مقایسه فراوانی واریانت های های ژنتیکی rs429358 و rs7412 و متیلاسیون پروموتر ژن ApoE و تاثیر پلی مورفیسم rs1801133 ژن MTHFR بر متیلاسیون پروموتر ژن ApoE در بیماران مبتلا به بیماری شریان کرونری و افراد کنترل سالم

بیماری شریان کرونری (CAD)[1] یکی از عوامل اصلی مرگ و میر  در جهان و ایران می باشد. ریسک فاکتور های متعدد  ژنتیکی، محیطی و اپی ژنتیکی در بروز این بیماری دخالت دارند. علیرغم اینکه درباره تاثیرات عوامل محیطی و ژنتیکی در بروز این بیماری ، بررسی های متعددی صورت گرفته، لیکن در مورد تاثیر تغییرات اپی ژنتیکی، تعداد مطالعات انجام شده محدود است. امروزه مشخص شده که تغییرات اپی ژنتیکی از جمله متیلاسیون ژنها  نقش مهمی در پاتوژنز بسیاری از بیماریها ایفاء می کنند. متیلاسیون ژن یک تغییر برگشت پذیر بوده که موجب کاهش بیان ژن شده بدون اینکه موجب تغییر در توالی ژن شود. اختلال در چربی های خون به عنوان یک ریسک فاکتور شناخته شده بیماریهای قلبی و عروقی می باشد (1) . عوامل متعددی تعیین کننده میزان چربی های خون بوده که از جمله آنها می توان به عوامل ژنتیکی و محیطی اشاره کرد. بررسی های صورت گرفته نشان داده­اند که در 40% موارد اختلالات لیپید­های خون عوامل محیطی دخالت دارند. همچنین مطالعات ژنتیکی انجام گرفته نشان داده که تنها حدود 25% موارد اختلالات لیپید های خون را می توان با اختلالات ژنتیکی مانند پلی مورفیسم های ژنهای دخیل در متابولیسم لیپیدها مرتبط دانست و در 35-40% موارد دیس لیپیدمی فاکتور خطر­زای خاصی قابل شناسایی نیست (2).  امروزه مشخص شده که علاوه بر ریسک فاکتور های متعدد  ژنتیکی و  محیطی که منجر به دیس لیپیدمی و ایجاد CAD در افراد می شود عوامل اپی ژنتیکی از جمله متیلاسیون ژنها  نیز در بروز این بیماری دخالت دارند (1). آپولیپوپروتئین E (APOE) یک گلیکوپروتئین پلاسمایی است که جزئی از ساختار شیلومیکرون ها، لیپوپروتئین های با وزن مولکولی کم (VLDL)[2] و متوسط (IDLP)[3]   بوده و با واسطه رسپتورهای مربوطه به سلولهای کبدی متصل شده و در حذف لیپوپروتئین ها از خون موثر است. APOE پروتئینی است که در پاتوژنز بسیاری از بیماریهای مرتبط با افزایش سن از جمله آلزایمر، بیماریهای چشمی و بیماریهای قلبی و عروقی نقش دارد و اختلال عملکردی ژن APOE استعداد ابتلا به CAD را افزایش می دهند (3). یکی از دلایل شایع اختلال در عملکرد آپولیپوپروتئین APOE، جهش های ژنتیکی است. دو پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی (SNP) rs429358  و rs7412 در جایگاه ژنتیکی ژن ApoE شناسایی شده اند. SNP rs429358  واجد دو الل C و T می باشد که الل T شایعتر می باشد. همچنین SNP rs7412 واجد دو الل T و C می باشد. دو (SNP) rs429358  و rs7412  با هم برهم کنش داشته و ایجاد فرم های اللی هم بارز به شرح جدول ذیل می کنند.

وجود حداقل سه الل هم بارز (Co-dominant) در جایگاه ژنتیکی ژن APOE E2)  ، E3 و E4) موجب ایجاد 6 ژنوتیپ احتمالی (E2E2, E2E3, E2E4, E3E3, E3E4, E4E4) می شود (4). شایعترین الل (E3) ایزوفرمی از پروتئین ApoE (ایزوفرم E3) را کد می کند که واجد یک اسید آمینه سیستئین در جایگاه 112 و یک اسید آمینه آرژینین در جایگاه 158 می باشد. ایزو فرم E2 به دلیل وجود یک سیستئین در جایگاه 158 و ایزوفرم E4 به دلیل وجود یک آرژینین در جایگاه 158 از ایزوفرم شایع E3 متفاوت می باشند. الل های مختلف ApoE فراوانی متفاوتی دارند. شیوع اللی E2 در حدود 7%، شیوع اللی E3 در حدود 79% و شیوع اللی E4 در حدود 14% می باشد  (5) . الل های های  ژن APOE در ایجاد آترواسکلروزیس نقش دارند و مسئول ایجاد 16-2% نوسان در سطوح LDL-C سرم هستند. اتصال آپولیپوپروتئین ApoE به رسپتور های خود در کبد تحت تاثیر تفاوت های ایزوفرمی و همچنین میزان اشباع لیپید آن قرار می گیرد. ایزوفرم ApoE2 با مقادیر بالاتر ApoE و مقادیر پایین تر  LDL-C مرتبط بوده و خطر ابتلا به CAD را کاهش می دهد. بر عکس ایزوفرم ApoE4 با مقادیر کاهش یافته ApoE و مقادیر افزایش یافته کلسترول توتال، LDL-C و VLDL-C ارتباط داشته و منجر به افزایش خطر بروز ACD می شود. بنابراین از ایزوفرم ApoE2 به عنوان عامل محافظت کننده و از ایزوفرم ApoE4 به عنوان عامل مستعد کننده CAD نام می برند (6). با این حال مطالعات انجام شده در مورد نقش پلی مورفیسم های ApoE در رابطه با بروز CAD متناقض است. Elmadbouh و همکارانش در سال 2012 در مصر شیوع الل های E2، E3 و E4 ژن ApoE را در 80 بیمار مبتلا به CAD و 20 نفر کنترل سالم بررسی کردند و نتیجه گرفتند که E3/E4 شیوع بالاتری در بیمارن نسبت به افراد کنترل دارد همچنین الل  ApoE4 با مقادیر بالاتر کلسترول و LDL-C در بیماران CAD همراهی می کرد(7). Karahan و همکارانش در سال 2015 در ترکیه ارتباط الل های مختلف E2، E3 و E4 ژن ApoE را با شدت بیماری CAD و پروفایل لیپید در 138 بیمار مبتلا به CAD بررسی کردند و نتیجه گرفتند که افراد حامل الل E4 نسبت به افراد غیر حامل میزان بالاتری از لیپیدهای خون از جمله کلسترول و LDL-C داشته و ضایعات آترواسکلروزی شدیدتری (High Gensini Score) داشتند (8). Lamia F. Abu. و همکارانش در سال 2014 شیوع الل های مختلف E2، E3 و E4 ژن ApoE را در 69 بیمار مبتلا به CAD و 68 نفر کنترل سالم بررسی کردند و ژنوتیپ ApoE3/E3 را به عنوان شایعترین ژنوتیپ در بین بیماران و افراد کنترل گزارش کردند با این حال تفاوت معنی داری در شیوع هیچ یک از ژنوتیپ های مختلف پلی مورفیسم های ژن ApoE بین بیماران و افراد گروه کنترل گزارش نکردند (9). همچنین Cheema و همکارانش در سال 2015 در پاکستان تعداد 695 بیمار مبتلا به CAD را از نظر شیوع الل های E2، E3 و E4 ژن ApoE بررسی کردند و نشان دادند که الل APOE4 با فنوتیپ شدیتر بیماری CAD همراهی می کند. همچنین Heidari و همکارانش در سال 2015 در ایران در استان پزد تعداد66 بیمار مبتلا به CAD و 61 نفر کنترل سالم را بررسی کردند و ژنوتیپ های ApoE3/E3 و  ApoE3/E4را به عنوان فاکتورهای مستعد کننده CAD گزارش کردند (10). XU و همکارانش اخیرا در سال 2016 در چین یک مطالعه فرا تحلیلی انجام دادند که نتایج آنها نشان داد که در نژاد قفقازی افراد واجد فنوتیپ ε4 حدود 25% خطر افزایش یافته CAD دارند (OR = 1.25, 95% CI = 1.11-1.41) در حالیکه افراد واجد الل ε2 خطر کاهش یافته CAD را نشان می دادند (OR = 0.84, 95% CI = 0.74-0.96) (11).

علیرغم اینکه تغییرات ژنتیکی ژن ApoE در بیماران CAD مطالعه شده و گاها نتایج متناقضی نیز گزارش شده است، با این حال مطالعات انجام شده در مورد تغییرات اپی ژنتیکی از جمله متیلاسیون ژن ApoE در بیماران CAD محدود می باشد. شواهدی وجود  دارد که نشان میدهند القاء متیلاسیون DNA در ژن APOE  موجب تسهیل آترواسکلروزیس می شود (12). در مطالعه ایی که توسط Yi-Deng و همکارانش در چین صورت گرفت ارتباط بین متیلاسیون DNA ژن APOE  با میزان هموسیستیئن خون بررسی گردید و نتایج نشان داد که هموسیستئین که یک ریسک فاکتور شناخته شده بیماریهای قلبی و عروقی است باعث کاهش بیان mRNA و پروتئین ApoE شده و غلظت کلسترول آزاد، کلسترول توتال و کلسترول استر را به میزان قابل توجهی افزایش داد نتایج مطالعه  مذکور بیانگر این موضوع بود که متیلاسیون DNA ژن APOE  که با هموسیستئین  القاء می شود واجد نقش مهمی در ایجاد آترواسکلروزیس می باشد و فولات با مهار متیلاسیون القاء شده با هموسیستئین در ژن APOE  موجب  اثرات محافظتی در برابر آترواسکلروزیس شده و میزان کلسترول آزاد، کلسترول توتال و تری گلیسیرید را کاهش می دهد (12).

در مطالعه ایی که توسط Ma و همکارانش در سال 2015 صورت گرفت تعداد 93 نفر از نظر متیلاسیون DNA ژن APOE و ارتباط آن با میزان بیان ژن APO، میزان چربی های خون و سن مورد مطالعه قرار گرفتند که نتایج نشان داد که متیلاسیون DNA ژن APOE  ارتباط معنی داری با سن و میزان کلسترول توتال خون دارد بدین صورت که با افزایش سن، میزان متیلاسیون DNA ژن APOE افزایش می یابد که به نوبه خود منجر به کاهش غلظت سرمی APOE شده و باعث افزایش غلظت کلسترول توتال و LDL-C  خون می شود. نتایج مطالعه مذکور علت افزایش چربی های خون و افزایش شیوع بیماریهای قلبی و عروقی را با افزایش سن توجیه می کند همچنین ارتباط معکوسی بین متیلاسیون DNA ژن APOE و بیان ژن APOE گزارش گردید (13).  اخیرا در یک مطالعه که در سال 2015 توسط  Sami و همکارانش صورت گرفته، متیلاسیون DNA ژن APOE در 200 بیمار مبتلا به CAD و 90 شخص کنترل سالم با روش MSP  بررسی شد که نتایج نشان داد که متیلاسیون DNA ژن APOE در بیماران CAD بیشتر از افراد کنترل بوده و یک فاکتور خطر برای بیماری CAD محسوب می شود (14). اخیرا  Yu و همکارانش در سال 2015 به بررسی ویژگیهای تغییرات ژنتیکی ژن APOE در ارتباط با تاثیر واریانت های مختلف ژنتیکی این ژن (E2, E3, and E4) در بیماریهای مختلف نظیر اختلالات قلبی و عروقی، اختلالات شناختی و پیری پرداختند و پیشنهاد دادند که دامنه تاثیر ژن APOE در بیماریهای مختلف فراتر از آن است که بتوان با تغییرات ژنتیکی توجیه کرد و نشان دادند که تغییرات اپی ژنتیکی خصوصا متیلاسیون ژن ممکن است در بروز بسیاری از  این بیماریها حائز اهمیت باشد (15). القاء متیلاسیون در ژنها تحت تاثیر مسیر های متابولیسمی مختلفی قرار دارد که میزان ریشه های فولات و متیل در دسترس سلولهارا تحت تاثیر قرار می دهند. از جمله مسیر متابولیسمی تامین کننده ریشه های متیل، متابولیتی است با نام S- آدنوزیل متیونین (SAM) که از افزوده شدن ریشه ای آدنوزیل به اسید آمینه متیونین توسط آنزیم methionine adenosyltransferase ایجاد شده و فرم فعالی از متیونین به نام SAM را ایجاد می کند که به عنوان یکی از دنور های مهم ریشه متیل در مسیر های متابولیسمی سلولی عمل می کند. SAM ریشه متیل خود را در واکنشهای متیلاسیون از دست داده و تبدیل به واسطه ای می شود به نام S-آدنوزیل هموسیستئین S−Adenosyl Homocysteine) (SAH)) که بلافاصله طی یکسری از واکنشهای بیوشیمیایی ریشه آدنوزیل را از دست داده و به هموسیستئین تبدیل می شود. حدود 60 درصد هموسیستئین ایجاد شده در بدن وارد مسیر متابولیسمی  ترانس سولفوریشن در سلولهای کبدی شده و بطور برگشت ناپذیری تبدیل به سیستئین می شود. حدود 40% هموسیستئین ایجادشده نیز توسط آنزیم متیونین سنتاز (MS) و با اضافه شدن دوباره ریشه های متیل تبدیل به متیونین می شود. آنزیم MS ریشه متیل را از اسید فولیک متیله (N⁵-MethylTetraHydroFolate, MTHF) دریافت می کند. N⁵-MTHF یک واسطه متابولیسمی است که از (N⁵, N¹⁰-MethylTetraHydroFolate, MTHF) و در حضور آنزیم متیلن تترا هیدروفولات ردوکتاز (MTHFR) تشکیل می شود. کاهش عملکرد آنزیم  MTHFRبه علت پلی مورفیسم  C677T (rs1801133)  مسیر متابولیسمی فوق را مختل کرده و تشکیل N⁵-MTHF و به تبع آن تبدیل هموسیستئین به متیونین و متعاقبا تبدیل متیونین به SAM را کاهش داده و روند القاء متیلاسیون در ژنها را تحت تاثیر قرار می دهد (16و18و 19). همچنین کاهش عملکرد آنزیم  MTHFRبه علت پلی مورفیسم  C677T (rs1801133)  منجر به افزایش هموسیستئین خون شده که یک فاکتور خطر مهم بیماریهای قلبی و عروقی می باشد و با مکانیسم های متعددی نظیر آسیب اندوتلیال عروق، مهار فعالیت نیتریک اکساید، افزایش آزادسازی فاکتور بافتی، مهار فعالیت پروتئین C فعال شده (APC) و القاء تجمع پلاکتی باعث ایجاد بیماریهای قلبی و عروقی می شود همچنین مطالعات نشان داده اند که هیپرهموسیستئینمیا ممکن است منجر به القاء متیلاسیون در ژنها بشود (12و 17).  با توجه به اینکه اطلاعات موجود در زمینه وضعیت متیلاسیون DNA ژن APOE در بیماران CAD محدود می باشد و تاکنون در ایران هم مطالعه ایی در این مورد صورت نگرفته است لذا بررسی های بیشتری در این مورد ضروری به نظر می رسد. لذا  در مطالعه حاضر علاوه بر بررسی وضعیت متیلاسیون DNA ژنAPOE، وضعیت پلی مورفیسم C677T ژن MTHFR و نقش احتمالی آنها در القاء متیلاسیون یا دمتیلاسیون ژنAPOE مورد بررسی قرار خواهند گرفت. همچنین الل های مختلف E2، E3 و E4 ژن ApoE و ارتباط آنها با پروفایل لیپید بیماران بررسی خواهد شد.

فراوانی الل (E2 (rs7412-T, rs429358-T ژن ApoE در بیماران مبتلا به بیماری شریان کرونری و گروه کنترل متفاوت است.

 فراوانی الل (E3 (rs7412-C, rs429358-T ژن ApoE در بیماران مبتلا به بیماری شریان کرونری و گروه کنترل متفاوت است.

 فراوانی الل (E4 (rs7412-C, rs429358-C ژن ApoE در بیماران مبتلا به بیماری شریان کرونری و گروه کنترل متفاوت است.

فراوانی متیلاسیون ژن ApoE در بیماران CAD و افراد گروه شاهد متفاوت است.

پلی مورفیسم C677T  (rs1801133) ژن MTHFR  ممکن است وضعیت متیلاسیون ژن  ApoE را تحت تاثیر قرار دهد.

مقایسه فراوانی واریانت های های ژنتیکی  rs429358 و rs7412 و متیلاسیون پروموتر ژن ApoE  و تاثیر پلی مورفیسم  rs1801133 ژن  MTHFR بر متیلاسیون پروموتر ژن ApoE در بیماران مبتلا به بیماری شریان کرونری و افراد کنترل سالم

- مقایسه فراوانی الل (E2 (rs7412-T, rs429358-T ژن ApoE در بیماران مبتلا به بیماری شریان کرونری و گروه کنترل

 مقایسه فراوانی الل (E3 (rs7412-C, rs429358-T ژن ApoE در بیماران مبتلا به بیماری شریان کرونری و گروه کنترل

 مقایسه فراوانی الل (E4 (rs7412-C, rs429358-C ژن ApoE در بیماران مبتلا به بیماری شریان کرونری و گروه کنترل

 مقایسه فراوانی متیلاسیون پروموتر ژن ApoE در بیماران مبتلا به بیماری شریان کرونری و گروه کنترل

 مقایسه فراوانی پلی مورفیسم  C677T(rs1801133) ژن MTHFR در بیماران مبتلا به بیماری شریان کرونری و گروه کنترل

 بررسی ارتباط بین متیلاسیون پروموتر ژن ApoE و پلی مورفیسم C677T (rs1801133) ژن MTHFR در بیماران مبتلا به بیماری شریان کرونری و گروه کنترل

بیماری عروق کرونر(CAD): شایعترین علت بیماری قلبی و حملات قلبی است که در نتیجه تشکیل پلاک در جدار داخلی عروق قلبی و متعاقبا کاهش جریان خون و انسداد عروق قلبی مشخص می شود.

DNA متیلاسیون: یک تغییر اپی ژنتیکی است که در جزایر غنی از CpG  (island  ( CpG  که عمدتا در نواحی پروموتر و تنظیمی ژنها قرار دارند، اتفاق می افتد و  با اضافه شدن ریشه های متیل به سیتوزین موجود در CpG ، منجر به اختلال در اتصال فاکتور های نسخه برداری و سرکوب بیان ژن مشخص می شود.

پلی مورفیسم: به وجود بیش از یک الل (شکل ژنی ) در جایگاه ژنتیکی (لوکوس) یک ژن، الل گفته می شود.

تحلیلی (موردی-شاهدی).

ابتدا بیماران توسط پزشک متخصص قلب و عروق معاینه و پس از تایید ابتلا بیمار به CAD، نمونه گیری از بیماران صورت می گیرد.

معیارهای ورود بیماران به شرح زیر است.

1. داشتن رضایت نامه آگاهانه
2. بیمارانی که به هر دلیلی آنژیوگرافی شده اند و حداقل یک رگ با گرفتگی بالای 50% دارند.
3. سابقه ابتلا به سکته قلبی (MI) که بصورت مستند (Documented) باشد و با بررسی شرح حال بیماران، نوار قلب و آنژیوگرافی توسط پزشک متخصص قلب و عروق تایید شده باشد.

معیار های خروج بیماران به شرح زیر است:

1. بیمارانی که در آنژیوگرافی گرفتگی رگ زیر 50% دارند.
2. بیمارانی که سابقه ابتلا به بیماری حاد یا مزمن دیگری را داشته باشند.  مانند سابقه ابتلا به بیماریهای مزمن کلیوی، کبدی، بیماریهای حاد و مزمن تنفسی و بیماریهای اتوایمیون
3. بیمارانی که سابقه فامیلی بیماریهای قلبی و عروقی را دارند.

3.  افراد گروه کنترل نیز بعد از ویزیت پزشک متخصص قلب و عروق و اطمینان از سالم بودن وضعیت قلبی و عروقی انتخاب خواهند شد همچنین افراد کنترل نباید سابقه ابتلا به بیماریهای مزمن، سابقه درد سینه، پر فشاری خون، دیابت ویا هر گونه بیماری خاص را داشته باشند و از نظر سنی و جنسی باید مشابه با بیماران باشند.

برای این مطالعه 200 بیمار مبتلا به CAD و 200 نفر کنترل سالم که از نظر سنی و جنسی مشابه با بیمار بوده و توسط پزشک متخصص قلب و عروق تایید شده باشند، انتخاب خواهند شد.  حجم نمونه بر اساس مطالعات انجام شده (8) و سطح آلفا برابر با 05/0 و توان آماری 80 درصد، با فرض فراوانی اللی ( ε3 / ε4  ) 1/9% در بیماران و 1% در افراد گروه کنترل  با کمک نرم‌افزار STATA 8 محاسبه شد. لازم به ذکر است که بررسی متیلاسیون حداقل در 100 بیمار مبتلا به CAD و 100 نفر کنترل سالم صورت خواهد گرفت.  

نمونه گیری به صورت ناشتا از بیماران و افراد کنترل سالم با در نظر گرفتن معیار های ورودی و خروجی صورت خواهد گرفت. بیماران و افراد کنترل از نظر سن و جنس همسان سازی خواهند شد.

جمع آوری دادها با انجام آزمایشات Methylation specific PCR و PCR-RFLP و سنجش های کالریمتری بر روی نمونه های بیماران و افراد کنترل صورت می گیرد.

برای ارزیابی پایائی (Reliability) نتایج تحقیق از روش داپلیکیت (آزمون دوباره) بر روی نتایج بدست آمده استفاده خواهد شد بدین صورت که تعدادی از جوابهای مثبت و منفی به صورت راندوم دوباره تکرار می شوند تا قابلیت تکرار پذیری و میزان قابل اعتماد بودن آنها مشخص شود. همچنین روشهای مورد استفاده در این تحقیق (Methylation specific PCR و PCR-RFLP) از روایی بالایی برخوردار هستند بطوریکه در مطالعات مختلفی نیز از این روش ها برای آزمایشات مربوطه استفاده کرده اند.

ابتدا بیماران مبتلا به CAD و افراد کنترل زیر نظر متخصص قلب و عروق انتخاب می شوند. بیماران و افراد گروه شاهد از بین افراد مراجعه کننده به بخش و یا کلینیک قلب انتخاب خواهند شد. سپس نمونه خون ناشتا از جامعه مورد مطالعه گرفته می شود. بخش سرمی خون جدا شده و تا زمان آنالیز چربی های سرم در 20- نگهداری می شود. بخش سلولی خون نیز برای استخراج DNA مورد استفاده قرار می گیرد. DNA استخراج شده تعیین کمیت شده و حدود ng1000 از DNA استخراج شده با استفاده از کیت EpiTec bisulphite، بی­سولفیته می شود که این مرحله حدود 6 ساعت زمان می برد که در این مرحله سیتوزین های غیر متیله تبدیل به اوراسیل شده در حالیکه سیتوزین های متیله بدون تغییر می مانند که در مرحله بعد قابل شناسایی می شوند . برای بررسی وضعیت متیلاسیون از روش MSP  (Methylation Specific PCR) استفاده می شود. برای این منظور از دو سری پرایمر اختصاصی استفاده می شود که یک سری اختصاصی حالت متیله ژن بوده و سری دوم هم اختصاصی حالت غیر متیله ژن بوده، سپس با هر دو سری پرایمر، PCR جداگانه انجام میگیرد. در هر ران کاری از DNA متیله و DNA  غیر متیله (EpiTect PCR Control DNA Set) بعنوان کنترل واکنش پرایمرهای متیله و غیر متیله استفاده شده و MSP انجام می شود. محصول PCR حاصل از واکنش های MSP روی ژل آگارز الکتروفورز شده که نهایتا با در نظر گرفتن الگوی واکنش دهی پرایمر ها وضعیت متیلاسیون ژن مشخص می شود. برای تعیین ژنوتایپ های مختلف  (ε2 / ε2 ، / ε2 / ε3  ، ε2 / ε4 ، ε3 / ε3 ، ε3 / ε4 و ε4 / ε4) ژن ApoE از روش روش PCR-RFLP استفاده میشود که در این روش ابتدا با استفاده از پرایمر ناحیه ژنی در بردارنده جهشهای ApoE تکثیر شده سپس محصول PCR که bp210 طول دارد  با استفاده از آنزیمهای محدودالاثر AflIII و HaeII انکوبه شده و برش می خورد که در مرحله بعد روی ژل آگارز الکتروفورز شده و با در نظر گرفتن الگوی قطعات برش یافته (الل ε2 قطعه bp168 ، الل ε3 قطعه bp145 و الل ε4 قطعه bp195) ژنوتیپ مشخص می شود. همچنین برای ژنوتایپینگ واریانت C677T ژن MTHFR نیز از روش PCR-RFLP استفاده میشود که در این روش ابتدا با استفاده از پرایمر ناحیه ژنی در بردارنده  جهش  C677T تکثیر شده سپس محصول PCR ) bp195) ا استفاده از آنزیم محدودالاثر Hinf I برش می خورد که در مرحله بعد الکتروفورز شده و با در نظر گرفتن الگوی قطعات (الل C bp195 و الل T bp175 و bp23( ایجاد شده، ژنوتیپ مشخص می شود. سنجش لیپید های سرم با روش های روتین کالریمتری صورت می گیرد.

با استفاده از آمار توصیفی ( درصد ، تعداد، میانگین و انحراف معیار و ...) نتایج ارائه می شوند. داده های کمی به صورت میانگین و انحراف معیار ((X± 2 SD ارائه می شوند و با آزمون t test مقایسه می شوند . از آزمون  Chi- squareو آزمون t مستقل (independent- t test ) برای بررسی ارتباط متغیرها بین دو گروه استفاده می شود. برای مقایسه شیوع ژنوتیپ ها و الل های پلی مورفیسم مورد مطالعه بین بیماران و افراد کنترل سالم از آزمون Chi-square استفاده خواهد شد. همچنین فروانی متیلاسیون بین بیماران و افراد کنترل سالم به صورت درصد بیان شده و با آزمون  Chi- square آنالیز خواهند شد . اثرات متغیر های مخدوش کننده نظیر دیابت، فشار خون بالا، سیگار کشیدن و چربی خون بالا در آنالیز آماری لحاظ خواهند شد.  لازم به ذکر است مقادیر  p-value کمتر از 05/0 از لحاظ آماری معنی دار در نظر گرفته خواهد شد.نرم افزار مورد استفاده 16-SPSS خواهدبود.

نمونه گیری از بیماران و افراد کنترل سالم با کسب رضایت داوطلبانه و آگاهانه صورت خواهد گرفت. اطلاعات خصوصی بیماران منتشر نخواهد شد. نتایج آزمایشات بیماران و افراد کنترل  به صورت کلی و بدون ذکر مشخصات فردی خواهد بود. تمامی مراحل تحقیق زیر نظر کمیته اخلاق دانشگاه خواهد بود.

مراحل انجام تحقیق مطابق با ملاحظات اخلاقی مندرج در دفترچه'راهنمای عمومی اخلاق در پژوهشهای علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی در جمهوری اسلامی ایران' و کد های 5-1، 8-7،20-10 و 31-25  مندرج در دفترچه مذکور خواهد بود .

مذکور به شرح ذیل خواهد بود .
۱- هدف اصلی هر پژوهش باید ارتقای سلامت انسانها توأم با رعایت کرامت و حقوق ایشان باشد.
۲ - در پژوهش بر آزمودنی انسانی، سلامت و ایمنی فرد فرد آزمودنی ها در طول و بعد از اجرای پژوهش، بر تمامی مصالح دیگر اولویت دارد. هر پژوهشی که بر روی آزمودنی انسانی انجام میگیرد، باید توسط افرادی طراحی و اجرا شود که تخصص و مهارت بالینی لازم و مرتبط را داشته باشند. در کارآزماییهای بالینی بر روی بیماران یا داوطلبهای سالم
نظارت پزشک دارای مهارت و دانش متناسب الزامی است .
۳ پژوهش بر انسان فقط در صورتی توجیهپذیر است که منافع بالقوهی آن برای هر فرد آزمودنی بیشتر از خطرها ی -آن باشد. در پژوهشهای دارای ماهیت غیر درمانی، سطح آسیبی که آزمودنی در معرض آن قرار میگیرد نباید بیشتر از آنچه باشد که مردم عادی در زندگی روزمرهی خود با آن مواجه میشوند. حصول اطمینان از این امر برعهدهی طراحان ،
مجریان و همکاران پژوهش و تمامی شوراهای بررسی یا پایشکنندهی پژوهش از جمله کمیتهی اخلاق در پژوهش است.
۴- مواردی از قبیل سرعت، سهولت کار، راحتی پژوهشگر، هزینهی پایینتر و/ یا صرفاً عملی بودن آن به هیچ وجه نباید موجب قرار دادن آزمودنی در معرض خطر یا زیان افزوده یا تحمیل هر گونه محدودیت اختیار اضافی به وی شود.
۵- قبل از آغاز هر پژوهش پزشکی ، باید اقدامات اولیه جهت به حداقل رساندن زیان احتمالی وارده به آزمودنیها و تامین سلامت آنها انجام گیرد .
۷- اگر در حین اجرای پژوهش مشخص شود که خطرات شرکت در این پژوهش برای آزمودنیها بیش از فواید بالقوهی آن است، باید آن پژوهش بلافاصله متوقف شود.
۸- طراحی و اجرای پژوهشهایی که بر روی آزمودنی انسانی انجام میگیرند، باید منطبق با اصول علمی پذیرفته شده بر اساس دانش روز و مبتنی بر مرور کامل منابع علمی موجود و پژوهشهای قبلی آزمایشگاهی، و در صورت لزو م ، حیوانی مناسب باشد. مطالعات حیوانی باید با رعایت کامل اصول اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی انجام شوند .
۱۰ - هر پژوهشی باید بر اساس و منطبق بر یک طرحنامه (پروپوزال) به انجام برسد. در کارآزماییهای بالینی باید علاوه بر طرح نامه، دستورالعمل (پروتکل) نیز تهیه و ارائه شود. طرحنامه و دستورالعمل باید شامل تمامی اجزای ضروری باشد. از جمله بخش ملاحظات اخلاقی، اطلاعات مربوط به بودجه، حمایت کنندهها، وابستگیهای سازمانی ،
موارد تعارض منافع بالقوهی دیگر، مشوقهای شرکت کنندگان، پیش بینی درمان و یا جبران خسارت افراد آسیب دیده در پژوهش .در مواردی که لازم است رضایتنامهی آگاهانه بهصورت کتبی اخذ شود، فرم رضایتنامه باید تدوین و به طرحنامه پیوست شده باشد. پیش از تصویب یا تأیید طرحنامه از سوی کمیتهی مستقل اخلاق در پژوهش، نباید اجرای
پژوهش شروع شود .
۱۱ - کمیتهی اخلاق در پژوهش علاوه بر بررسی و تصویب طرحنامه و دستورالعمل، این حق را دارد که طرحها را در حین و بعد از اجرا را از نظر رعایت ملاحظات اخلاقی مورد پایش قرار دهد. اطلاعات و مدارکی که برای پایش از سوی کمیته ی اخلاق درخواست میشود، باید از سوی پژوهشگران در اختیار این کمیته گذاشته شود.
۱۲ - انتخاب آزمودنیهای بالقوه از میان جمعیت بیماران یا هر گروه جمعیتی دیگر، باید منصفانه باشد، به نحوی که توزیع بارها (خطرات یا هزینهها) و منافع شرکت در پژوهش، در آن جمعیت و کل جامعه، تبعیضآمیز نباشد .
۱۳ - کسب رضایت آگاهانه و آزادانه در هر پژوهشی که بر روی آزمودنی انسانی اجرا میشود، الزامی است. این رضایت باید به شکل کتبی باشد. در مواردی که اخذ رضایت آگاهانهی کتبی غیر ممکن یا قابل صرفنظر باشد، باید موضوع با ذکر دلایل به کمیته ی اخلاق منتقل شود. در صورت تأیید کمیتهی اخلاق، اخذ رضایت کتبی قابل تعویق یا تبدیل به
رضایت شفاهی یا ضمنی خواهد بود.

14-- اگر در طول اجرای پژوهش تغییری در نحوه اجرای پژوهش داده شود یا اطلاعات جدیدی به دست آید که احتمال داشته باشد که بر تصمیم آزمودنی مبنی بر ادامهی شرکت در پژوهش تاثیر گذار باشد، باید موضوع به اطلاع کمیتهی اخلاق رسانده شود و در صورت موافقت کمیته با ادامهی پژوهش، مراتب به اطلاع آزمودنی رسانده شود ورضایت آگاهانه مجددا اخذ گردد .

15- پژوهشگر باید از آگاهانه بودن رضایت اخذشده اطمینان حاصل کند. برای این منظور، در تمامی پژوهشهای پزشکی، اعم از درمانی و غیردرمانی، پژوهشگر موظف است فرد در نظر گرفته شده بهعنوان آزمودنی را از تمامی اطلاعاتی که میتوانند در تصمیمگیری او مؤثر باشند، بهنحو مناسبی آگاه سازد. این اطلاعات مشتملند بر: عنوان و اهداف پژوهش، طول مدت پژوهش، روشی که قرار است بهکار گرفته شود (شامل احتمال تخصیص تصادفی به گروهمورد یا شاهد)، منابع تأمین بودجه، هر گونه تعارض منافع احتمالی، وابستگی سازمانی پژوهشگر، و فواید و زیانهایی که انتظار میرود مطالعه در بر داشته باشد. همچنین، هر آزمودنی باید بداند که میتواند هر لحظه که بخواهد از مطالعه خارج شود و باید دربارهی خطرات و زیانهای بالقوهی ناشی از ترک زودرس پژوهش آگاه و پشتیبانی شود . پژوهشگر همچنین باید به تمامی سؤالات و دغدغههای این افراد، با حوصله و دقت پاسخ بدهد. این موارد باید در رضایتنامه ی آگاهانه منعکس شود.
۱۶ - پژوهشگر باید از آزادانه بودن رضایت اخذ شده اطمینان حاصل کند. رفتارهایی که به هر نحوی متضمن تهدید ، اغوا، فریب و یا اجبار باشد موجب ابطال رضایت آزمودنی میشود. به فرد باید فرصت کافی برای مشاوره با افرادی که مایل باشد – نظیر اعضای فامیل یا پزشک خانواده - داده شود. همچنین، در پژوهشهایی که پژوهشگر مقام سازمانی
بالاتری نسبت به آزمودنی داشته باشد، دلایل این شیوهی جذب آزمودنی، باید توسط کمیتهی اخلاق تأیید شود، در این موارد شخص ثالث و معتمدی باید رضایت را دریافت کند.
۱۷ - پژوهشگر ارشد مسؤول مستقیم ارائهی اطلاعات کافی و به زبان قابل فهم برای آزمودنی ، اطمینان از درک اطلاعات ارائه شده، و اخذ رضایت آگاهانه است. در مواردی که بنا بهدلیلی، نظیر زیاد بودن تعداد آزمودنیها، این اطلاعرسانی از طریق شخص دیگری انجام میگیرد، این پژوهشگر ارشد است که مسؤول انتخاب فردی آگاه و مناسب
برای این کار و حصول اطمینان از تأمین شرایط مذکور در این بند است .
۱۸ - در پژوهشهایی که از مواد بدنی (شامل بافتها و مایعات بدن انسان) یا دادههایی استفاده میشود که هویت صاحبان آنها معلوم یا قابل کشف و ردیابی است، باید برای جمعآوری، تحلیل، ذخیره سازی و /یا استفادهی مجدد از آنها رضایت آگاهانه گرفته شود. در مواردی که اخذ رضایت غیرممکن باشد یا اعتبار پژوهش را خدشهدار کند، میتوان در
صورت بررسی مورد و تصویب کمیتهی اخلاق ، از دادهها یا مواد بدنی ذخیره شده، بدون اخذ رضایت آگاهانه استفاده کرد .
۱۹ - عدم قبول شرکت در پژوهش، یا ادامه ندادن به همکاری، نباید هیچگونه تأثیری بر خدمات درمانی که در همان مؤسسه – نظیر بیمارستان – به فرد ارائه میشود، داشته باشد. این موضوع باید در فرایند اخذ رضایت آگاهانه، به آزمودنی اطلاع داده شود .
۲۰ - در مواردی که آگاه کردن آزمودنی دربارهی جنبهای از پژوهش باعث کاهش اعتبار پژوهش می شود، ضرورت اطلاع رسانی ناکامل از طرف پژوهشگر باید توسط کمیتهی اخلاق تأیید شود. بعد از رفع عامل این محدودیت، باید اطلاعرسانی کامل به آزمودنی انجام گیرد .
۲۵ - پژوهشگر مسؤول رعایت اصل رازداری و حفظ اسرار آزمودنیها و اتخاذ تدابیر مناسب برای جلوگیری از انتشار آن است. همچنین، پژوهشگر موظف است که از رعایت حریم خصوصی آزمودنیها در طول پژوهش اطمینان حاصل کند . هرگونه انتشار دادهها یا اطلاعات بهدست آمده از بیماران باید بر اساس رضایت آگاهانه انجام گیرد.
۲۶ - هر نوع آسیب یا خسارت ناشی از شرکت در پژوهش باید بر طبق قوانین مصوب جبران خسارت شود. این امر باید در هنگام طراحی پژوهش لحاظ شده باشد. نحوهی تحقق این امر ترجیحاً بهصورت پوشش بیمهای نامشروط باشد.
۲۷ - در پایان پژوهش، هر فردی که بهعنوان آزمودنی به آن مطالعه وارد شده است، این حق را دارد که دربارهی نتایج مطالعه آگاه شود و از مداخلات یا روشهایی که سودمندیشان در آن مطالعه نشان داده شده است، بهرهمند شود .
۲۸ - پژوهشگران موظفند که نتایج پژوهشهای خود را صادقانه ، دقیق، و کامل منتشر کنند. نتایج، اعم از منفی یا مثبت، و نیز منابع تأمین بودجه، وابستگی سازمانی، و تعارض منافع – در صورت وجود – باید کاملاً آشکارسازی شوند .پژوهشگران نباید در هنگام عقد قرارداد انجام پژوهش، هیچ گونه شرطی را مبنی بر حذف یا عدم انتشار یافتههایی که
از نظر حمایت کنندهی پژوهش مطلوب نیست، بپذیرند .
۲۹ - نحوهی گزارش نتایج پژوهش باید ضامن حقوق مادی و معنوی تمامی اشخاص مرتبط با پژوهش، از جمله خود پژوهشگر یا پژوهشگران، آزمودنیها و مؤسسهی حمایت کنندهی پژوهش باشد.
۳۰ - گزارشها و مقالات حاصل از پژوهشهایی که مفاد این راهنما را نقض کردهاند، نباید برای انتشار پذیرفته شوند .
۳۱ - روش پژوهش نباید با ارزشهای احتماعی، فرهنگی و دینی جامعه در تناقض باشد .

محدودیتهای طرح شامل عدم همکاری بیماران جهت ورود به مطالعه و تاخیر در تهیه و ارائه کیت های مورد نیاز توسط شرکت های مختلف عرضه کننده مواد بیولوژی  می باشد.

بیماری شریان کرونری، متیلاسیون، پلی مورفیسم ژنتیکی

1. Baccarelli A, Rienstra M, Benjamin EJ. Cardiovascular epigenetics: basic concepts and results from animal and human studies. Circ Cardiovasc Genet 2010;3(6):567-73.
2. Guay S-P, Brisson D, Lamarche B, Gaudet D, Bouchard L. Epipolymorphisms within Lipoprotein genes contribute independently to plasma lipid levels in familial hypercholesterolemia. Epigenetics 2014; 9(5):718-729.
3. Ang LS CR, Hendel A, Granville DJ. Apolipoprotein E, an, important player in longevity and age-related diseases. Exp. Gerontol 2008; 43, 615–622.
4. Alvim RO, Freitas SR, Ferreira NE, Santos PC, Cunha RS, Mill JG, Krieger JE, Pereira AC.APOE polymorphism is associated with lipid profile, but not with arterial stiffness in the general population. Lipids Health Dis. 2010 8;9:128.
5. 'Alzheimer Research Forum: Meta-Analyses of apolipoprotein E AD Association Studies'.
6. Yousuf FA, Iqbal MP. Apolipoprotein E (Apo E) gene polymorphism and coronary heart disease in Asian populations. Pak J Pharm Sci. 2015;28(4):1439-44.
7. Elmadbouh I, Elghobashy Y, Abd-Allah E, Reda AA, Fathe A, Tayel S, et al. Relationship of apolipoprotein E polymorphism with lipid profiles in atherosclerotic coronary artery disease. The Egyptian Heart Journal.  2013; 65 (2): 71–78.
8. Karahan Z, Uğurlu M,  Uçaman B, Uluğ AV,  Kaya İ, Çevik K, et al. Relation between Apolipoprotein E Gene Polymorphism and Severity of Coronary Artery Disease in Acute Myocardial Infarction. Cardiology Research and Practice. 2015;363458.
9. Lamia F. Abu. Marrzoq, Fadel A. Sharif, Abdalla A. Abed. Relationship between ApoE gene polymorphism and coronary heart disease in Gaza Strip. J Cardiovasc Dis Res. 2011; 2(1): 29–35.
10. Heidari MM, Foruzannia SK, Khatami M, Hadadzadeh M, Emami Meybodi M. Apolipoprotein e gene polymorphism in Iranian coronary atherosclerosis patients candidate for coronary artery bypass graft. Iran J Basic Med Sci. 2013;16(7):841-4.
11. Xu M, Zhao J, Zhang Y, Ma X, Dai Q, Zhi H, et al. Apolipoprotein E Gene Variants and Risk of Coronary Heart Disease: A Meta-Analysis. Biomed Res Int. 2016;2016:3912175
12. Yi-Deng J, Tao S, Hui-Ping Z, Jian-Tuan X, Jun C, Gui-Zhong L, et al. Folate and ApoE DNA methylation induced by homocysteine in human monocytes. DNA Cell Biol 2007;26(10):737-44.
13. Ma Y, Smith CE, Lai CQ, Irvin MR, Parnell LD, Lee YC, et al. Genetic variants modify the effect of age on APOE methylation in the Genetics of Lipid Lowering Drugs and Diet Network study. Aging Cell 2015;14(1):49-59.
14. Khan SU, Izharullah M, Nawza U, Nawaz Khan T. Epigenetics and Apo-E Promoter Methylation: Association of Apo-E Promoter Methylation in Patho-genesis of Atherosclerosis and Cardiovascular Diseases. EC Cardiology 2015;1:10-6.
15. Yu CE, Foraker J. Epigenetic considerations of the APOE gene. Biomol Concepts 2015;6(1):77-84.
16. Zhu Q, Jin Z, Yuan Y, Lu Q, Ge D, Zong M. Impact of MTHFR gene C677T polymorphism on Bcl-2 gene methylation and protein expression in colorectal cancer. Scandinavian journal of gastroenterology. 2011;46(4):436-45.
17. Liang Y, Yang X, Ma L, Cai X, Wang L, Yang C, et al. Homocysteine-mediated cholesterol efflux via ABCA1 and ACAT1 DNA methylation in THP-1 monocyte-derived foam cells. Acta Biochim Biophys Sin 2013;45(3):220-8.
18. Henk J. Blom and Yvo Smulders. Overview of homocysteine and folate metabolism. With special references to cardiovascular disease and neural tube defects. J Inherit Metab Dis. 2011 Feb; 34(1): 75–81.
19. S. Brustolin, R. Giugliani, and T. M. Félix. Genetics of homocysteine metabolism and associated disorders. Braz J Med Biol Res. 2010; 43(1): 1–7.

مقایسه فراوانی واریانت های های ژنتیکی  rs429358 و rs7412 و متیلاسیون پروموتر ژن ApoE  و تاثیر پلی مورفیسم rs1801133      ژن  MTHFR بر متیلاسیون پروموتر ژن ApoE در بیماران مبتلا به بیماری شریان کرونری و افراد کنترل سالم

برای بررسی میزان چربی های خون و همچنین استخراج DNA از هر کدام از افراد مورد مطالعه ۵ سی سی خون گرفته خواهد شد.

برای افراد شرکت کننده در این پژوهش پروفایل لیپید های خون شامل تری گلیسیرید، کلسترول، HDL ( چربی مفید) و LDL (جربی مضر) سنجش خواهد شد. همچنین وضعیت قلبی و عروقی آنها نیز توسط متخصص قلب و عروق معاینه خواهد شد.

عارضه جانبی خاصی برای افراد شرکت کننده ایجاد نمی شود. تنها عارضه جانبی ندرتا ممکن است کبودی محل خونگیری باشد.

همانطور که ذکر گردید در این مطالعه هیچ گونه مداخله درمانی و یا تشخیصی تهاجمی در بیماران انجام نخواهد شد و لذا احتمال عارضه جانبی نیز برای بیماران بسیار کم است. تنها عارضه ممکن است کبودی و درد ناحیه خونگیری باشد که در صورت نیاز به ویزیت پزشک هزینه مربوطه از طرف مجری طرح تامین خواهد شد

کلیه هزینه های مربوط به معاینه بیماران، سنجش لیپید های خون و انجام آزمایشات ژنتیکی بر عهده محقق بوده و از محل طرح پژوهشی تامین خواهد شد.

روش جایگزینی وجود ندارد و چنانچه بیمار به هر دلیلی از شرکت در مطالعه امتناع ورزد محق است که از مطالعه خارج شود بدون آنکه تغییری در نحوه رفتار پزشک درمانگر یا نحوه درمان و مراقبت از بیماری ایجاد شود. در این گونه موارد لازم است افراد جدیدی جایگزین شوند.

مجری طرح متعهد می شود که نتایج آزمایشها و روشهای به کار رفته به اطلاع بیمار خواهد رسید و این نتایج بصورت کاملاً محرمانه و صرفاً جهت مقاصد پژوهش به کار خواهد رفت و هویت شرکت کننده و همچنین بیماری وی در چارچوب قانون و جامعه و خانواده محرمانه خواهد ماند.

آدرس و شماره تلفن تماس مجری یا مجریان طرح به شرح زیر می باشد. دانشگاه علوم پزشکی زاهدان، دانشکده پزشکی، گروه فیزیولوژی، دکتد حبیب غزنوی شماره تماس: ۰۹۱۵۱۴۱۳۹۰۹

شرکت من در مطالعه کاملاً اختیاری است و آزاد خواهم بود که از شرکت در مطالعه امتناع نموده یا هر زمان که مایل بودم بدون آنکه تغییری در نحوه رفتار پزشک درمانگر یا نحوه درمان و مراقبت از بیماری اینجانب ایجاد شود از پژوهش مذکور خارج شوم.

با توجه به اطلاعات موجود در این فرم و توضیحات حضوری مجری یا همکاران طرح موافقت خود را با شرکت در این مطالعه اعلان می نمایم. یک نسخه از این فرم به من داده شده و فرصت خواندن آن را داشته ام.

پرسشنامه و فرم اطلاعاتی به پیوست می باشد