بررسی اثر آنژیوتانسین 7-1 و لوزارتان بر آسیب کلیوی ایسکمی/خونرسانی مجدد در مدل موش صحرایی

نارسایی حاد کلیوی(ARF)[1]یکی از مهمترین مشکلات کلینیکی موجود است  که منتج ازایسکمی / خونرسانی مجدد (I/R)[2]میباشد این اختلال در طی هیپولومیا ، شوک سپتیک، پیوند کلیوی، یا جراحی قلب و عروق اتفاق می افتد، و منجر به اختلال عملکرد عروق کلیوی و در نتیجه آسیب جریان خون کلیه و بدتر شدن آسیب اولیه میشود ((1)،(2)).

مکانیسم های مولکولی (I/R) ناشناخته شده اند اما مطابق مطالعات انجام شده فاکتورهای متعددی در آن دخیل میباشند از جمله تولید گونه های واکنش پذیر اکسیژن)ROS([3]،کاهش (  (ATP،نفوذ نوتروفیل و رهایی پپتید های وازواکتیو وفعال شدن آنزیم فسفو لیپاز و ...در آن دخیل میباشد (3).

در این میان سیستم رنین آنژیوتانسین  ( RAS )[4] در آسیب های مربوط به (I/R) از اهمیت برجسته ایی برخوردار است که منجر به آسیب ایسکمی کلیوی در مدل (I/R) میشود(4, 5).

سیستم رنین آنژیوتانسین سالهاست که در  تنظیم فشار خون و هموستاز سدیم که مورد توجه قرار گرفته است. آنژیوتانسین II ( AngII) قویترین محصول بیولوژیکی این سیستم است ، اما پپتیدهای  دیگری از جمله آنژیوتانسین III ، آنژیوتانسین IV ،آنژیوتانسین7-1 هم در این سیستم فعالیت دارند.آنژیوتانسین II موجب انقباض عضله صاف ، افزایش قدرت انقباضی میوکارد قلب ،تحریک تولید آلدوسترون ، تحریک رهایی کاتکول آمین ها ، افزایش فعالیت سیستم سمپاتیک و تحریک تشنگی واشتها برای نمک می شود. آنژیوتانسین II همچنین در تنظیم انتقال سدیم توسط سلولهای اندوتلیال کلیوی نقش دارد. علاوه بر این  ،آنژیوتانسین II در فرایند التهاب ، رشد سلول ، تقسیم سلولی ، آپوپتوز ، مهاجرت وتمایز سلولی نقش دارد. مطالعات کلنیکی و پاراکلنیکی نشان داده اند که آنژیوتانسین II در پاتوژنز بیماری های کلیوی و هیپر تانسیون دخالت دارد و این کار را از طریق فعال شدن گیرنده های خود انجام می دهد. افزایش فعالیت این سیستم نقش مهمی در پیشرفت بیماریهای مزمن کلیوی  دارد(6).

این سیستم دارای دو بازوی متفاوت است بازوی وازو پرسور که توسط که توسط AngII از طریق گیرنده AT₁ عمل کرده  وموجب تنگی رگهای خونی ، پرولیفریشن و استرس اکسیداتیو و ....میشود و بازوی وازودپرسور آن  که شامل گیرنده AT₂و [5]Masمیباشد   که  به ترتیب توسط  AngII و آنژیوتانسین 7-1  فعال می شوند این بازو بعنوان آنتاگونیست فیزیولوژیک گیرنده₁ ATعمل میکند (7).

آنژیوتانسین 7-1 یک هپتا پپتید فعال بیولوژیکی و به عنوان یک جزء وازواکتیو RAS  مطرح می باشد. بررسی خواص وازودپرسور ، وازودیلاتور و آنتی هیپرتانسیو نشان داده است که آنژیوتانسین 7- 1در خنثی سازی عملکردهای فیزیولوژیک آنژیوتانسین II نقش دارد . اما مکانیسم های مسئول این اثرات به درستی شناخته نشده است(8).این هپتاپپتید توسط مسیرهای وابسته و غیروابسته به ACE تشکیل می شود. از جمله می تواند به طور مستقیم از  AngIIتوسط پلی اندوپپتیداز، پلی کربوکسی پپتیداز1 (14)و یا توسط ACE2  تولید شود(15, 16)بیشترین توجه به تشکیل آن از طریق2 ACE از آنژیوتانسین II شده است که در اکثر اندامها وجود دارد(9).آنژیوتانسین 7-1 فاقد فنیل آلانین در موقعیت 8 آنژیوتانسین II است(10)  .

بررسی اثر سایر آنژیوتانسین  ها از  جمله آنژیوتانسین 7-1  در مدل نارسایی کلیه  در مراحل ابتدایی تحقیق می باشد . آنژیوتانسین 7-1 ،  به عنوان پپتیدی  که در بافت کلیه حضور اثرات پیچیده ایی بر هموستاز کلیه اعمال می کند (10-12).این پپتید با اتصال به گیرنده Mas نقش مهمی در خنثی سازی اثرات AngII  روی عروق خونی کلیه و واکنش های پرولیفراتیو مربوط به آن دارد(13).

 از طرف دیگرآنژیوتانسین 7-1 به واسطه گیرنده Mas موجب فعال شدن eNOS و رهایی نیتریک اکساید NO) ) و در نتیجه اتساع عروقی می شود. این اثر بدنبال استفاده از آنتاگونیست آنژیوتانسین 7-1، A779 مسدود می شود(8).

مطالعات قبلی نشان داده اند که آسیب های مربوط به (I/R)موجب به راه اندازی آبشار التهابی میشود که ممکن است منجر به تاخیر عملکرد پیوند وکاهش بقا کلیه پیوند شده شود(14, 15).مهارالتهابی اولیه منجر به کاهش عملکرد این آبشار و کاهش آسیب خواهد شد(16-22).این وضعیت مشابه نقش التهاب در آسیب های (I/R) میوکارد است(23) .

در همین ارتباط افراتی و همکارانش گزارش کرده اند که استفاده از کاپتوپریل به عنوان آنتاگونیست آنزیم ACE  موجب کاهش فرایندهای التهابی کلیه پس از ایسکمی و کاهش آسیب های مربوط به آن می شود(24). در  مطالعه انجام شده توسط سیلویرا و همکارانش گزارش شده که  استفاده از آنژیوتانسین 7-1 در مدل نفروپاتی کلیوی دارای اثرات حفاظتی بوده  و با اثر لوزارتان به عنوان آنتاگونیست گیرنده AT1 قابل مقایسه است و چنین عنوان کرده اند که این اثر به واسطه کاهش سطح سیتوکین ها و کاهش فاکتور نکروز دهنده توموری بتا (TNFß)  می باشد(25).

همچنین گزارش شده که ایسکمی با رهایی آنژیوتانسین II موجب آسیب کلیوی و استفاده از لوزارتان بعد ایسکمی موجب بهبود فیلتراسیون گلومرولی و افزایش جریان ادارار شده و دفع سدیم ناشی از ایسکمی را کاهش داده است (26).

باتوجه به اهمیت پیشگیری از آسیب های مربوط به ایسکمی / خونرسانی مجدد و نقش سیستم رنین آنژیوتانسین  در این مطالعه برآن شدیم که به بررسی   عملکرد سیستم RAS بر آسیب کلیوی ناشی از ایسکمیک/خونرسانی مجدد بپردازیم .

1- میزان سطح سرمی  Crدر پایان مطالعه در گروه های مورد و شاهد متفاوت است.

2--میزان سطح سرمی  BUNدر پایان مطالعه در گروه های مورد و شاهد متفاوت است

2- میزان سطح سرمی   MDA در پایان مطالعه در گروه های مورد و شاهد متفاوت است

3-.میزان سطح سرمی LDH در پایان مطالعه در گروههای مورد و شاهدمتفاوت است.

5-میزان سطح سرمی نیتریت در پایان مطالعه در گروه های مورد و شاهد متفاوت است.

6- میزان سطح آسیب دیدگی بافت کلیه در پایان مطالعه در گروه های مورد و شاهد متفاوت است.

بررسی اثر آنژیوتانسین 7-1 و  لوزارتان بر آسیب کلیوی ایسکمی/خونرسانی مجدد در مدل موش صحرایی

1-تعیین ومقایسه میانگین سطح سرمیCrو در پایان مطالعه در گروه های مورد و شاهد

2-.تعیین ومقایسه میانگین سطح سرمی MDAدر پایان مطالعه در گروههای مورد و شاهد

3-تعیین و مقایسه میانگین سطح سرمی LDH در پایان مطالعه در گروه های مورد وشاهد

4-تعیین ومقایسه میانگین سطح سرمی BUNدرپایان مطالعه در گروههای مورد و شاهد

5-تعیین ومقایسه میزان آسیب دیدگی بافت کلیه در پایان مطالعه در گروه های مورد و شاهد

6-تعیین ومقایسه میانگین سطح سرمی نیتریت در پایان مطالعه در گروههای مورد وشاهد

دانشگاهها ومراکز تحقیقاتی

آسیب بافتی ناشی از ایسکمی /خونرسانی مجدد،بدنبال برگشت جریان خون بافت پس از یک دوره کمبود اکسیژن ومواد غذایی رخ میدهد وآسیب ایجادشده حاصل القای استرس اکسیداتیو والتهاب میباشد.

تجربی –مداخله ای

موش صحرایی نر

سن 7-9 هفته

در محدوده وزنی 180-225از نژاد:  ویستار

8گروه  موش صحرایی 8تایی بر اساس مطالعات قبلی

انتخاب 64 سر حیوان با توجه به ملاک های مورد مطالعه صورت گرفته و قرار گرفتن حیوانات در 8 گروه به صورت تصادفی می باشد.

انتخاب 64  سر حیوان با توجه به ملاک های مورد مطالعه صورت گرفته و قرار گرفتن حیوانات در8 گروه به صورت تصادفی می باشد

در ابتدا 64 سر رات نر از نژاد ویستار با میانگین وزنی بین 180 تا 225 گرم انتخاب و پس از سازگاری با محیط آزمایشگاه حیوانات جهت ایجاد مدل ایسکمی – ری پرفیوژن کلیوی مورد عمل جراحی قرار خواهند گرفت.

مراحل انجام عمل جراحی

پس از تقسیم بندی حیوانات در8گروه، و القاء بیهوشی با کلرا هیدرات و ایجاد برش در ناحیۀ پهلوی چپ و راست هر دو کلیه کاملاً خارج شده و ورید و شریان کلیه ، در نزدیکی ناف کلیه با استفاده از کلمپ به طور کامل و به مدت 45 دقیقه مسدود خواهد شد(در گروه شم شریان و ورید کلیه کلمپ نمی شود)

بعد از پایان 45 دقیقه کلمپ باز شده و پس از اطمینان از برقراری مجدد جریان خون به کلیه ها، آنها را به داخل حفرۀ صفاقی باز گردانده و عضله و پوست جداگانه بخیه خواهد شد. بعد از اطمینان از هوشیاری کامل ، حیوانات را به لانه انتقال خواهیم داد.

فرایند آزمایش

بعد از پایان 24 ساعت ریپرفیوژن حیوانات مجددا بیهوش شده خونگیری از قلب انجام میشود و بعد از جمع اوری سرم از نمونه ها برای اندازه گیری MDA, LDH و نیتریت استفاده خواهد شد در نهایت کلیه راست حیوان جهت انجام آزمایش و تشخیص آسیب بافتی در فرمالین 10% فیکس خواهد شد وکلیه چپ حیوان هموژنیزه وبرای اندازه گیری سطح نیتریت،MDAاستفاده خواهد شد . برای ارزیابی پاتولوژی برای بافت کلیه رنگ آمیزی اختصاصی پاس برای رویت آسیب بافتی در غشاء گلومرول(GBM[1]) و توبول های کلیوی (شامل سلول و TBM[2]) انجام می شود. آسیب بافتی کلیوی به شرح زیر  نمره دهی می شود که بصورت یه سو کور توسط پاتولوژیست انجام می گردد

نمره صفر:بدون آسیب

نمره1:نکروز تک سلولی جدا

نمره2:نکروزتوبولی25%<

نمره3-نکروزتوبولی25-50%

نمره4-نکروز توبولی50%<

آسیب بافتی با توجه به رفرنس 42

داده ها توسط نرم افزار SPSS  ورژن17   مورد بررسی قرار خواهد گرفت. برای آنالیز داده های مربوط به نیتریک اکسید ، BUN  -  Cr ،........و  مقایسه بین گروه ها از آنالیز واریانس یک طرفه و دوطرفه و تست تعقیبی توکی استفاده خواهد شد .  برای مقایسه نتایج آسیب شناسی از آزمون کروسکال والیس و من - ویتنی استفاده خواهد شد

در طول مطالعه بر اساس پروتوکل کار با حیوانات آزمایشگاهی رفتار شده وانجام کار به تایید کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی زاهدان خواهد رسید،وهمچنین چک لیست کار با حیوانات آزمایشگاهی معدب وزارت متبوعه تکمیل وپیوست می شود.

محدودیت زمانی- با توجه به شرایط تحریم ایجاد مشکل در تهیه کیت یا مواد خارجی احتمالی مورد نیاز

آنژیوتانسین 7-1،لوزارتان ، آسیب کلیوی ایسکمی / خونرسانی مجدد 

Ang1-7, Losaratan, Renal ischemia/reperfusion

1.         Versteilen AM, Korstjens IJ, Musters RJ, Groeneveld AJ, Sipkema P. Rho kinase regulates renal blood flow by modulating eNOS activity in ischemia-reperfusion of the rat kidney. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 2006;291(3):F606-F11.

2.         Molitoris BA, Sutton TA. Endothelial injury and dysfunction: role in the extension phase of acute renal failure. Kidney international. 2004;66(2):496-9.

3.         Edelstein CL, Ling H, Wangsiripaisan A, Schrier RW. Emerging therapies for acute renal failure. American journal of kidney diseases. 1997;30(5):S89-S95.

4.         Kontogiannis J, Burns KD. Role of AT1 angiotensin II receptors in renal ischemic injury. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 1998;274(1):F79-F90.

5.         Mackie FE, Campbell DJ, Meyer TW. Intrarenal angiotensin and bradykinin peptide levels in the remnant kidney model of renal insufficiency. Kidney international. 2001;59(4):1458-65.

6.         Kobori H, Nangaku M, Navar LG, Nishiyama A. The intrarenal renin-angiotensin system: from physiology to the pathobiology of hypertension and kidney disease. Pharmacological reviews. 2007;59(3):251-87.

7.         Stewart JA, Lazartigues E, Lucchesi PA. The Angiotensin Converting Enzyme 2/Ang-(1-7) Axis in the Heart A Role for Mas Communication? Circulation research. 2008;103(11):1197-9.

8.         Dilauro M, Burns KD. Angiotensin-(1-7) and its effects in the kidney. The Scientific World Journal. 2009;9:522-35.

9.         Sampaio WO, dos Santos RAS, Faria-Silva R, da Mata Machado LT, Schiffrin EL, Touyz RM. Angiotensin-(1-7) through receptor Mas mediates endothelial nitric oxide synthase activation via Akt-dependent pathways. Hypertension. 2007;49(1):185-92.

10.       Su Z, Zimpelmann J, Burns K. Angiotensin-(1–7) inhibits angiotensin II-stimulated phosphorylation of MAP kinases in proximal tubular cells. Kidney international. 2006;69(12):2212-8.

11.       dos Santos RAS, Passaglio KT, Pesquero JB, Bader M, e Silva ACS. Interactions between angiotensin-(1-7), kinins, and angiotensin II in kidney and blood vessels. Hypertension. 2001;38(3):660-4.

12.       Pinheiro SV, Ferreira AJ, Kitten GT, da Silveira KD, da Silva DA, Santos SH, et al. Genetic deletion of the angiotensin-(1–7) receptor Mas leads to glomerular hyperfiltration and microalbuminuria. Kidney international. 2009;75(11):1184-93.

13.       Santos RA, Ferreira AJ, Simões e Silva AC. Recent advances in the angiotensin‐converting enzyme 2–angiotensin (1–7)–Mas axis. Experimental physiology. 2008;93(5):519-27.

14.       Perico N, Cattaneo D, Sayegh MH, Remuzzi G. Delayed graft function in kidney transplantation. The Lancet. 2004;364(9447):1814-27.

15.       Gueler F, Gwinner W, Schwarz A, Haller H. Long-term effects of acute ischemia and reperfusion injury. Kidney international. 2004;66(2):523-7.

16.       Meldrum KK, Burnett AL, Meng X, Misseri R, Shaw MB, Gearhart JP, et al. Liposomal delivery of heat shock protein 72 into renal tubular cells blocks nuclear factor-κB activation, tumor necrosis factor-α production, and subsequent ischemia-induced apoptosis. Circulation research. 2003;92(3):293-9.

17.       Takada M, Nadeau KC, Shaw GD, Tilney NL. Prevention of late renal changes after initial ischemia/reperfusion injury by blocking early selectin binding1. Transplantation. 1997;64(11):1520-5.

18.       Meldrum KK, Meldrum DR, Meng X, Ao L, Harken AH. TNF-α-dependent bilateral renal injury is induced by unilateral renal ischemia-reperfusion. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 2002;282(2):H540-H6.

19.       Meldrum K, Meldrum D, Hile K, Yerkes E, Ayala A, Cain M, et al. p38 MAPK mediates renal tubular cell TNF-α production and TNF-α-dependent apoptosis during simulated ischemia. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 2001;281(2):C563-C70.

20.       Donnahoo KK, Meng X, Ayala A, Cain MP, Harken AH, Meldrum DR. Early kidney TNF-α expression mediates neutrophil infiltration and injury after renal ischemia-reperfusion. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 1999;277(3):R922-R9.

21.       Donnahoo KK, SHAMES BD, HARKEN AH, MELDRUM DR. Review article: the role of tumor necrosis factor in renal ischemia-reperfusion injury. The Journal of urology. 1999;162(1):196-203.

22.       DONNAHOO KK, MELDRUM DR, SHENKAR R, CHUNG C-S, ABRAHAM E, HARKEN AH. Early renal ischemia, with or without reperfusion, activates NFκB and increases TNF-α bioactivity in the kidney. The Journal of urology. 2000;163(4):1328-32.

23.       Magierowski M, Jasnos K, Pawlik M, Krzysiek-Maczka G, Ptak-Belowska A, Olszanecki R, et al. RETRACTION: Role of Angiotensin-(1–7) in Gastroprotection against Stress-Induced Ulcerogenesis. The Involvement of Mas Receptor, Nitric Oxide, Prostaglandins, and Sensory Neuropeptides. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 2013;347(3):717-26.

24.       Rabie MA, Zaki HF, Bahgat AK, El-Latif HAA. Angiotensin antagonists and renal ischemia/reperfusion: Possible modulation by L-carnitine. Bulletin of Faculty of Pharmacy, Cairo University. 2012;50(1):7-16.