ارزیابی فراوانی تک یاخته تریکوموناس واژینالیس در زنان مشکوک به واژینیت مراجعه کننده به بیمارستان نبی اکرم شهر زاهدان در سال1396به روش PCR

تریکوموناس واژینالیس تنها تک یاخته بیماری زا دستگاه ادراری تناسلی می باشد که  کیست ندارد و فقط به شکل تروف دیده می شود از نظر مورفولوژی اندازه آن به 18-15 میکرون گاهی بزرگتر تا 30 میکرون می باشد شبیه به تریکوموناس هومینیس و گلابی شکل است و هم چنین  دارای پرده مواج بوده  و 5-3 تاژک آزاد دارد و بسیار متحرک است(1).

اغلب عفونت های ناشی از تریکوموناس ، بدون علامت است . تخمین زده می شود که در حدود 10 تا 50 درصد از عفونت های ناشی از تریکوموناس واژینالیس در زنان بدون علامت بوده و این درصد در مردان حتی می تواند بالاتر باشد. در مردان علائم به طور معمول خفیف هستند و عفونت توسط سیستم ایمنی بدن میزبان در عرض چند هفته پاک می شود اما در زنان  می تواند برای سال های بسیاری باقی بماند، وعلائم، به طور عمده با ترشح زیاد واژن اغلب کف دار و بد بو و زرد رنگ ، سوزش و تکرر ادرار و خارش واژن همراه است و می تواند باعث التهاب در گردن رحم، مهبل، و مجرای ادرار شود (4-2) .تعداد زیادی از مطالعات از 20 سال گذشته، نشان داده است که عفونت زمینه ای تریکوموناس واژینالیس خطر ابتلا به عوارض جانبی بارداری و همچنین سرایت با ویروس اچ آی وی را افزایش می دهد (5) . این انگل به عنوان کوفاکتوری در انتقال ویروس نقص ایمنی انسانی و سایر عفونت های منتقل شونده جنسی عمل می کند. رابطه بین تریکوموناس واژینالیس و سرطان رحم و ایدز اخیراً مورد بررسی قرار گرفته است (7-6).

بر اساس برآورد سازمان بهداشت جهانی (WHO) از سال 2008، تریکوموناس به منزله شایع ترین بیماری منتقل شونده غیر ویروسی جنسی است (STD) می باشد .  در سراسر جهان، بیش از276 میلیون نفر در هر سال به این انگل آلوده می شوند(8) .

مهم ترین روش برای تشخیص تریکوموناس واژینالیس در حال حاضر تشخیص میکروسکوپی انگل با استفاده از تست لام مرطوب می باشد که حساسیت این روش تقریباً 60 درصد است(9).

مطالعه میکروسکوپی ، کشت های اختصاصی حاوی انگل، حساسیت را به 85 تا  95 درصد رسانده است(12-10).

در هر صورت کیفیت تست های تشخیصی به میزان زیادی بستگی به تخصص و تجربه فردی که با میکروسکوپ کار می کند و همچنین کیفیت نمونه دارد، بنابراین نیاز به بهبود روش های تشخیص شدیداً احساس می شود. در مورد محیط های کشت، شرایط مطلوب برای کشت انگل متغیر بوده و کارآیی آن تحت تاثیر زمان های انکوباسیون مختلف قرار می گیرد,  یکی از مشکلات استفاده از محیط های کشت، عدم امکان آنالیز سریع و دقیق آن می باشد بنابراین در این تحقیق از روش مولکولی PCR استفاده میشود زیرا  حساسیت روش PCR به حدی است که قادر به تکثیر حتی یک انگل تریکوموناس می باشد(13). برای انجام PCR پرایمرهای BTUB 9,2 به صورت کاملاًختصاصی عمل می کنند زیرا هیچ محصولDNA دیگری با سایر پروتوزوآها یا پاتوژن های واژن با استفاده از این جفت پرایمر قابل تشخیص نیست. در ژن تریکوموناس واژینالیس چندین کپی از سه ژن کد کننده پروتئین های بتا توبولین(بتا توبولین 1و 2و ( 3 وجود دارند.که پرایمرهای   BTUB 9,2یک قسمت ثابت را در  هر یک از این سه ژن مورد شناسایی قرار داده و به آن متصل می شود این مسئله موجب افزایش حساسیت روش PCR  با استفاده از این پرایمرها می گردد. ویژگی  پرایمرها به درجه حرارت آنیلینگ بستگی دارد. با درجه حرارت های آنیلینگ بالاتر ویژگی پرایمرها بالاتر است با توجه به موارد ذکر شده در فوق روش PCR در این تحقیق استفاده شده است (13و14) .

بررسی متون :

1. طبق مطالعه ایی که  توسط  Lawing و همکاران تحت عنوان تشخیص عفونت تریکومونایی در نمونه های واژینال و ادرار از زنان توسط کشت و PCR در سال 2000 انجام شد، نتایج نشان داد که استفاده نمونه ادرار برای تشخیص تریکوموناس واژینالیس در زنان مناسب نیست وتشخیص مبتنی بر PCR تریکوموناس واژینالیس با استفاده از نمونه های واژینال می تواند یک جایگزین  مناسب  به جای کشت انگل ارائه شود(15).

2. طبق مطالعه ایی که  توسط Sorvillo و همکاران تحت عنوان تریکوموناس واژینالیس و انتقال HIV در سال 1998 انجام شد که  ارتباط افزایش خطر ابتلا به عفونت HIV با تریکومونیاز نشان داده شده است(16).

3. رضاییان و همکاران طی مطالعه ایی شیوع تریکومونیازیس را با روش پارازیتولوژی در تهران انجام دادند (17).

4. طبق مطالعه ایی که  توسط جمالی و همکاران تحت عنوان تشخیص عفونت تریکوموناس واژینالیس به روش  PCR  و مقایسه با روش میکروسکوپی و کشت در سال 2006 انجام شد نتایج این مطالعه نشان می دهد تشخیص مبتنی بر PCR می تواند یک  یک جایگزین مناسب به جای کشت  ارائه شود(18).

5. ولد خانی و همکاران مطالعه ایی با عنوان  بررسی مولکولی تریکومونیاز در نمونه ها منفی بررسی شده توسط گسترش مرطوب وکشت انجام دادند که این مطالعه نشان دادتشخیص تریکوموناس واژینالیس با روش PCR یک روش حساس و خاص است که می تواند نقش مهمی برای کمک به پزشکان برای درستی درمان و کنترل عفونت را بازی کند (19) .

6. اکبریان و همکاران در مطالعه ای که بر روی زنان باردار انجام داده اند، شیوع تریکوموناس را در 368 نفر از زنان حامله مراجعه کننده به بیمارستان شهید اکبر آبادی تهران 2.9  گزارش کرده اند. در مطالعه مذکور  ارتباط معنی داری بین آلودگی با سن، سن حاملگی، تعداد حاملگی، تعداد سقط و علائم بالینی مشاهده نشده است.(20)

7. مطالعه میریگا  و همکاران در کشور نیجریه می باشد که روی 919 زن باردار صورت گرفته است. در این مطالعه میزان آلودگی به تریکوموناس واژینالیس 10.99 % گزارش شده است .(21)

8. طی مطالعاتی که در سایر نقاط ایران گزارش شده است شیوع تریکومونیازیس متفاوت بوده ( تبریز 9.2 % ، تهران 3.2 % ، همدان 2.1 % ، بابل 4 % ، یزد 2 % ، مشهد 5.6 % و بندر عباس 10.7 % )(22)

به طور کلی شیوع این انگل در ایران بین 1.9 تا 9.75 درصد گزارش شده است و با توجه به اینکه تاکنون مطالعه ای در این زمینه در شهر زاهدان انجام نگرفته است، این پژوهش  در  شهر زاهدان انجام می شود.

1. درصد فراوانی تک یاخته تریکوموناس واژینالیس در جمعیت تحت بررسی بر اساس سن چقدر است؟
2. درصد فراوانی تک یاخته تریکوموناس واژینالیس در جمعیت تحت بررسی بر اساس سطح تحصیلات چقدر است؟
3. درصد فراوانی تک یاخته تریکوموناس واژینالیس در جمعیت تحت بررسی بر اساس  وضعیت اقتصادی خانواده  چقدر است؟

تعیین فراوانی تک یاخته تریکوموناس واژینالیس در زنان مشکوک به واژینیت مراجعه کننده به بیمارستان  نبی اکرم  شهر  زاهدان  در سال1397 -1396به روش PCR

 تعیین فراوانی تک یاخته تریکوموناس واژینالیس در جمعیت تحت بررسی بر اساس سن.

تعیین فراوانی تک یاخته تریکوموناس واژینالیس در جمعیت تحت بررسی بر اساس وضعیت اقتصادی خانواده.

تعیین فراوانی تک یاخته تریکوموناس واژینالیس در جمعیت تحت بررسی بر اساس سطح تحصیلات.

مطالعه حاضر یک مطالعه توصیفی –مقطعی است.

150 نفر از  بانوان مراجعه کننده به درمانگاه زنان بیمارستان  نبی اکرم  زاهدان به صورت غیر احتمالی (روش نمونه گیری آسان) در طی 6 ماهه اول سال 96 انتخاب و به روش گسترش مرطوب و کشت و مولکولی  مورد بررسی قرار گرفتند

معیار خروج: عدم رضایت  افراد.

150 نفر از  بانوان مراجعه کننده به درمانگاه زنان بیمارستان  نبی اکرم  زاهدان به صورت غیر احتمالی (روش نمونه گیری آسان)

بوسیله سوآپ پنبه ای استریل به طور همزمان توسط فرد متخصص از ترشحات قسمت دهانه خلفی سرویکس نمونه برداری می شود

1.پرسشنامه

2.میکروسکوپی

3. PCR

ابتدا ضمن هماهنگی و موافقت خانم توسط یک نفر مامای، همکار طرح ،وضعیت بیمار از نظر حالت واژن و سرویکس بررسی و یاداشت می شود. سپس بوسیله سوآپ پنبه ای استریل به طور همزمان از ترشحات قسمت دهانه خلفی سرویکس نمونه برداری می شود. و هر نمونه به دو قسمت تقسیم می گردد. یک قسمت جهت انجام تست لام مرطوب برای تشخیص انگل تریکوموناس فوراً مورد استفاده قرار خواهد گرفت  بدین منظور برای آزمایش مستقیم به کمک سواپ قطره ایی از نمونه بر روی لام قرار داده شده و به کمک میکروسکوپ نوری مورد بررسی قرار می گیرد و قسمت دیگر در 1.5میلی لیتر بافر نگهدارنده PBS استریل(PH=7.2) قرار داده شد و به  آزمایشگاه گروه انگل شناسی  جهت انجام PCR اختصاصی برای  تشخیص انگل منتقل گردید. نمونه ها تا هنگام انجام آزمایش در یخچال نگهداری می شوند. برای جدا سازی DNA ابتدا هر نمونه دو بار با بافر PBS ،  در دور 15000 rpm به مدت 3 دقیقه شستشو داده شد . سپس بر روی  رسوب حاصله، بافر لیزکننده حاوی گلوکز استریل(%40) EDTA(0/5 مولار 8: PH ) ، ) Tris-HCl 8 1, PH: مولار( ،  NaOH(1 مولار,( sodium dodecyl sulfate   %10  SDS))، استات پتاسیم  5) مولار)  و اسید استیک( %11/5)اضافه شده و پس از سانتریفوژ(  5 دقیقه با  سرعت 15000 rpm ) محلول رویی به لوله جدیدی منتقل گردید. به محلول رویی0/6 حجم ایزوپروپانول اضافه و پس از مخلوط شدن در  دور 15000 rpm به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ گردید رسوب حاصله که حاوی DNA استخراج شده انگل می باشد دو بار با 1 میلی لیتر اتانول70 درصد شستشو(سانتریفوژ15000 rpm به مدت 5 دقیقه) داده شد. رسوب حاصله به مدت یک شبانه روز در معرض هوا قرار گرفته و پس از خشک شدن  DNA ، محتویات لوله در 30 میکرو لیتر mM10) Tris-EDTA   ( pH 7/5،10Tris, 1mM EDTA حل شد و تا زمان انجامPCR در یخچال نگهداری گردید.

برای انجام PCR یک جفت پرایمر به نام های BTUB 2و  BTUB9مورد استفاده قرار گرفت که ترادف نوکلئوتیدی این پرایمرها به صورت زیر است:

BTUB9: 5 CAT TGA TAA CGA AGC TCT TTA CGA T 3

BTUB2: 5 GCA TGT TGT GCC GGA CAT AAC CAT 3

هر واکنش PCR شامل 60 سیکل بود که دناتوراسیون(denaturation)  در 95 درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه آنیلینگ(annealing) در 62 درجه سانتیگراد شروع و در 52 درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه خاتمه یافت و اکستنشن(extension) در 72 درجه سانتیگراد به  مدت 1 دقیقه انجام پذیرفت. یک مرحله دناتوراسیون، پیش از سیکل اصلی در 95 درجه سانتیگراد به مدت75  ثانیه انجام گردید 10 .میکرولیتر از محصول روی ژل آگارز 1 درصد حاوی اتیدیدیوم بروماید الکتروفورز گردید. الکتروفورز در بافر (50mMTris,50mMBorate,1mMEDA)(0.5×)TBE در جریان ثابت 80 ولت انجام پذیرفت . ژلها در زیر نور  بررسی شده و عکس برداری میشود.

• حساسیت روش PCR به حدی است که قادر به تکثیر حتی یک انگل تریکوموناس می باشد.(13)

ابتدا اطلاعات را وارد نرم افزار spss کرده و سپس با استناد به روشهای آمار توصیفی: جدول توزیع فراوانی، رسم نمودار ، داده ها تجزیه و تحلیل می شوند.

ملاحظات اخلاقی استفاده شده از کدهای دفترچه آزمودنی انسانی  کدهای 1و2و3و4و7و11و13و14و15و17و18و19و25و27و28و29و31 در ارتباط با نمونه گیری و مصاحبه با رضایت کامل افراد مبتلا به واژینیت انجام خواهد شد،هم چنین تعهد می شود نام و مشخصات بیماران در هیچ گزارشی قید نشود.و سایر ملاحظات کدهای اخلاقی قید شده و از کدهای راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی در جمهوری اسلامی ایران ، کدهای 1، 2، 3، 4، 6، 7، 8، 9، 11، 12 از بخش راهنمای عمومی مدنطر پژوهشگران خواهد بودو اعمال خواهد شد.  

عدم همکاری بیمار

راه حل : توضیح دادن در مورد منافع این طرح و این که هیچ ضرری متوجه آنان نخواهد شد و اطلاعات آنها به طور محرمانه باقی خواهد ماند و نامشان به هیچ عنوان فاش نخواهد شد.

تک یاخته،تریکوموناس واژینالیس،زنان

1. Hirt RP, Sherrard J: Trichomonas vaginalis origins, molecular pathobiology and

clinical considerations. Curr Opin Infect Dis. 2015; 28(1): 72–79.

2.Poole DN, McClelland RS: Global epidemiology of Trichomonas vaginalis. Sex Transm Infect. 2013; 89(6): 418–422.

3. Donders GGG, Depuydt CE, Bogers J, et al.: Association of Trichomonas vaginalis and cytological abnormalities of the cervix in low risk women. PLoS One. 2013; 8(12): e86266.

4. Silver BJ, Guy RJ, Kaldor JM, et al.: Trichomonas vaginalis as a cause of perinatal morbidity: a systematic review and meta-analysis. Sex Transm Dis. 2014; 41(6): 369–76.

5. Kissinger P: Trichomonas vaginalis: a review of epidemiologic, clinical and treatment issues. BMC Infect Dis. 2015; 15: 307.

6.Gregson S, Mason PR, Garnett GP, Zhuwau T, Nyamukapa CA, Anderson RM, et al. A rural HIV epidemic in Zimbabwe? Findings from a population-based survey. Int J STD AIDS. 2001;12(3):189–96.

7.Wangnapi RA, Soso S, Unger HW, Sawera C, Ome M, Umbers AJ, et al. Prevalence and risk factors for Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae and Trichomonas vaginalis infection in pregnant women in Papua New Guinea. Sex Transm Infect. 2015;91(3):194–200.

8. WHO: Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections – 2008. 2016.

9. Fouts AC.; Kraus SJ. Trichomonas vaginalis: reevaluation of its clinical presentation and laboratory diagnosis. J Infect Dis, 141: 137-43, 1980.

10. Gelbart SM.; Thomason JL.; Osypowski PJ.; James JA.; et al. Comparison of diamond's medium modified and kupferberg medium for detection of Trichomonas vaginalis. J Clin Microbiol, 27: 1095-6, 1989.

11. Gelbart SM.; Thomason JL.; Osypowski PJ.; Kellett AV.; et al. Growth of Trichomonas vaginalis in commercial culture media. J Clin Microbiol, 28: 962-4, 1990.

12 . Schmid GP.; Matheny LC.; Zaidi AA.; Kraus SJ. Evaluation of six media for the growth of Trichomonas vaginalis from vaginal secretions. J Clin Microbiol, 27: 1230-3, 1989

13 . Katiyar SK.; Edlind TD. Beta-tubulin genes of Trichomonas vaginalis. Mol Biochem Parasitol, 64: 33-42, 1994

14 . Madico G.; Quinn TC.; Rompalo A.; McKee KT.; et al. Diagnosis of Trichomonas vaginalis infection by PCR using vaginal swab samples. J Clin Microbiol, 36: 3205-10, 1998

15. Lawing LF, Hedges S R, Schwebke JR. Detection of trichomoniasis in vaginal and urine specimens from women by culture and PCR. J Clin Microbiol. 2000; 38: 3585-3588.

16. Sorvill o F, Kerndt P. Trichomonas vaginalis and amplification of HIV-1 transmission. Lancet. 1998; 351:213-214 .

17. Rezaeian M, Vatanshenassan M, Rezaie S, Mohebali M, Niromand N, Niyyati M, Farnia S, Babaei Z. Prevalence of Trichomonas vaginalis using parasitological methods in Tehran. Iranian J Parasitol. 2009; 4: 43-47.

18. Jamali R, Zareikar R, Kazemi A, Yousefee S, Ghazanchaei A et al. Diagnosis of Trichomonas vaginalis infection using PCR method compared to culture and wet mount microscopy. Int Med J. 2006; 5: No 1.

19 Valadkhani Z, Kazemi  F, Assmar M, Amirkhani A, Esfandeari B, Lotfi M, etal.

. Molecular Diagnosis of Trichomoniasis in Negative Samples Examined by Direct Smear and Culture Iranian J Parasitol2010; 5(4): 31-36

20- Akbarian A, Akhlaghi L, Ourmazdi H, Foroohesh H, Flahati M, Farokhnejad R. An investigation on coincidence of trichomoniasis and bacterial vaginosis and their effects on pregnant women referred to Shahid Akbarabadi maternity hospital in Tehran during 2002-2003. Journal of Iran University of Medical Sciences. 2005 Summer; 12(46): 227-234.

21- Mairiga AG, Balla HG, Ahmad MI. Prevalence of Trichomonas vaginalis  infections among antenatal clients in Maiduguri Nigeria. Int J Biol Med Res. 2011; 2(4): 998 – 1002.

22- Szreter H. Phagocytosis of Neissarica Gonrrhoeae by Trichomonas vaginalis. Wiad Parazytol. 1974; 20(4):521-3.

مشخصات فردی:                                                                               کد بیمار:

1. سن بر حسب سال؟.........

2. آیا مایلید از شما نمونه واژینال گرفته شود؟

 بلی             خیر

3.سطح تحصیلات:

بی سواد        سیکل          دیپلم          کارشناسی         کارشناسی ارشد        دکترا          

4. شغل سرپرست خانواده:

بیکار           کارگر             کارمند               سایر (ذکر شود:............)

اینجانب علیرضا  سلیمی خراشاد  مبادرت به انجام مطالعه ایی در زمینه ارزیابی فراوانی تک یاخته تریکوموناس واژینالیس در زنان   مشکوک به واژینیت مراجعه کننده به بیمارستان  نبی اکرم  شهر  زاهدان  در سال1397 -1396به روش PCR نموده ام

بوسیله سوآپ پنبه ای استریل به طور همزمان توسط فرد متخصص از ترشحات قسمت دهانه خلفی سرویکس نمونه برداری می شود

 با توجه به اینکه تاکنون مطالعه ای در این زمینه در شهر زاهدان انجام نگرفته است، این پژوهش در شهر زاهدان انجام می شود.

در این روش تشخیصی هیچ گونه عوارض جانبی شما را تهدید نمی کند و تا حد امکان احتمال هر نوع عارضه ایی کاهش یافته است

در صورت بروز هر نوع مشکل که در ارتباط با روند پژوهش باشد، جبران کلیه خسارات احتمالی بر عهده مجریان طرح می باشد .

هر گونه هزینه تحقیق و درمانی این طرح تحقیقاتی بر عهده مجریان طرح می باشد و هیچ هزینه ای متوجه شما نخواهد شد

نیاز به روش جایگزین ندارد.

نتایج آزمایشها و روشهای به کار رفته به اطلاع بیمار خواهد رسید و این نتایج بصورت کاملاً محرمانه و صرفاً جهت مقاصد پژوهش به کار خواهد رفت و هویت بیماری وی در چارچوب قانون و جامعه و خانواده محرمانه خواهد ماند

میدان مشاهیر، طبقه اول، گروه انگل شناسی و قارچ شناسی پزشکی

شرکت من در مطالعه کاملاً اختیاری است و آزاد خواهم بود که از شرکت در مطالعه امتناع نموده یا هر زمان  که مایل بودم بدون آنکه تغییری در نحوه رفتار پزشک درمانگر یا نحوه درمان و مراقبت از بیماری اینجانب ایجاد شود از پژوهش مذکور خارج شوم.

با توجه به اطلاعات موجود در این فرم و توضیحات حضوری مجری یا همکاران طرح موافقت خود را با شرکت در این مطالعه اعلان می نمایم. یک نسخه از این فرم به من داده شده و فرصت خواندن آن را داشته ام.