بررسی اثر اسانس آویشن بر رشد برخی باکتری های بیماری زا در دوغ.

امروزه، شیر و فراورده های آن، نه تنها از نظر تحقیقات علمی بلکه در بازار تجارت جهانی رونق فراوانی یافته اند. مهم ترین عوامل مؤثر بر اقبال این محصولات، اثرات سلامت بخش، ویژگی های تغذیه ای مطلوب، خصوصیات حسی منحصر به فرد و افزایش ماندگاری آنهاست(1). دوغ یکی از نوشیدنی های سنتی ایران و برخی ملل دیگر در اروپای شرقی، خاورمیانه و آسیا به شمار می آید. در گذشته دوغ به فراورده ای اطلاق می شد که پس از رقیق سازی ماست پر چربی با آب و جداسازی چربی آن با استفاده از مشک بر جای می ماند. امروزه دوغ از ویژگی های مشخص و استاندارد شده فیزیکی، شیمیایی، فیزیکوشیمیایی، میکروبی و حسی برخوردار است(2).آویشن معمولی نام علمی Thymus vulgaris)) گیاهی از سرده آویشنان است. آویشن در طب سنتی ایران و اروپا، کاربرد دارویی دارد. از آویشن در صنایع غذایی (پیتزا، پاستا، ماهی، پنیر، لیکور، ذرت مکزیکی و...)، دارویی، بهداشتی و آرایشی استفاده می‌شود.ترکیبات مــوثر ضـدمیکروبی در عصــاره آویشن بــاغی حــاوی فلاوونوئیدهایی ماننداپی ژنین، نارینژین، لوتئولین و روغنهـای فـرارمحتوی تیمول وکارواکرول می باشد.(3)

این مواد می توانند از طریق پایداری شیمیایی و به وسیله مهار رشد میکروبی باعث افزایش عمر نگهداری مواد غذایی شوند. به همین دلیل مواد غذایی فرآیند شده با نگهدارنده های طبیعی روز به روز بیشتر مورد توجه قرار می گیرند.اسانس و عصاره ها دارای فعالیت ضدمیکروبی طبیعی بر روی تعداد زیادی از باکتری های مولد فساد و بیماری زا هستند، بیشتر این ترکیبات در حضور گروههای فعال فنولیک در ساختارشان مشترک می باشند. در حقیقت آن ها به علت داشتن مقادیر زیادی از ترکیبات فرار آروماتیک که برخی از آن ها از عوامل مهم ایجاد کننده طعم در غذا به شمار می روند مورد توجه هستند.(4)

در تحقیقی دربارهٔ اثرات گیاهان درمنه، اسطوخودوس وآویشن شیرازی بر روی باکتری‌های Staphylococcus aureus، Pseudomonas aeruginosa و Klebsiella pneumonia که در سال ۲۰۱۴ انجام شد، مشاهده شده است که هر ۳ اسانس دارای اثر مهار کننده بر روی باکتری‌های بیماری‌زا هستند اما اسانس گیاه آویشن شیرازی دارای اثر بهتری در مهار باکتری‌ها نسبت به اسانس گیاهان دیگر داراست.(5)

شریفی فر و همکاران (2007) فعالیت آنتی اکسیدانی و ضد میکروبی اسانس روغنی و عصاره متانولی آویشن بومی را در آزمایشگاه مورد سنجش قرار دادند. نتایج این سنجش نشان می دهد که عصاره روغنی و عصاره متانولی آویشن دارای فعالیت آنتی اکسیدانی و ضد میکروبی هستند و بنابراین می تواند به عنوان افزودنی نگهدارنده طبیعی در مواد غذایی و یا صنایع دارویی به کار رود (6). 

فاضلی و  همکارانش (2007) فعالیت ضد میکروبی سماق ایرانی و آویشن شیرازی بر بعضی از باکتری های عامل فساد غذایی را مورد مطالعه قرار دادند. نتایج این بررسی نشان می دهد هر دو ادویه معروف ایرانی که به طور سنتی به عنوان عامل قابض و طعم دهنده تند به کار می رود اثرات بازدارندگی بر باکتری عامل فساد غذایی نشان می دهند و می توانند به عنوان افزودنی طبیعی غذایی مورد توجه قرار گیرند(7). 

موسوی و همکاران (2008)، اثر آویشن شیرازی و نایسین را بر سالمونلا تیفی موریوم و استافیلوکوکوس اورئوس در یک سیستم غذایی و بر غشاء سلولی باکتریایی مورد بررسی قرار دادند. در این تحقیق مشاهدات میکروسکوپی الکترونیکی آشکار می کند که غشاء سلولی سالمونلا تحت اعمال اسانس روغنی و ترکیب اسانس روغنی با نایسین به طور معنی دار آسیب دید. در حالی که وضعیت سلول های تحت اثر نایسین به تنهایی مشابه با وضعیت سلول هایی بود که هیچگونه اعمالی روی آنها انجام نگرفته بود (8). دوغ یکی از محبوب ترین نوشیدنی های لبنی تخمیری است که در ایران وبرخی از کشورهای اروپای شرقی و خاورمیانه،مصرف فراوانی دارد. این فراورده به طریقه ی سنتی از طریق اختلاط ماست،آب،نمک و برخی گیاهان معطر نظیر نعناع و پونه یا اسانس های طبیعی حاصل می شود. امروزه باتوجه به افزایش سطح آگاهی مردم و اهمیت مسائل تغذیه ای و رژیم غذایی و متعاقب آن مشخس شدن اثرات زیان بار نوشابه های گازدار و پرکالری و تاثیر مستقیم آن بر شیوع بیماری های مزمن نظیر چاقی و دیابت، مردم گرایش به مصرف نوشیدنی های لبنی از جمله دوغ پیدا کرده اند. این تحقیق بر آن است تا اثرات ضد میکروبی دوغ را شناسایی کرده در نتیجه آن مدت نگهداری دوغ را افزایش دهد(9).

- میانگین باکتری اشرشیاکلیPTCC1399 -دوغ حاوی اسانس آویشن و نمونه کنترل در طی زمان های نگهداری مختلف چقدر است؟

- میانگین باکتری استافیلوکوکوس اورئوسPTCC1431 -دوغ حاوی اسانس آویشن و نمونه کنترل در طی زمان های نگهداری مختلف چقدر است؟

- میانگین باکتری  انتروباکتر آئروژنزPTCC1221 دوغ حاوی اسانس آویشن و نمونه کنترل در طی زمان های نگهداری مختلف چقدر است؟

- میانگین باکتری سالمونلا انتریتیدیس PTCC1247 دوغ حاوی اسانس آویشن و نمونه کنترل در طی زمان های نگهداری مختلف چقدر است؟

- میانگین تعداد باکتری ها در دوغ حاوی اسانس آویشن و دوغ فاقداسانس آویشن درطی زمان های مختلف،متفاوت است؟

- میانگین باکتری ها در دوغ حاوی اسانس آویشن و دوغ فاقد اسانس آویشن در طی زمان های نگهداری مختلف در شرایط نگهداری محیط و یخچال چقدر است؟

بررسی اثر اسانس آویشن در جلوگیری از رشد باکتری های بیماری زا در دوغ.

- تعیین میانگین باکتری اشرشیاکلیPTCC1399-دوغ حاوی اسانس آویشن و نمونه کنترل در طی زمان های نگهداری مختلف.

- تعیین میانگین باکتری استافیلوکوکوس اورئوسPTCC1431 -دوغ حاوی اسانس آویشن و نمونه کنترل در طی زمان های نگهداری مختلف.

- تعیین میانگین باکتری  انتروباکتر آئروژنزPTCC1221 دوغ حاوی اسانس آویشن و نمونه کنترل در طی زمان های نگهداری مختلف.

- تعیین میانگین باکتری سالمونلا انتریتیدیس PTCC1247 دوغ حاوی اسانس آویشن و نمونه کنترل در طی زمان های نگهداری مختلف.

- مقایسه ی میانگین باکتری ها در دوغ حاوی اسانس آویشن و دوغ فاقد اسانس آویشن در طی زمان های نگهداری مختلف.

آویشن: آویشن از گیاهان تیره نعناع می‌باشد. این گیاه دارای خواص درمانی بسیاری است (10).

عصاره: عصاره محلولی است که حاوی تمام مواد مفید گیاه از جمله تاننها – موسیلاژ ها – اسانسها و ... میباشد (11).

دوغ:طبق تعریف استاندارد ملی ایران، دوغ ساده، نوشیدنی لاکتیکی حاصل از تخمیر شیر است که ماده خشک آن از راه رقیق کردن ماست یا شیر دوغ سازی استاندارد شده است (12،13). 

این مطالعه تحلیلی از نوع  تجربی می باشد.

دوغ حاوی اسانس آویشن یا پودر گیاه آویشن ودوغ فاقد اسانس  آویشن

دوغ به سه گروه دوغ حاوی پودر آویشن ،حاوی اسانس آویشن  و دوغ فاقد آویشن تقسیم می شونداز هر نمونه سه تکراربرای هر میکروب انتخاب خواهد شد و جداگانه مورد آزمایش قرار خواهند گرفت وطی روزهای 3،6،9،12،15 از نظر تعداد باکتری ها تست می شوند.روش نمونه گیری نیز به صورت تصادفی ساده می باشد.

تصادفی

فرم اطلاعاتی و نتایج ازمایشگاهی

- مواد و روش ها 

عصاره های آویشن با درجه خلوص 60 درصد از شرکت باریچ اسانس کاشان   خریداری میشود.  

دوغ از بازار تهیه میگردد). 

سوش میکروبی استافیلوکوکوس ارئوس (1431PTCC) ،اشریشیا کلی(PTCC1399 (انتروباکتر آئروژنزPTCC1221) )و سالمونلا انتریتیدیس (PTCC1247)   به صورت آمپول لیوفلیزه از سازمان پژوهش های علمی و صنعتی ایران تهیه میگردد.  

جهت تهیه کشت تازه و فعال سازی سوش های میکروبی از محیط کشت مانیتول سالت آگار (ساخت شرکت مرک آلمان) برای استافیلوکوکوس اورئوس و از محیط کشت TRYPTICASE SOY AGAR برای اشریشیاکلی و از محیط کشت NUTRIENT AGAR برای انتروباکتر آئروژنز و از محیط کشتNUTRIENT AGARبرای سالمونلا انتریتیدیس استفاده میشود.  

- تهیه نمونه های دوغ جهت تیمار با عصاره ها  

نمونه های دوغ صنعتی بعد از تهیه از بازار، جهت انجام آزمایشات به آزمایشگاه منتقل میشود. بعد از استریل کردن دوغ ها در اتوکلاو، نمونه های استریل دوغ درون 288 لوله10cc ریخته میشوند و سپس غلظت های مختلف عصاره ( v/v15/0، 075/0 و0) براساس نتایج بدست آمده از گزارشات و تحقیقات انجام شده (14،15، 16، 17، 18 و 19) به صورت امولسیون کردن مقدار معین هر یک از آن ها با آب و به کمک توئین 80 (از شرکت مرک آلمان) به میزان 30 درصد وزن عصاره با استفاده از یک میکسر هموژنایزر (IKA-T25-digital ultra turax) به مدت یک دقیقه در پانزده هزار دور در دقیقه تهیه میشوند. 

- تهیه سوسپانسیون 5/0 مک فارلند 

سوسپانسیون استاندارد 5/0 مک فارلند با استفاده از اضافه کردن 5/99 میلی لیتر اسید سولفوریک 1% و 5/0 میلی لیتر کلرید باریم

%175/1 به طور آهسته با هم زنی مداوم تهیه می گردد.  

کدورت ایجاد شده توسط این سوسپانسیون دانسیته سلولی تقریباً معادل cfu/ml 10⁸×5/1 ایجاد می کند. سپس کدورت آن با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (SIGMA-3-30K) در طول موج nm 625 اندازه گیری میشود. 

- تهیه سوسپانسیون میکروبی 

یک لوپ از سوش میکروبی تحت شرایط استریل (بین دو شعله وجود) به cc500 محیط کشت N.B جهت تهیه سوسپانسیون غلیظ میکروبی اضافه می گردد، سپس محیط کشت به اینکوباتور ċ22-18 منتقل میشود. جهت تهیه کشت مادر^[1]، محیط کشت های M.S.A ،N.A و S.D.A به روش شیب دار^[2]، در لوله های در پیچ داری که قبلاً استریل شده بودند تهیه شد و از محیط N.B (بعد از ایجاد کدورت) کشت سطحی به شکل زیکزاک داده میشود.محیط کشت ها به مدت 24 ساعت در اینکوباتور ċ 37 قرار گرفته، سپس لوله ها با پارافین استریل شده و در یخچال نگه داری میشوند. 

- ارزیابی فعالیت ضد میکروبی عصاره ها با استفاده از طرح مرکب مرکزی در 1فاکتور در 3 سطح : 3 سطح غلظت از هر عصاره ( v/v15/0، 075/0 و0) براساس نتایج بدست آمده از گزارشات و تحقیقات انجام شده[20- 25] تهیه میشود. برای انجام آزمایش ها از طرح مرکب مرکزی در 1  فاکتور در 3 سطح تهیه گردید. %2- 1 از استافیلوکوکوس اورئوس ،اشریشیا کلی ،انتروباکتر آئروژنز و سالمونلا انتریتیدیس باغلظت استاندارد شده به روش مک فارلند (10⁵× 1) که روش تهیه آن در بخش قبل ذکر شد به 288 لوله آزمایش درب دار حاوی نمونه های دوغ  استریل و رقت های مشخص تهیه شده از عصاره های گیاهی اضافه میگردد (جدول1). 

یک لوله آزمایش فاقد ماده ضد میکروبی نیز به عنوان کنترل رشد (کنترل مثبت) در نظر گرفته میشود، افزودن سوسپانسیون میکروبی به رقت های عصاره های گیاهی باعث رقیق شدن سوسپانسیون میکروبی و غلظت ماده ضد میکروبی خواهد شد، که این موارد طی آماده سازی نمونه ها در نظر گرفته شده است. پس از انجام این مراحل از لوله فاقد ماده ضد میکروبی (کنترل) 1 cc/0 از این مخلوط با استفاده از یک اتوسمپلر فوراً روی سطح پلیت حاوی محیط آگار کشت سطحی داده میشود تا پس از یک شب گرمخانه گذاری تعداد کلونی های رشد کرده شمارش شوند [7]. سپس لوله های آزمایش حاوی دوغ و عصاره های گیاهی به مدت 7 روز در یخچال در دمای ċ 8-6 (دمای یخچال های صنعتی) نگهداری میگردد و تعداد کلونی های رشد کرده مطابق روش ذکر شده بررسی میگردد. 

برای توصیف داده ها از آمار توصیفی شامل میانگین و انحراف معیار و برای مقایسه میانگین ها بین گروهها از آنالیز واریانس یکطرفه و برای مقایسه میانگین در داخل گروهها در طی زمان های مختلف از آنالیز واریانس با داده های تکراری استفاده می شود .داده های گرد آوری شده با استفاده از نرم افزار  spss مورد تجزیه و تحلیل قرار می گیرد.

کد و دفترچه آن در سایت معاونت در خصوص کار با میکروارگانیزم ها وجود ندارد

محدودیت وجود ندارد

عصاره، اویشن ، باکتری های بیماری زا. دوغ

1-Chandan R. Enhancing market value of milk by adding cultures. Journal of Dairy Science. 1999;82(10):2245-56

2-Institute of Standards and Industrial Research of Iran. Probiotic doogh-Specifications and test methods, ISIRI No. 11324. Tehran: Institute of Standards and Industrial Research of Iran; 2009 (in Persian).

3- Behnia, M., Haghighi, A., Komeylizadeh, H., Seyyed Tabaei, S. J. and Abadi, A. 2008. Inhibitory Effects of Iranian Thymus vulgaris Extracts on in Vitro Growth of Entamoeba histolytica, Korean J Parasitol. Vol. 46, No. 3: 153156.

4- Settineri, R. A. and Krassner, S. M. 2003. Antimicrobial effects of plant-derived essential oil formulation on pathogenic bacteria. The Journal of The American Nutraceutical

   Association. 3(6): 27-32.

5- Gavanji S, Larki B, Bakhtari A. The effect of extract of Punicagranatum var. pleniflora for treatment of minor recurrentaphthous stomatitis. Integr Med Res 2014;3:83–90

6- Goudarzi M, Sattari M, Goudarzi GH, Bigdeli M. (2006). The effect of aqueous and alcoholic extracts of thyme herb on enterohemorrhagic Escherichia coli, Journal - Lorestan University of Medical Sciences. 8(3): 69-63.

7-Sharififar, F ., Moshafi, M. H., Mansouri, S.H. Khodashenas, M., & Khoshnood, M., 2007, In Vitro Evaluation of Antibacterial and

Antioxidant Activity of the Essential Oil and Methanol Extract of Endemic Zataria Multiflora Boiss, Food Control, 18(1): 800-805.

8- Moosavi, M. H., Akhondzadeh Basti, A., Misaghi, A., Zahraei salehi, T., & Abbasifar, R.,

2008, Effect of Zataria Multiflora Boiss Essential Oil and Nisin on Salmonella typhimurium and Staphylococcus aurous in a Food Model System and on The Bacterial Cell Membranes, Food Research International.41(1): 1050-1057.

9-    یزدی نژاد,ع.آنالیز اسانسهای Artemisia khorasanica وkopetdaghArtemisia و بررسی اثرات ضدمیکروبی آنها . پایان نامه دکترای داروسازی , دانشکده داروسازی دانشگاه علوم پزشکی مشهد . 1382.

10-Tepe, B., Daferera, D., Sokmen, A., Sokmen, M., and Polissiou, M.2005.Alntimicrobial and antioxidant activities of the essential oil and various extracts of Salvia tomentosa miller (Lamiaceae). Food Chemistry. 90(1): 333-340.

11-     عزیزی، ک. اثر تنش خشکی و شوری بر برخی خصوصیات کمی آویشن شیرازی، کاکوتی، آویشن باغی و کلپوره. پایان نامه کارشناسی ارشد زراعت، دانشگاه فردوسی مشهد.1383.

12- Institute of Standards and Industrial Research of Iran. Probiotic doogh-Specifications and test methods, ISIRI No. 11324. Tehran: Institute of Standards and Industrial Research of Iran; 2009 (in Persian).

13- Alvandi H, Jamehbozorg T. Status report of the country producing doogh. Tehran: Ministry of Industry, Mine and Trade; 2008 (in Persian).

14- Burt, S. (2004) .Essential oils: Their Antibacterial Properties and Potentiona Applications in foods, a Review. Internationa Journal of food Microbiology. 94:223-253

 15- Marino, M., Barsani, C. and Comi, G. (2001).Impedence Measurments of Study the Antimicrobial Activity of Essential Oil from Lamiaceae and Compositae.International Journal of Food Microbiology. 67:187-195

 16- Negueruela, A. V. and Mata, R.M .(1986). The Volatile Oil of Ziziphora hispanica, L.Flavour and Fragnance Journal. 1(3): 111-113.

 17- Simonetti, G. (1991). The MacDonald E ncyclopedia of Herbs and Spices.Macdonald and Co. (Pub). Ltd. London, pp.255.

 18- Barnon, E.J., Fineg Old, S.M. (1990). Method fir Testing Antimicrobial Effectiveness. In: Diagnostic Microbiology, 8 th ed. The Mosby Company. pp, 172-184.

 19- Beatriz, H. Benrnal, Jario Calle, Elcy Q. Duarte, Roberto Pinzon, Mario Velasa/quez. (2005). Inulin from tubers of Dahlia imperialis Roetz Rev. Col. Cienc. Quim. Farm. 34(2): 122125.

 20- Beuchat, L. R. (2001). Control of foodborne Pathogens and Spoilage Microoganisms by Naturally Occurring Antimicrobials. Microbial Food Contamination. CRC Press, London.

 21- Bullerman, L. B., Lieu, Y. and Seier, S. A. (1977). Inhibition of Growth and Aflatoxin Production by Cinnamon and Clove oils, Cinnamic Aldehyd and Eugenol.Journal of Food Science. 42(4): 1107-1116.

 22- Chachoyan, A. A. and Oganesyan, G. B. (1996). Antitumor Activity of Some Spices of The Family Lamiaceae.Rastitelnye Resursy. 32(4):59-64.

 23- Tranter, H. S., Tassou, C.C., & Nychas, G.J. (1993). The effect of the olive phenolic compounds, oleuropein, on growth and enterotoxin B production by Staphylococcus aureus. Journal of Applied Bacterialogy, 74, 253-260.

 24- Smith-Palmer, A., Stewart, J.and Fufe, L. (1998). Antimicrobial Properties of Plant Essential oils and Essences Against Five Important Foodborne pathogens.Letters in Applied Microbiology. 26(2):112-118.

 25- Holley. R. A.and Patel, D. (2005). Improvement in Shelf-Life and Safety of Perishable Foods by Plant Essential Oils and Smoke Antimicrobials. Food Microbilogy. 22:273-292.