ارتباط پلی مورفیسم G/A -1087 ژن اینترلوکین- 10 با پریودنتیت مزمن

بیماری های پریودونتال، به دنبال التهاب بافتهای پریودونشیوم در پاسخ به عفونت حاصل از گروهی از باکتری های تحریک کننده مکانیسم های سیستم ایمنی ذاتی و اکتسابی میزبان به وجود می آیند(1). در بین اشکال مختلف بیماری های پریودنتال، سرعت پیشرفت این بیماری اهسته تا متوسط می باشد و معمولا در همراهی با حضور عوامل اتیولوژیک می باشد(2, 3). اتیولوژی این بیماری التهابی، پیچیده و مولتی فاکتوریال است و 70%درصد افراد69-40سال را در بر می گیرد(4). در بیماری پریودونتیت، عوامل ژنتیکی(5, 6) علاوه بر باکتری ها(7, 8)، بیماری های متابولیکی همچون دیابت(9)، فاکتورهای محیطی همانند سیگار(10)، چاقی(11, 12) و استرس(13)، روی فرد اثر میگذارد. مطالعات دوقلوها و خانوادگی شواهدی را در ارتباط به نقش ژنتیک در پریودونتیت مزمن نشان داد. نتایج دوقلوها نشان میدهد بین 38 تا 82% تفاوت های جمعیتی در ارزیابی ها به فاکتورهای ژنتیکی برمیگردد(14, 15) .

پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی ,(Single Nucleotide Polymorphism)تغییرات تک نوکلئوتیدی با فراوانی بیشتر از 1% در یک موقعیت خاص توالی DNA بین افراد مختلف هستند که به طور میانگین در هر 1000نوکلئوتید تکرار می شوند(16). دلایل مختلفی برای همراهی بین SNP و بیماری ها ذکر گردیده است از جمله قرارگیری در مجاورت یک ژن مستعد کننده، نقش احتمالی خود SNP در استعداد ابتلا به بیماری مورد نظر(17). این ارتباطات به محققان اجازه کشف لوکوس های حساسیت ژنتیکی افراد به پیشرفت بسیاری از بیماری ها را می دهد. بدنبال شناسایی SNPهای مرتبط با بیماری، دانشمندان نواحی نزدیک این SNP ها را برای کشف ژن یا ژن های مسئول بیماری مورد آزمایش قرار میدهند.

امروزه در پریودنتیت عمدتاپلی مورفیسم های ژنی درگیر در مکانیسسم های دخیل در تخریب بافت های میزبان بررسی می شود(18). از نظر محققین چندین ژن مختلف مانند TNFα  و IL-4 ، IL-1 ، IL-6 ، IL-10 ، IFN- δ  در ریــسک ابــتلا بــه پریودنتیــت نقــش دارنـد. ژن کد کننده IL-10 روی کروموزوم 1q31-q32 قرار دارد.اینترلوکین10 سایتوکاین ضدالتهابی و عامل پرولیفراسیون سلول B می باشد که اثرات چندگانه ای روی سیستم ایمنی و التهاب، بر جای می گذارد(19).مونوسیت ها، ماکروفاژها و سلول T(CD4  Th2, Th1, Th17, CD8 T ) این سایتوکاین را تولید کرده و طیف وسیعی از اثرات بیولوژیک را از جمله 1) مهار سلول های T و ماکروفاژها از طریق مهار بیان مولکول  CD80و جلوگیری از فعال سازی سلول T 2) سرکوب التهاب و 3) جلوگیری از تخریب بافتی دارد(20-22). IL-10 نقش مهمی در تنظیم سایتوکاین های پیش التهابی مثل IL-1 و TNF-α ایفا می کند و هم چنین دارای اثر محافظتی از طریق مهار متالوپروتئیناز ها و رسپتور فعال کننده عامل هسته ای κβ می باشد.

تعداد زیادی پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی در ناحیه پروموتور ژن اینترلوکین-10 شناسایی شده است. پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی در ناحیه پروموتور ژن اینترلوکین-10 در لوکوس 1087,592 و 819 درارتباط با شماری از بیماری های التهابی مانند آرتریت روماتوئید، لوپوس اریتماتوز سیستمیک و پریودنتیت مزمن می باشد. شواهدی وجود دارد که این پلی مورفیسم ها می توانند در ارتباط با بیان افتراقی اینتر لوکین-10 و استعداد ابتلای افراد به بیماریهای پریودنتال باشد(23). در این جا به بررسی پلی مورفیسم تعدادی از این موقعیت ها می پردازیم.

Jasmin Crena و همکاران ارتباط پلی مور فیسم تک نوکلئوتیدی لوکوس 1087 ناحیه پروموتر ژن IL-10را با پریودنتیت مزمن شدید در بیماران غیر سیگاری بررسی کردند. آنها ژنوتیپ  45 فرد سالم و 46 فرد با پریودنتیت مزمن را با میانگین سنی 50-30 سال با تکنیک  AS-PCR تعیین کردند و سپس نشان دادند که فراوانی ژنوتیپی و اللی بین گروه های مطالعه تفاوت معنی دار داشت و شیوع ژنوتیپ اللی AA در لوکوس 1087اینتر لوکین 10در پریودنتیت مزمن در مقایسه با افراد سالم بالاتر بود(24).

Scarel Caminaga  و همکارانش پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی در پروموتور ژن اینترلوکین-10 و ارتباط آن با پریودنتیت مزمن را ارزیابی کردند.فراوانیSNP 592- و819- بین گروه کنترل و بیمار تفاوت داشت. هاپلوتایپ ACC در گروه کنترل و هاپلوتایپ ATA در گروه بیمار شایع تر بود. هاپلوتایپ ATA حساسیت به پریودنتیت مزمن را در زنان افزایش می دهد. هاپلوتایپ ACC\GCC در گروه کنترل غالب بود(25).

 ,SM Jaradatارتباط پلی مورفیسم ناحیه پروموتور اینتر لوکین 10 را با پریودنتیت مزمن و مهاجم در دانشگاه علوم و مهندسی اردن بررسی کردند.فراوانی آلل های A1087- و A597 - ، در پریودنتیت مزمن نسبت به گروه کنترل بالاتر بود. ژنوتیپ آللی Aمثبت (GA,AA) در موقعیت 1087- وژنوتیپ اللی Aمثبت(CA,AA) در موقعیت 597- همراه با افزایش ریسک پریودنتیت، بود. فراوانی ژنوتیپ ها بین پریودنتیت مهاجم لوکالیزه و گروه کنترل تفاوت معنی داری را نشان داد(21).

با توجه به شیوع بالای پریودونتیت مزمن در کشور و این نکته که تعداد و نوع ژنهای تغییر یافته در بیماری های یکسان در گروه های نژادی مختلف الزاما یکسان نیست (26) و مطرح شدن ژن IL-10 در اتیولوژی پریودونتیت و بعضی بیماری های سیستمیک، این مطالعه جهت بررسی پلی مورفیسم ژنی IL-10  در افراد مبتلا به پریودونتیت مزمن و سالم در شهر زاهدان  طراحی شده است.

1. فراوانی پلی مورفیسم  -1087GG در ژن  IL-10در در مبتلایان به پریودونتیت مزمن و شاهد متفاوت است.
2. فراوانی پلی مورفیسم  -1087GA در ژن  IL-10در در مبتلایان به پریودونتیت مزمن و شاهد متفاوت است.
3. فراوانی پلی مورفیسم  -1087AA در ژن  IL-10در در مبتلایان به پریودونتیت مزمن و شاهد متفاوت است.

بررسی ارتباط پلی مورفیسم -1087 G/A  ژن اینترلوکین-10 با پریو دنتیت مزمن

1. مقایسه توزیع فراوانی ﭘﻠیﻣﻮرﻓیﺴم -1087 GG در ژن IL-10 در مبتلایان به پریودنتیت با افراد سالم
2. مقایسه توزیع فراوانی ﭘﻠیﻣﻮرﻓیﺴم  -1087 GAدر ژن IL-10 در مبتلایان به پریودنتیت با افراد سالم
3. مقایسه توزیع فراوانی ﭘﻠیﻣﻮرﻓیﺴم  -1087 AAدر ژن IL-10 در مبتلایان به پریودنتیت با افراد سالم

مراکز دانشگاهی

پریودنتیت مزمن: التهاب مزمن و از دست رفتن ساختار پریودنشیوم که همراه با مقادیری از پلاک یاجرم دندانی است، می باشد. پریودنتیت مزمن غالبا در بالغین اتفاق می افتد و موسوم به پریودنتیت بالغین می باشد اما این بیماری می تواند در افراد جوان نیز رخ بدهد(27).

Interleukin-10 :سایتوکاین تولید شده توسط بسیاری از سلول ها مثل لنفوسیت ها، مونوسیت ها، سلول های دندریتیک وسلول های اپیتلیال که اثراتی را مثل تنظیم سیستم ایمنی و التهاب به همراه دارد، می باشد(19).

:Single nucleotide polymorphism پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی، تغییرات تک نوکلئوتیدی در موقعیت های مختلف در یک توالی DNA بین افراد مختلف هستند که به طور میانگین در هر 1000نوکلئوتید تکرار می شوند(16).

 مورد-شاهدی

بیماران مراجعه کننده به بخش پریودونتولوژی دانشکده دندانپزشکی زاهدان، پس از معاینه و تایید متخصص مربوطه، برای آن ها چارت پریودونتال پر میشود. در صورت تشخیص پریودونتیت مزمن، وارد مطالعه میشوند(ضمیمه شماره یک)

افراد سالم از بین همراهان مراجعه کنندگان انتخاب می شوند.

معیار ورود:

1. افراد از لحاظ سیستمیک سالم باشند.
2. دچار بیماری پریودنتیت مزمن باشند.
3. افراد حداقل 20 دندان باقی مانده داشته باشند
4. غیر سیگاری باشند
5. افراد سن بالای 20 سال داشته باشند.

معیار خروج:

1. عدم رضایت فرد برای ادامه در مطالعه
2. خراب شدن نمونه گرفته شده از بیمار

برای بررسی پلی مورفیسم در افراد مبتلا به پریودنتیت دهانی، حداقل  70 نفر که شاخص های ورود به مطالعه را داشته باشند انتخاب می شوند و مورد مطالعه قرار می گیرند. گروه شاهد نیز از حداقل 70نفر از  افراد سالم که از نظر سن و جنس با گروه بیمار یکسانند و شاخص های شرکت در مطالعه را دشته باشند انتخاب خواهندشد.

نمونه گیری به روش آسان از افراد مراجعه کنننده و همراهان آنان تا رسیدن به حجم نمونه ی مورد نظر، انجام میشود. دو گروه از لحاظ سن و جنس همسان سازی میگردند (به صورت گروهی) .

معاینه ی پریودونتال به وسیله پروب ویلیامز به قطر 1میلی متر و پرکردن چک لیست پریودونتال برای بیماران صورت میگیرد و بررسی پلی مورفیسم ژنی با روشهای مولکولی صورت خواهد گرفت ( ضمیمه شماره دو).

در این مطالعه تحلیلی، 70فرد سالم و70 فرد مبتلا به پریودونتیت مزمن شدید، از بین بیماران مراجعه کننده به بخش پریودونتولوژی دانشکده دندانپزشکی زاهدان و همراهان آنان به روش نمونه گیری آسان انتخاب میشوند. گروه های کنترل  و شاهد با توجه به معیارهای ورود و خروج به طور صحیح انتخاب میشوند. تمام افراد شرکت کننده در جریان نحوه کار و هدف مطالعه قرار گرفته و فرم رضایت آگاهانه به صورت داوطلبانه توسط آن ها امضا میشود.

بعد از انتخاب افراد، ,PD(probing depth) ,BOP(bleeding on probing) ,PI(Plaque index) CAL(clinical attachment loss) با پروب ویلیامز به قطر یک میلی متر در 6 ناحیه از دندان ها، اندازه گیری وتعداد دندان های باقیمانده ثبت میشود( ضمیمه شماره یک ). افرادی که CAL کمتر از 4 میلی متر داشته باشند در گروه کنترل و افرادی که  CAL بیشتر مساوی 5میلی متر داشته باشند در گروه مطالعه قرار میگیرند.

2 سی سی نمونه خون از هریک از افراد تحت مطالعه در لوله های حاوی EDTA جمع آوری و تا مرحله ی استخراج DNA در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری می شوند. سپس DNA از نمونه های خون به روش Salting out تخلیص می شود. پرایمر های اختصاصی برای روش RFLP طراحی و سپس شرایط PCR بهینه می شود.و DNA سلول های موجود در آن تخلیص می‌شود، پرایمرهای اختصاصی طراحی شده و پس از بهینه سازی شرایط PCR ژنوتیپ گروه شاهد و مورد با این روش مورد ارزیابی قرارمی گیرد. محصول PCR را روی ژل آگارز 2% برده، با اتیدیوم بروماید رنگ آمیزی کرده و محصولات PCR مورد ارزیابی قرارگرفته وژنوتیپ فرد تعیین می گردد(24).در نهایت کلیه اطلاعات و داده ها وارد نرم افزار آماری SPSS می شوند و برای تحلیل از تست های آماری مربع کای دو استفاده خواهد شد.

برای توصیف داده ها ، از آزمون  کای دو و تست فیشر استفاده خواهد شد(ضمیمه شماره سه)

ضمیمه شماره 3

در کلیه مراحل، محققان موظف به رعات اصول اخلاقی هستند. رضایت نامه ی شرکت در طرح توسط همه شرکت کنندگان پر و امضا خواهد شد. (ضمیمه شماره 4)

بر اساس راهنمای اخلاقی در پژوهش های علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی : در راهنمای عمومی، کدهای اخلاقی 1و2و3و4و5و7و8و10و11و12و13و14و15و16و17و18و19و20و21و22و24و25و26و 27و28و29و30 رعایت می گردد.

بر اساس راهنمای اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی بر روی عضو و بافت انسانی: در راهنمای عمومی کد های 1و2و3و4و6و8و9و12 . فصل 3(پژوهش های شامل پیوند عضو یا بافت از دهنده ی زنده) کدهای 1و2و3و4و5و6و7 نیز رعایت می گردد.

.

کافی نبودن تعداد نمونه ها که با افزایش زمان مطالعه قابل حل است.

پریودنتیت مزمن، اینترلوکین10، پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی

Chronic periodontitis, Interleukin-10, single nucleotide polymorphism

1. Tarannum F, Faizuddin M. Effect of gene polymorphisms on periodontal diseases. Indian journal of human genetics. 2012;18(1):9-19.

2. Chambrone L, Chambrone D, Lima LA, Chambrone LA. Predictors of tooth loss during long-term periodontal maintenance: a systematic review of observational studies. Journal of clinical periodontology. 2010;37(7):675-84.

3. Armitage GC. Periodontal diagnoses and classification of periodontal diseases. Periodontology 2000. 2004;34:9-21.

4. Hamissi J, Shahsavarani MT, Hamissi H. A Comparison of Serum Lipid Profile between Periodontitis Patients and Healthy Individuals. Iranian Red Crescent Medical Journal. 2011;13(4):283-4.

5. Hart TC. Genetic considerations of risk in human periodontal disease. Current opinion in periodontology. 1994:3-11.

6. Laine ML, Farre MA, Garcia-Gonzalez MA, van Dijk LJ, Ham AJ, Winkel EG, et al. [Risk factors in adult periodontitis: polymorphism in the interleukin-1 gene family]. Nederlands tijdschrift voor tandheelkunde. 2002;109(8):303-6.

7. Paster BJ, Olsen I, Aas JA, Dewhirst FE. The breadth of bacterial diversity in the human periodontal pocket and other oral sites. Periodontology 2000. 2006;42:80-7.

8. Berezow AB, Darveau RP. Microbial shift and periodontitis. Periodontology 2000. 2011;55(1):36-47.

9. Campus G, Salem A, Uzzau S, Baldoni E, Tonolo G. Diabetes and periodontal disease: a case-control study. Journal of periodontology. 2005;76(3):418-25.

10. Kubota M, Tanno-Nakanishi M, Yamada S, Okuda K, Ishihara K. Effect of smoking on subgingival microflora of patients with periodontitis in Japan. BMC oral health. 2011;11:1.

11. Chaffee BW, Weston SJ. Association between chronic periodontal disease and obesity: a systematic review and meta-analysis. Journal of periodontology. 2010;81(12):1708-24.

12. Suvan J, D'Aiuto F, Moles DR, Petrie A, Donos N. Association between overweight/obesity and periodontitis in adults. A systematic review. Obesity reviews : an official journal of the International Association for the Study of Obesity. 2011;12(5):e381-404.

13. Dolic M, Bailer J, Staehle HJ, Eickholz P. Psychosocial factors as risk indicators of periodontitis. Journal of clinical periodontology. 2005;32(11):1134-40.

14. Kinane DF, Hart TC. Genes and gene polymorphisms associated with periodontal disease. Critical reviews in oral biology and medicine : an official publication of the American Association of Oral Biologists. 2003;14(6):430-49.

15. Michalowicz BS, Diehl SR, Gunsolley JC, Sparks BS, Brooks CN, Koertge TE, et al. Evidence of a substantial genetic basis for risk of adult periodontitis. Journal of periodontology. 2000;71(11):1699-707.

16. Wright AF. Genetic Variation: Polymorphisms and Mutations.  eLS: John Wiley & Sons, Ltd; 2001.

17. Lehne B, Lewis CM, Schlitt T. From SNPs to Genes: Disease Association at the Gene Level. PloS one. 2011;6(6):e20133.

18. Laine ML, Loos BG, Crielaard W. Gene polymorphisms in chronic periodontitis. International journal of dentistry. 2010;2010:324719.

19. Preshaw PM, Taylor JJ. How has research into cytokine interactions and their role in driving immune responses impacted our understanding of periodontitis? Journal of clinical periodontology. 2011;38 Suppl 11:60-84.

20. Maynard CL, Weaver CT. Diversity in the contribution of interleukin-10 to T-cell-mediated immune regulation. Immunological reviews. 2008;226:219-33.

21. Jaradat SM, Ababneh KT, Jaradat SA, Abbadi MS, Taha AH, Karasneh JA, et al. Association of interleukin-10 gene promoter polymorphisms with chronic and aggressive periodontitis. Oral diseases. 2012;18(3):271-9.

22. Ouyang W, Rutz S, Crellin NK, Valdez PA, Hymowitz SG. Regulation and functions of the IL-10 family of cytokines in inflammation and disease. Annual review of immunology. 2011;29:71-109.

23. Turner DM, Williams DM, Sankaran D, Lazarus M, Sinnott PJ, Hutchinson IV. An investigation of polymorphism in the interleukin-10 gene promoter. European journal of immunogenetics : official journal of the British Society for Histocompatibility and Immunogenetics. 1997;24(1):1-8.

24. Crena J, Subramanian S, Victor DJ, Gnana PP, Ramanathan A. Single nucleotide polymorphism at -1087 locus of interleukin-10 gene promoter is associated with severe chronic periodontitis in nonsmoking patients. European journal of dentistry. 2015;9(3):387-93.

25. Scarel-Caminaga RM, Trevilatto PC, Souza AP, Brito RB, Camargo LE, Line SR. Interleukin 10 gene promoter polymorphisms are associated with chronic periodontitis. Journal of clinical periodontology. 2004;31(6):443-8.

26. Laine ML, Loos BG, Crielaard W. Gene polymorphisms in chronic periodontitis. International journal of dentistry. 2010;2010.

27. Loesche WJ, Grossman NS. Periodontal Disease as a Specific, albeit Chronic, Infection: Diagnosis and Treatment. Clinical Microbiology Reviews. 2001;14(4):727-52.

پریودنتیت بیماری چندعلیتی است که فاکتورهای محیطی و ژنتیکی بر روی آن تاثیرگذار
هستند.در این مطالعه، خون به عنوان یک وسیله تشخیصی مقرون به صرفه برای غربالگری
بیماران مبتلا به پریودنتیت مورد استفاده قرار می گیرد

دارد

تهیه خون روشی آسان و مقرون به صرفه و قابل پیش بینی است و بررسی پلی مورفیسم می توانند غربالگری کننده بیماران مبتلا باشند.

ندارد

ندارد

برای بیمار هزینه ای ندارد

ندارد

تمامی اطلاعات بیمار محرمانه باقی می ماند

-

شرکت من در مطالعه کاملاً اختیاری است و آزاد خواهم بود که از شرکت در مطالعه امتناع نموده یا هر زمان که مایل بودم بدون آنکه تغییری در نحوه رفتار پزشک درمانگر یا نحوه درمان و مراقبت از بیماری اینجانب ایجاد شود از پژوهش مذکور خارج شوم.

با توجه به اطلاعات موجود در این فرم و توضیحات حضوری مجری یا همکاران طرح موافقت خود را با شرکت در این مطالعه اعلان می نمایم. یک نسخه از این فرم به من داده شده و فرصت خواندن آن را داشته ام.

ضمیمه شماره 2- توزیع فراوانی پلیﻣﻮرﻓیﺴم  -1087G/Aدر ژن  IL10 در گروه های مورد مطالعه