیگراد نگهـداری شـد.  آزمـایش Real Time PCR بـا HHV6 and HHV7 Real –TM Quant کیـت از استفاده بــا مطــابق و kit (Sacace Biotechnologies, Italy) دســتورالعمل شــرکت ســازنده انجــام شــد. در ایــن روش بــصورت همزمــان دو ویــروس HHV6 ,HHV7 مــورد شناسایی قرار می گیرند ، جهت ویـروس HHV6 قـسمتی از ژن پلیمراز و جهـت ویـروس HHV7 قـسمتی از ناحیـه ژنیU42 مورد استفاده قـرار مـی گیـرد. مخلـوط واکـنش شامل 15 میکرولیتـر از Master Mix و 10 میکرولیتـر از DNA استخراج شده می باشد. پس از اضافه کردن مـوارد فوق به تیوبهـای0/2 اسـتریل، در دور 13000 g بـه مـدت چنـد ثانیـه Quick Spin مـی شـوند. همچنـین جهـت کنتــرل مثبــت و منفــی از ویالهــای کنتــرل مثبــت و منفـــی موجـــود درکیـــت اســـتفاده میـــشود. ســـپس میکروتیوبهای آماده شده جهت انجام تـست ، بـه دسـتگاه منتقل مـی شـوند. در ایـن مطالعـه از Rotor Gene 6000 شده استفاده (Corbett Research, Australia, and USA) است و پروتکل دمایی مطابق با جدول زیر بود.

انجام تست الکتروفورز:

محصول P.C.R یا پروداکت جهت بررسی حضور یا حضور باند الکتروفورز می شود.برای انجام الکتروفورز ابتدا ژل آگاروز 5/1% تهیه می شود.در چاهک اول ژل LADDER ریخته می شود که جهت تشخیص یا تعیین اندازه باند می باشد.در چاهک دوم از کنترل مثبت استفاده می شود.در چاهک سوم از کنترل منفی استفاده می شود که به جای DNA ی الگو از آب مقطر استفاده می شود.دربقیه چاهک ها محصول P.C.R تست ها load می شود سپس ژل داخل تانک الکتروفورز قرار داده می شود و الکتروفورز انجام می شود.سپس ژل داخل محلول حاوی رنگ اتیدیوم بروماید قرار داده می شود تا باندهای تشکیل شده روی ژل رنگ آمیزی شوند.در مرحله آخر ژل داخل دستگاه ژل داک قرار داده می شود تا حضور باند بررسی شود.

 توصیف داده های کیفی با جدول توزیع فراوانی (مطلق ونسبی) انجام می شود.

راهنمای عمومی اخلاق در پژوهشهای علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی  در جمهوری اسلامی ایران

1. هدف اصلی هر پژوهش‌باید ارتقای سلامت انسان‌ها توأم با رعایت کرامت و حقوق ایشان باشد.
2. در پژوهش بر آزمودنی انسانی، سلامت و ایمنی فرد فرد آزمودنی‎ها در طول و بعد از اجرای پژوهش، بر تمامی مصالح دیگر اولویت دارد. هر پژوهشی که بر روی آزمودنی انسانی انجام می‌گیرد، باید توسط افرادی طراحی و اجرا شود که تخصص و مهارت بالینی لازم و مرتبط را داشته باشند. در کارآزمایی‌های بالینی  بر روی بیماران یا داوطلب‌های سالم نظارت پزشک دارای مهارت و دانش متناسب الزامی میباشد.

13-کسب رضایت آگاهانه و آزادانه در هر پژوهشی که بر روی آزمودنی انسانی اجرا می‌شود، الزامی است. این رضایت باید به شکل کتبی باشد. در مواردی که اخذ رضایت آگاهانه‌ی کتبی غیر ممکن یا قابل صرف‌نظر باشد، باید موضوع با ذکر دلایل به کمیته‌ی اخلاق منتقل شود. در صورت تأیید کمیته‌ی اخلاق، اخذ رضایت کتبی قابل تعویق یا تبدیل به رضایت شفاهی یا ضمنی خواهد بود.

راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی در جمهوری اسلامی ایران

3- تمامی پژوهش‌ها بر روی عضو و بافت انسانی، پیش از اجرا، باید مورد تأیید کمیته‌ی اخلاق در پژوهش مرتبط قرار گیرد. کمیته‌ی اخلاق در پژوهش حق دارد که در تمامی مراحل پژوهش بر آن نظارت داشته باشد. پژوهشگران باید در این زمینه با کمیته‌ی اخلاق در پژوهش همکاری کنند.

6- تمامی اطلاعاتی که از صاحبان عضو یا بافت مورد پژوهش، جمع‌آوری و ثبت می‌شود، راز حرفه‌ای تلقی می‌‌شود؛ از این ‌رو، تمامی اصول و ملاحظات مربوط به رازداری و حفظ حریم شخصی، باید در مورد آن‌ها مراعات شود.

9- پژوهشگر موظف است که تمهیدات لازم ایمنی، از جمله آزمون‌های غربالگری و وسایل محافظت‌کننده را برای جلوگیری از انتقال آلودگی از اجزای بدنی مورد استفاده به هر فرد دیگر، اعم از پژوهشگران، آزمودنی‌ها یا سایر افرادی که در فرایند پژوهش با این مواد سروکار خواهند داشت، پیش‌بینی و تأمین کند.

12- در صورت کمبود بافت یا عضو، باید استفاده‌های درمانی بر استفاده‌های پژوهشی اولویت داده شود. 

-مشکل تهیه مواد وامکان طولانی شدن زمان دریافت آنها

سعی می شود حتی المقدور از مواد و وسایلی استفاده شود که در کشور به طور روتین موجود است

  (multiple sclerosis) MSو   (HSV-6)  مالتیپل اسکلروزیس

1.  Dreyfus DH. Autoimmune disease: A role for new anti-viral therapies Autoimmunity Reviews. 2011;11(2):88-97.

2.         Confavreux C, Vukusic S. Natural history of multiple sclerosis: a unifying concept. Brain. 2006;129(3):606-16.

3.         Confavreux C, Vukusic S, Moreau T, Adeleine P. Relapses and Progression of Disability in Multiple Sclerosis. New England Journal of Medicine. 2000;343(20):1430-8.

4.         Grant, Alexander. Multiple Sclerosis and Related Disorders Clinical Guide to Diagnosis, Medical Management, and Rehabilitation. New York, NY: Demos Medical, 2013. Print.

5.         Ransohoff RM, Hafler DA, Lucchinetti CF. Multiple sclerosis[mdash]a quiet revolution. Nat Rev Neurol. 2015;11(3):134-42.

6.         Swanborg RH, Whittum-Hudson JA, Hudson AP. Infectious agents and multiple sclerosis—are Chlamydia pneumoniae and human herpes virus 6 involved? Journal of Neuroimmunology. 2003;136(1–2):1-8.

7.         Challoner PB, Smith KT, Parker JD, MacLeod DL, Coulter SN, Rose TM, et al. Plaque-associated expression of human herpesvirus 6 in multiple sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1995;92(16):7440-4.

8.         Dendrou CA, Fugger L, Friese MA. Immunopathology of multiple sclerosis. Nat Rev Immunol. 2015;15(9):545-58.

9.         Thornton AM. 5.04 - Regulatory T Cells. In: McQueen CA, editor. Comprehensive Toxicology (Second Edition). Oxford: Elsevier; 2010. p. 87-107.

10.       Knox KK, Brewer JH, Henry JM, Harrington DJ, Carrigan DR. Human Herpesvirus 6 and Multiple Sclerosis: Systemic Active Infections in Patients with Early Disease. Clinical Infectious Diseases. 2000;31(4):894-903.

11.       Soldan SS, Berti R, Salem N, Secchiero P, Flamand L, Calabresi PA, et al. Association of human herpes virus 6 (HHV-6) with multiple sclerosis: increased IgM response to HHV-6 early antigen and detection of serum HHV-6 DNA. Nature medicine. 1997;3(12):1394-7.

12.       Khaki M, Ghazavi A, Ghasami K, Rafei M, Payani M, Mosayebi G. Anti-human herpes virus-6 antibodies titer in patients with multiple sclerosis in Markazy Province. Arak University of Medical Sciences Journal. 2009;12(2):45-50.

13.       Persson A, Bergström T, Lindh M, Namvar L, Studahl M. Varicella-zoster virus CNS disease—Viral load, clinical manifestations and sequels. Journal of Clinical Virology. 2009;46(3):249-53.

14.       Kocazeybek B, Karatoka B, Aslan M, Saribas S, Altintas A, Ergin S, et al. R2109 The role of Chlamydophila pneumoniae and human herpes virus 6 in aetiopathogenesis of multiple sclerosis and the relation of multiple sclerosis with apolipoprotein E genotypes. International journal of antimicrobial agents. 2007;29, Supplement 2:S610.

15.       Brudek T, Lühdorf P, Christensen T, Hansen HJ, Møller-Larsen A. Activation of endogenous retrovirus reverse transcriptase in multiple sclerosis patient lymphocytes by inactivated HSV-1, HHV-6 and VZV. Journal of Neuroimmunology. 2007;187(1–2):147-55.

16.       Shameem S, Vinod Kumar CS, Neelagund YF.Bacterial meningitis: rapid diagnosis and microbialprofile: a multicentered study. J Commun Dis 2008 Jun; 40(2):111-20.

17.       Pohl-Koppe A, Blay M, Jager G, Weiss M.

Human herpes virus type 7 DNA in the cerebrospinalfluid of children with central nervous system diseases. Eur J Pediatr 2001; 160:351–8.

18.       Dreyfus DH. Herpesviruses and the microbiome. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2013;132(6):1278-86.

19.       Yao K, Honarmand S, Espinosa A, Akhyani

N, Glaser C, Jacobson S. Detection of human

herpesvirus-6 in cerebrospinal fluid of patients with encephalitis. Annals of Neurology 2009; 65(3):257-67.

20.       Virtanen JO, Farkkila M, Multanen J, Uotila

L, Jaaskelainen AJ, Vaheri A, et al. Evidence for human herpesvirus 6 variant an antibodies in multiple sclerosis: diagnostic and therapeutic implications. J of Neurovirology 2007; 13(4):347-52.

21.       Sanders VJ, Felisan S, Waddell A, Tourtellot WW. Detection of herpes viridae in postmortem multiple sclerosis brain tissue and controls by polymerase chain reaction. J Neuroviral 1996; 2(4): 249-58

22.       Christensen T. Human herpes viruses in M.S. Int M.S J 2007; 14(2): 41-7.

23.       Ferrante P, Mancuso R, Pagani E, et al. Molecular evidences for a rol of HSV-1 in multiple sclerosis clinical acute attack. J Neurovirol 2000; 6(2):109-14.

24.       Siddharama P, Subramaniam S. The role of infections in the pathogenesis and course of multiple sclerosis. Ann Indian Acad Neurol 2010; 13(2):80-86.

25.       Sundstorm P, Juto P, Wadell G, et al. An altered immune response to Epstein-Barr virus in multiple sclerosis. Neurology 2004; 62: 2277-2282.

26.       Bantinac T, Petranovic D, Zamolo G, et al. Lyme borreliosis and multiple sclerosis are associated with primary effusion lymphoma. Med Hypotheses 2007; 69(1):117-9.

27.       Khaki M, Ghazavi A, Ghasemi K, et al. [Evaluation of viral antibodies in Iranian multiple sclerosis patients] Persian. Department of Immunology and Microbiology 2011; 16(3): 224-8.