ارزیابی اثرات محافظتی سلکوکسیب بر تغییرات هیستوپاتولوژیک ناحیه CA1 هیپوکمپ و استرس اکسیداتیو در رتهای نر مدل پارکینسون

پارکینسون دومین بیماری نورودژنراتیو پیشرونده در دنیاست که حدود 1% از افراد بالای 65 سال را مبتلا می سازد این بیماری با تخریب سلولهای دوپامینرژیک ناحیه جسم سیاه مغز میانی و کاهش پایانه های دوپامین استریاتوم مشخص می شود[1, 2]. برخی از علایم این بیماری شامل لرزش اندامها ،سفتی عضلات  و کندی حرکات می باشد  اتیولوژی این بیماری هنوز ناشناخته است . ولی عوامل محیطی و ژنتیکی در ایجاد آن دخیل هستند[3, 4].

مطالعات نشان داده است عواملی از جمله: التهاب ، استرس اکسیداتیو و سموم محیطی که باعث اختلال و آسیب میتوکندریایی می شوند ( مهار کمپلکس l میتوکندریایی)در از بین رفتن سلولهای دوپامینرژیک موثر هستند[5].

روتنون یک آفت کش قوی است و در کشاورزی از آن استفاده می شود  این سم میتواند باعث مهار کمپلکسI  میتوکندریایی و کاهش تولید ATP  وبه دنبال آن افزایش تولیدROS ( (Reactive Oxidative Species و نهایتا ایجاد استرس اکسیداتیو و تغییرات نورودژنراتیو در ماده سیاه مغز میانی و پیاز بویایی و ایجاد انکلوزیونهای آلفا سینوکلئین گردد . از این نوروتوکسین اخیرا برای ایجاد مدل پارکینسونی استفاده می شود [6].

بسیاری از مطالعات نقش استرس اکسیداتیو و التهاب مزمن را در ایجاد بیماریهای نورودژنراتیو مانند آلزایمر ، پارکینسون وآمیوتروفیک لترال اسکلروزیس( ALS )موثر می دانند[7, 8].

بطوریکه در نمونه های انسانی بیماران مبتلا به پارکینسون افزایش فعالیت میکروگلیاها، افزایش سیتوکین های التهابی، افزایش بیان فاکتور هسته ای (NF-κB) و صدمات اکسیداتیو پروتئینهای مایع مغزی نخاعی و بافت مغز مشاهده شده است[9].

التهاب نورونی متعاقب استرس اکسیداتیو یکی از مهمترین عوامل در مرگ سلولهای دوپامینرژیک گزارش شده است [10].

تعدادی از مطالعات افزایش بیان سیکلواکسیژناز-2 و افزایش فعالیت سلولهای میکروگلیال را در جسم سیاه مغزمیانی در نمونه های پارکینسونی بیان کرده اند . و افزایش سنتز پروستاگلاندین ها را عمدتا مربوط به آنزیم سیکلواکسیژناز و سلولهای میکروگلیال دانسته اند [11].

سیکلواکسیژناز-2 آنزیم کلیدی در تولید پروستاگلاندین ها و شروع التهاب می باشد و گزارش شده است که در بیماری پارکینسون افزایش می یابد و مسئول دژنراسیون نورونهای دوپامینرژیک در مغز میانی می باشد [12, 13.

سیکلواکسیژناز-2 در نواحی خاصی از مغز مانند کورتکس ، هیپوکمپ ، جیروس دنتیت و به مقدار کمی در استریاتوم و تالاموس بیان می شود [14].

افزایش فعالیت این آنزیم  در مغز با فعال کردن میکروگلیاها و افزایش تولید رادیکالهای آزاد وایجاد استرس اکسیداتیو باعث مرگ نورونی می شود[10] .

اگر چه مشکلات حرکتی شایع ترین علایم این بیماری هستند اما اختلالات خواب ،کاهش حس بویایی و فراموشی نیز در این بیماران دیده می شود[15].

 در حدود 15 تا 20 درصد از بیماران ازکاهش تمرکز ویادگیری و اختلالات حافظه رنج می برند[16].

هیپوکمپ یکی از نواحی مغز است که در یادگیری و حافظه نقش دارد ، هیپوکمپ خصوصا ناحیه جیروس دندانه ای پروجکشن های دوپامین را از طریق سیستم مزولیمبیک دریافت می کنند [17].

مسیر مزولیمبیک در فرایند یادگیری و حافظه نقش مهمی دارد و مشخص شده است که در بیماران مبتلا به پارکینسون در مراحل اولیه بیماری اختلالات شناختی و حافظه دیده می شود[18].

قسمت عمده عصب دهی دوپامینرژیک به هیپوکمپ از ناحیه تگمنتال شکمی (VTA) مغز میانی از طریق سیستم مزولیمبیک می باشد  و مشخص شده است که آورانهای دوپامینرژیک از ناحیه VTA می توانند نوروژنز و پلاستیسیتی سیناپتیک را در هیپوکمپ تحریک نمایند]19[.

آتروفی هیپوکمپ و کورتکس پره فرونتال واختلال حافظه در بیماران مبتلا به پارکینسون گزارش شده است[20].

نشان داده شده است که مهار آنزیم سیکلواکسیژناز می تواند باعث حفاظت سلولهای دوپامینرژیک در رت های مدل پارکینسونی شود[21].

Zhang  و همکارانش نشان دادند که بیان سیکلواکسیژناز در هیپوکمپ رتهای صرعی متعاقب حملات صرع افزایش می یابد و استفاده از مهارکننده های سیکلواکسیژناز مانند سلکوکسیب می تواند باعث کاهش حملات صرعی ، کاهش فعالیت میکروگلیاها ،کاهش گلیوزیس و اسکلوروزیس در سلولهای هیپوکمپ ،و متعاقبا کاهش مرگ سلولی در هیپوکمپ شود [14].

همچنین Chen طی مطالعه ای عنوان کرد که درافرادی که از مهارکننده های سیکلواکسیژناز استفاده می کنند خطر ابتلا به بیماری پارکینسون کمتر از سایرین می باشد[22].

نتیجه تحقیق Small  و همکارانش نشان داد که سلکوکسیب( مهارکننده سیکلواکسیژناز -2 ) باعث بهبود عملکرد حافظه در بیمارانی که از کاهش حافظه رنج می برند می شود[23] .

همچنین نتیجه چندین مطالعه دیگر نشان داد استفاده از داروهای ضدالتهاب غیراستروئیدی با جلوگیری از تجمع پلاکهای آمیلوئید بتا و مهار دژنراسیون نورونی باعث کاهش ابتلا به بیماری آلزایمر می شود[24, 25] .

Santiago و همکارانش عنوان کردند که تجویز سلکوکسیب در رت با افزایش قدرت دفاع آنتی اکسیدانی هیپوکمپ باعث کاهش افسردگی می گردد [26].

از آنجائیکه تاکنون اثرات سلکوکسیب بر تغییرات هیستوپاتولوژیکی هیپوکمپ در بیماری پارکینسون مطالعه نشده است بنابراین هدف از مطالعه حاضر بررسی اثرات محافظتی سلکوکسیب بر تغییرات هیستوپاتولوژیک ناحیه CA1 هیپوکمپ  و استرس اکسیداتیو در رتهای نر مدل پارکینسونی می باشد .

• میانگین تعداد سلولهای سالم ناحیه CA1 هیپوکمپ در گروههای مورد مطالعه متفاوت است.
• میانگین سلولهای آپوپتوتیک در ناحیه CA1هیپوکمپ گروههای مورد مطالعه متفاوت است.
• میانگین  ظرفیت آنتی اکسیدانی کل در هیپوکمپ گروههای مورد مطالعه متفاوت است.
• میانگین سطح فعالیت مالون دی آلدئید در هیپوکمپ گروههای مورد مطالعه متفاوت است.

ارزیابی اثرات محافظتی سلکوکسیب بر تغییرات هیستوپاتولوژیک  ناحیه CA1  هیپوکمپ و استرس اکسیداتیو در رتهای نر مدل پارکینسون

• مقایسه تعداد سلولهای سالم در بافت ناحیه CA1 هیپوکمپ گروههای مورد مطالعه .
• مقایسه تعداد سلولهای آپوپتوتیک در ناحیه CA1 هیپوکمپ گروههای مورد مطالعه.
• مقایسه سطح فعالیت مالون دی آلدئید (MDA)در هیپوکمپ گروههای مورد مطالعه.
• مقایسه ظرفیت آنتی اکسیدانی کل(TAC  )در ناحیه هیپوکمپ گروههای مورد مطالعه.

موسسات آموزشی و پژوهشی و درمانی

بیماری پارکینسون :  بیماری نورودژنراتیو که بدلیل کاهش سلولهای دوپامینرژیک مغز میانی ایجاد می شود.

سلکوکسیب : داروی مهار کننده آنزیم سیکلواکسیژناز-2

هیپوکمپ : ناحیه ای از بافت مغز در لوب تمپورال که در حافظه و یادگیری نقش دارد .

  دراین مطالعه پژوهش انجام شده از نوع تجربی می باشد .

جامعه مورد مطالعه رت های نر نژاد ویستار به وزن تقریبی350-300گرم می باشند  

معیار خروج: خونریزی از بینی پس از گاواژ یا کاهش شدید وزن که نشاندهنده پارگی احتمالی مری و عدم تغذیه کافی می باشد و همچنین زخم و عفونت در محل تزریق باعث خروج نمونه از گروه خواهد شد .

در این مطالعه 48 سر (4 گروه12 تایی )رت  نژاد ویستار استفاده خواهد شد .  

تخصیص رتها به گروههای مورد مطالعه به صورت تصادفی ساده خواهد بود.

فرم اطلاعاتی شامل نتایج مربوط به شمارش سلولهای سالم ناحیه CA1 هیپوکمپ ، تعداد سلولهای آپوپتوتیک ، سطح مالون دی آلدئید، ظرفیت آنتی اکسیدانی کل  در تمام گروههای مورد مطالعه می باشد.

گروه بندی حیوانات :

در این تحقیق از تعداد48 سر رت نر نژاد ویستار در محدوده وزنی350-300 گرم  استفاده خواهد شد . حیوانات در شرایط استاندارد و با دوره روشنایی و تاریکی 12ساعته و دمای 3±21 نگهداری می شوند و دسترسی آزاد به آب و غذا خواهند داشت . هر هفته وزن حیوانات اندازه گیری و ثبت خواهد شد .

حیوانات بطور تصادفی در 4گروه 12 تایی زیر قرار می گیرند:

گروه کنترل :(Control) : هیچ ماده ای دریافت نخواهد کرد .

گروه شم:( Sham) به مدت 4 هفته  روزانه آب مقطر از  طریق گاواژ دهانی دریافت کرده و همزمان روغن ذرت بصورت زیرجلدی تزریق می گردد .

گروه مدل پارکینسون (PD): به مدت 4 هفته روزانه آب مقطر از طریق گاواژ دهانی دریافت کرده و همزمان mg/kg 3  [27]  روتنون بصورت زیرجلدی تزریق می گردد .

گروه  (PD+(CLX: به مدت 4 هفته روزانه سلکوکسیب را به میزان  mg/kg20 [14] از طریق گاواژ دهانی دریافت کرده و همزمان mg/kg 3 روتنون بصورت زیرجلدی تزریق می گردد .  

جهت تایید مدل پارکینسون از تست قدرتی-wire Hanging و تعادلی Rotarod هر 48 ساعت یکبار  استفاده خواهد شد [28].

انجام آنالیزهای بیوشیمیایی:

یکروز پس از آخرین دوز تزریق و گاواژ ،نیمی از حیوانات تحت بیهوشی عمیق و پس از نخاعی کردن و خارج کردن مغز نمونه های هیپوکمپ دو طرف  طبق اطلس پاکسینوس و پروتکل جداسازی هیپوکمپ مغز رت [29, 30]، سریعا خارج و جهت آزمایشات بیوشیمیایی در دمای -80 درجه فریز خواهند شد . نمونه های هیپوکمپ وزن (   0/3 گرم ) و به نسبت 10/1 با محلول تریس 9/0 مولار سرد هموژنیزه و سپس در دمای 4 درجه سانتی گراد  با دور 12000 به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ  شده و محلول رویی جدا و میزان مالون دی آلدئید و ظرفیت آنتی اکسیدانی کل اندازه گیری خواهد شد . 

اندازه گیری سطح مالون دی آلدئید(MDA):

میزان MDA با کمک تست تیوباربیتوریک اسید (TBA) اندازه گیری خواهد شد  ونهایتا لایه رنگی حاصل در طول موج 535 نانومتر اندازه گیری می شود . از تترامتوکسی پروپان به عنوان استاندارد MDA استفاده خواهد شد[31].

 اندازه­ گیری ظرفیت آنتی اکسیدانی تام (Total antioxidant capacity)

برای اندازه گیری قدرت آنتی اکسیدانی تام  از روش FRAP(Ferric reducing antioxidant power) استفاده می گردد . به طور خلاصه در این روش توانایی سوپرناتانت هیپوکمپ در احیای یون های فریک (Fe3+) اندازه گیری می شود . با احیای یون های فریک و تبدیل آن به یون های فرو (Fe2+) در PH اسیدی و با حضور معرف اختصاصی TPTZ ، کمپلکس آبی رنگی ایجاد می شود که در طول موج 593 نانومتر و بصورت اسپکتروفتومتریک  قابل اندازه گیری است[32] .

آزمایشات هیستوپاتولوژیکی:

مغز نیمی دیگر از حیوانات  تحت بیهوشی عمیق پس از فیکساسیون به روش پرفیوژن ترانس کاردیال خارج و در فرمالین 10% قرار داده خواهند شد.پس از آن نمونه ها فیکس ونهایتاً قالب­گیری با پارافین و برش­گیری کرونال با ضخامت 5 میکرون طبق اطلس پاکسینوس از ناحیه هیپوکمپ انجام خواهد شد . سپس نمونه ها با رنگ کرزیل ویوله رنگ آمیزی می شوند سلولهای سالم با هسته و حدود مشخص در ناحیه CA1 هیپوکمپ شمارش و میانگین تعداد سلولهای سالم در گروههای مورد مطالعه محاسبه خواهد شد .

اندازه گیری بیان کاسپاز-3 جهت بررسی آپوپتوز سلولی

به منظور اندازه گیری بیان کاسپاز-3  برشهای 5 میکرونی از ناحیه هیپوکمپ تهیه و توسط زایلن دپارافینه و سپس هیدراتاسیون توسط الکلهای نزولی انجام خواهد شد .جهت احیای آنتی ژن های ماسکه شده برشها به مدت 20 دقیقه در سیترات بافر PH:6 تحت حرارت قرار خواهند گرفت .پس از آن نمونه ها  به ترتیب با BSA (آلبومین سرم گاوی)5 درصد به مدت 1 ساعت و با آنتی بادی اولیه کاسپاز-3 به مدت 2 ساعت انکوبه می شوند . پس از شستشو با بافر به ترتیب با آنتی بادی ثانویه به مدت 1 ساعت و دی آمینو بنزیدین (DAB) به مدت ده دقیقه انکوبه می شوند . جهت رنگ زمینه از هماتوکسیلین استفاده خواهد شد و پس از مونت کردن توسط میکروسکوپ نوری بررسی می شوند. سلولهای کاسپاز مثبت شمارش و میانگین سلولها  محاسبه و گزارش خواهد شد .

داده­های حاصل از این مطالعه با استفاده از نرم افزار SPSS جمع­ آوری می­گردد. جهت تجزیه و تحلیل داده­ها در صورت نرمال بودن داده ها از آنالیز واریانس یکطرفه (ANOVA) و تست تعقیبی توکی استفاده خواهد شد سطح آماری معنی دار P<0.05  در نظر گرفته می شود .

چک لیست کار با حیوانات آزمایشگاهی بر اساس کدهای راهنمای کار با حیوانات ابلاغی وزارت بهداشت'و دفترچه مربوط به کار با حیوانات آزمایشگاهی کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی زاهدان تکمیل و ضمیمه شده است وکلیه اقدامات بر روی حیوانات با رعایت چک لیست کار با حیوانات آزمایشگاهی انجام خواهد شد.

تاخیر در تامین مواد و مرگ و میر حیوانات در حین گاواژ و پس از تزریق نوروتوکسین(با صرف زمان بیشترمشکل تامین مواد برطرف خواهد شد  ودر قسمت کار با حیوانات با کمک گرفتن از کارشناس مرکز و آموزش دقیق گاواژ و نظارت بر کار دانشجومرگ ومیر ناشی از عوارض گاواژ به حداقل خواهد رسید) .

Parkinson disease -Celecoxib- Hippocampus

بیماری پارکینسون- سلکوکسیب- هیپوکمپ

1.       Zhang, Z. and G. Roman, Worldwide occurrence of Parkinson's disease: an updated review. Neuroepidemiology, 1993. 12(4): p. 195-208.

2.       de Rijk, M.d., et al., Prevalence of parkinsonism and Parkinson's disease in Europe: the EUROPARKINSON Collaborative Study. European Community Concerted Action on the Epidemiology of Parkinson's disease. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry, 1997. 62(1): p. 10-15.

3.       Olanow, C.W., M.B. Stern, and K. Sethi, The scientific and clinical basis for the treatment of Parkinson disease (2009). Neurology, 2009. 72(21 Supplement 4): p. S1-S136.

4.       Nunomura, A., et al., Neuronal death and survival under oxidative stress in Alzheimer and Parkinson diseases. CNS & Neurological Disorders-Drug Targets (Formerly Current Drug Targets-CNS & Neurological Disorders), 2007. 6(6): p. 411-423.

5.       Fukui, H. and C.T. Moraes, The mitochondrial impairment, oxidative stress and neurodegeneration connection: reality or just an attractive hypothesis? Trends in neurosciences, 2008. 31(5): p. 251-256.

6.       Sherer, T.B., et al., Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease. The Journal of neuroscience, 2003. 23(34): p. 10756-10764.

7.       Block, M.L. and J.-S. Hong, Microglia and inflammation-mediated neurodegeneration: multiple triggers with a common mechanism. Progress in neurobiology, 2005. 76(2): p. 77-98.

8.       McGeer, E.G., A. Klegeris, and P.L. McGeer, Inflammation, the complement system and the diseases of aging. Neurobiology of aging, 2005. 26(1): p. 94-97.

9.       Hirsch, E.C. and S. Hunot, Neuroinflammation in Parkinson's disease: a target for neuroprotection? The Lancet Neurology, 2009. 8(4): p. 382-397.

10.     Bartels, A.L. and K.L. Leenders, Cyclooxygenase and neuroinflammation in Parkinson's disease neurodegeneration. Current neuropharmacology, 2010. 8(1): p. 62-68.

11.     Knott, C., G. Stern, and G. Wilkin, Inflammatory regulators in Parkinson's disease: iNOS, lipocortin-1, and cyclooxygenases-1 and-2. Molecular and Cellular Neuroscience, 2000. 16(6): p. 724-739.

12.     Teismann, P., et al., Cyclooxygenase-2 is instrumental in Parkinson's disease neurodegeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003. 100(9): p. 5473-5478.

13.     Hunot, S., et al., JNK-mediated induction of cyclooxygenase 2 is required for neurodegeneration in a mouse model of Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004. 101(2): p. 665-670.

14.     Zhang, H.-j., et al., Cyclooxygenase-2 inhibitor inhibits hippocampal synaptic reorganization in pilocarpine-induced status epilepticus rats. Journal of Zhejiang University Science B, 2008. 9(11): p. 903-915.

15.     Chaudhuri, K.R. and A.H. Schapira, Non-motor symptoms of Parkinson's disease: dopaminergic pathophysiology and treatment. The Lancet Neurology, 2009. 8(5): p. 464-474.

16.     Schrag, A., M. Jahanshahi, and N. Quinn, What contributes to quality of life in patients with Parkinson's disease? Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry, 2000. 69(3): p. 308-312.

17.     Sriraksa, N., et al., Cognitive-enhancing effect of quercetin in a rat model of Parkinson's disease induced by 6-hydroxydopamine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2011. 2012.

18.     Munoz, P., et al., Dopamine oxidation and autophagy. Parkinson’s Disease, 2012. 2012.

19.     Ghanbarian, E. and F. Motamedi, Ventral tegmental area inactivation suppresses the expression of CA1 long term potentiation in anesthetized rat. PLoS One, 2013. 8(3): p. e58844.

20.     Apostolova, L., et al., Hippocampal and ventricular changes in Parkinson's disease mild cognitive impairment. Neurobiology of aging, 2012. 33(9): p. 2113-2124.

21.     Reksidler, A.B., et al., The COX-2 inhibitor parecoxib produces neuroprotective effects in MPTP-lesioned rats. European journal of pharmacology, 2007. 560(2): p. 163-175.

22.     Chen, H., et al., Nonsteroidal anti-inflammatory drugs and the risk of Parkinson disease. Archives of neurology, 2003. 60(8): p. 1059-1064.

23.     Small, G.W., et al., Cognitive and cerebral metabolic effects of celecoxib versus placebo in people with age-related memory loss: randomized controlled study. The American Journal of Geriatric Psychiatry, 2008. 16(12): p. 999-1009.

24.     Eikelenboom, P., et al., The significance of neuroinflammation in understanding Alzheimer’s disease. Journal of neural transmission, 2006. 113(11): p. 1685-1695.

25.     Zandi, P.P., et al., Reduced incidence of AD with NSAID but not H2 receptor antagonists The Cache County Study. Neurology, 2002. 59(6): p. 880-886.

26.     Santiago, R.M., et al., Antidepressant-like effect of celecoxib piroxicam in rat models of depression. Journal of neural transmission, 2014. 121(6): p. 671-682.

27.     Hassanzadeh, K., A. Rahimmi, and K. Hassanzadeh, Effect of N-acetylcysteine on TNF-α Level of Substantia Nigra and Striatum in Rat Model of Parkinson’s Disease. J Mazandaran Univ Med Sci, 2014. 24(118): p. 40-48.

28.     von Wrangel, C., et al., The rotenone-induced rat model of Parkinson's disease: behavioral and electrophysiological findings. Behavioural brain research, 2015. 279: p. 52-61.

29.     Swanson, L.W., Brain maps2004: Gulf Professional Publishing.

30.     Paxinos, G., et al., Chemoarchitectonic atlas of the rat brain. 2009.

31.     Ohkawa, H., N. Ohishi, and K. Yagi, Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Analytical biochemistry, 1979. 95(2): p. 351-358.

32.      Benzie, I.F., Strain, J.J. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of 'antioxidant power': the FRAP assay. Anal. Biochem, 1996. 239: p. 70-76.

ارزیابی اثرات محافظتی سلکوکسیب بر تغییرات هیستوپاتولوژیک  ناحیهCA1   هیپوکمپ و  استرس اکسیداتیو در رتهای نر مدل پارکینسون