بررسی پلی مورفیسم rs4988453 (-938C/A) ژن MYD88 در بیماران مبتلا به سل ریوی و افراد سالم شهر زاهدان

مراکز تحثیثاتی

بیماری سل (TB) که به واسطه ی مایکو باکتریوم توبر کلوزیس ایجاد میشود یکی از قدیمی ترین بیماریهای شناخته شده ای است که در انسان ایجاد می شود و در صورت عدم درمان در بیش از 50 درصد موارد بعد از پنج سال با مرگ و میر همراه خواهد بود.¹  توبرکلوز بعد از HIV دومین علت مرگ و میر ناشی از بیماریهای عفونی در جهان می باشد و در سال 1993 سازمان بهداشت جهانی از این بیماری به عنوان اورژانس بهداشت جهانی یاد کرده است. ²  5/14 میلیون نفر در دنیا مبتلا به بیماری سل هستند که بیش از 80درصد این موارد مربوط به 22 کشور در حال توسعه ی دنیا است از طرفی بیش از 90 در صد موارد بیماری و مرگ ناشی از سل در کشور های در حال توسعه بوده است که 75 در صد آنها در گروه سنی فعال از نظر اقتصادی یعنی(54-15)سالگی رخ میدهد.^3و4

در ایران شایع ترین نوع سل، سل ریوی بوده، به طوری که سل ریوی اسمیر خلط مثبت 53% کل موارد سل را تشکیل می دهد.سل خارج ریوی نیز 28% کل موارد سل را شامل می شود. در میان استان ها، گلستان و سیستان و بلوچستان بیشترین میزان های بروز و شیوع را در کشور دارا هستند. در استان سیستان و بلوچستان با توجه به همسایگی با دو کشور افغانستان و پاکستان که در زمره ی 22 کشور بسیار آلوده ی دنیا هستند شیوع این بیماری به میزان زیادی مشاهده می شود و بیشترین بروز انواع سل بدون در نظر گرفتن ملیت بیماران در استان سیستان و بلوچستان در شهر زابل گزارش شده است.  بر طبق آخرین آمار منتشره وزارت بهداشت(از جمعیت تحت پوشش دانشگاه ها)، میزان بروز بیماری سل به ترتیب در زابل  و زاهدان 7/109 و 6/36 در 100000 نفر جمعیت در سال 88 گزارش شده است. ^5و6

TB معمولاً ریه را درگیر می کند هر چند تا یک سوم موارد ارگانهای دیگر هم درگیرند، شایعترین محل هایی که در سل خارج ریوی درگیر می شوند به ترتیب شیوع عبارتند از: غدد لنفاوی، پلور، دستگاه گوارش، استخوانها و مفاصل، مغز و پریتوئن. در اثر گسترش هماتوژن در بیماران مبتلا به HIV سل خارج ریوی امروز بیش از گذشته ایجاد می شود² به طوری که سل خارج ریوی در 60-40 % مبتلایان به AIDS اثبات شده است.¹

تقریبا 10 درصد افراد مبتلا به عفونت مایکوباکتریوم توبرکلوزیس به سمت بیماری ریوی یا خارج ریوی سل پیشرفت می کنند و از جمله عوامل موثر در پیشرفت عفونت به بیماری فعال سل عوامل دفاعی بدن میزبان می باشد. ⁷ استعداد ابتلا به سل مولتی فاکتوریال بوده و فرم فعال بیماری از نتیجه بر هم کنش بین میزبان و پاتوژن و تحت تأثیر فاکتورهای محیطی و ژنتیکی قرار دارد که در این بین فاکتورهای ژنتیک میزبان از جمله مهمترین موارد تعیین کننده استعداد میزبان برای ابتلا به بیماری فعال و موارد شدید و مقاوم بیماری می باشد.⁸

ایمنی ذاتی، با واسطه TLR ها، نقش مرکزی در پاسخ به سل ایفا می کند. TLR ها گیرنده های غشا هستند که الگوهای مولکولی مرتبط  با پاتوژن های مختلف (PAMPs) را تشخیص میدهد. ⁹ پاسخ اولیه تمایز میلوئیدی ژن 88 (MyD88) برای سیگنال دهی TLR حیاتی است.¹⁰

پروتئین آداپتور MyD88 سیگنال مسیرهای مهم انتقال بیولوژیکی متعددی را در در دستگاه ایمنی ذاتی میانجگری می کند ¹¹ همچنین سیگنال دهی MyD88 در تعدیل التهاب در طول عفونت باکتریایی وپیشرفت سرطان مهم است.¹²
MyD88  برای محافظت در برابر سل قابل توجه است به طوریکه ثابت شده موش ها با یک حذف کامل ژن MYD88  مستعد عفونت هستند. ¹³

این داده ها نشان می دهد MyD88 ، نقش قطعی در پاسخ ایمنی بدن انسان به سل دارد. در واقع، تعدادی از مطالعات انسانی این مشاهدات بالینی را تایید کرده اند. کمبود MyD88 با استعداد ابتلا به بیماری پنوموکوکی مهاجم و عفونت های ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس و سودوموناس مرتبط شده است. ¹⁴

MyD88  نقش محوری را در فعال سازی پاسخ ایمنی ذاتی به سل ایفا می کند. در مقایسه موش های وحشی ، موش ها با  MYD88 حذفی بیشتر مستعد ابتلا به عفونت هستند. درکمبود MyD88  ماکروفاژها قادر به بیان سیتوکین های پیش التهابی هستند، اما در تولید TNF، IL-12، و NO در پاسخ به تحریک مایکوباکتریوم دارای نقص است. ¹⁵

داده های تجربی نشان می دهد تفاوت گرانولوماتوز التهابی تشدید شده و نکروز در ریه موش های MYD88 - / - نسبت به افراد نرمال، در 5 هفته پس از عفونت بیشتر مشخص میشود. این نیز یافت شده است که IL-12، IFN-γ و TNF، که در مقاومت انسان به مایکوباکتریوم دخیل است ، در ریه آلوده ی حیوانات با کمبود MYD88 به میزان قابل توجهی کاهش می یابد. ¹⁶

گرانولوم به طور کلی به منظور محدود کردن پاتوژن ، محدود کردن التهاب، و محافظت از بافت اطراف تشکیل می شود.                                           
سیتوکین یک نقش محوری در توسعه گرانولوم بازی میکند در حالی که قسمت قابل توجهی از فعال کردن پاسخ ایمنی مرکزی در فاکتور رونویسی NFκ-Β توسط MyD88 انجام شده است .قبلا نشان داده شده است که TLR9 خاص و / یا هاپلوتیپ MYD88 با بیماری های که با حضور گرانولوم مشخص میشوند، مانند لنفوم هوچکین و سارکوئیدوز مرتبط است. ^17و18

با درنظرداشتن اینکه تکامل و تجمع گرانولوم اختلال اساسی در سل را پایه گذاری می کند ، فرض پلی مورفیسم ژنتیکی در MYD88 را  محتمل جلوه میدهد ، سیگنالینگ شایع مولکول TLR  ، با بیماری درارتباط است. ژن MYD88 بر روی کروموزوم 3p22  واقع  است و متشکل از پنج اگزون است.¹⁹

 پلی مورفیسم های تک نوکلئوتید ( SNP ها )

-938C> A (dbSNP   (rs4988453 و 1944C> G   rs4988457 dbSNP) )  دو تا از شایعترین هاپلوتیپ ها در سفیدپوستان را تعریف می کنند. ²⁰.

با توجه به اهمیت بیماری سل و شیوع قابل ملاحضه آن در منطقه و لزوم تشخیص و درمان به موقع به خصوص در افراد مبتلا به عفونت و با توجه به مطالعات کمی که روی استعداد ژنتیکی وحساسیت ابتلا به سل انجام شده، هدف از انجام این مطالعه مقایسه بررسی پلی فوریسم rs49883(-938C/A) ژن MYD88 در بیماران مبتلا به سل ریوی در مقایسه با افراد سالم در شهرستان زاهدان میباشد تا بتوان با استفاده از نتایج این مطالعه برنامه ریزی لازم برای اقدامات تشخیص و درمانی مناسب مخصوصا در افراد مستعد موارد شدید بیماری سل اجرا نمود.

توزیع فراوانی ژنوتیپ  rs4988453 (-938C/A)  ژن  MYD88 در افراد مبتلا به سل ریوی و افراد سالم متفاوت است.

بررسی پلی مورفیسم  rs4988453 (-938C/A)   ژن   MYD88در بیماران مبتلا به سل ریوی و افراد سالم

​​​​​​​1- مقایسه فراوانی ژنوتیپ  rs4988453 (-938C/A)  ژن  MYD88 در افراد مبتلا به سل ریوی و افراد سالم

دانشگاههای علوم پزشکی

مورد-شاهدی

معیارهای ورود به مطالعه بیماران بالغ (بالای 18 سال) مبتلا به سل ریوی بستری شده در بیمارستان بوعلی زاهدان خواهد بود و سایر معیارهای ورود شامل عدم وجود هر گونه عفونت سیستمیک یا موضعی (با یا بدون درگیری ریوی)، عدم وجود هر گونه بیماری غیر عفونی سیستمیک حاد یا مزمن (با یا بدون درگیری ریوی) و عدم وجود هر گونه نئوپلاسم تشخیص داده شده (با یا بدون درگیری ریوی).

معیار ورود در گروه شاهد نیز سن بالای 18 سال و عدم وجود هر گونه عفونت سیستمیک یا موضعی (با یا بدون درگیری ریوی)، عدم وجود هر گونه بیماری غیر عفونی سیستمیک حاد یا مزمن (با یا بدون درگیری ریوی) و عدم وجود هر گونه نئوپلاسم تشخیص داده شده (با یا بدون درگیری ریوی) خواهد بود.

حجم نمونه حداقل 150 نفر شامل کلیه بیماران مسلول ریوی تشخیص داده شده تحت درمان یا درمان شده شهرستان زاهدان در سال 1396 می باشد.به همین تعداد نیز از افراد سالم جامعه که به بیماری سل مبتلا نشده اند و سابقه هیچ گونه بیماری سیستمیک ندارند انتخاب میشوند..

در دسترس

مشاهده و بررسی‌های آزمایشگاهی

این مطالعه بر روی بیماران مبتلا به سل ریوی که بر اساس علائم بالینی رادیولوژیک و کشت توسط متخصص عفونی تشخیص سل ریوی در آنها مسجل شده است و همچنین از نمونه های جمع آوری شده انجام خواهد شد. در گروه بیماران سل ریوی در ابتدا از نمونه های جمع آوری شده بیماران مشکوک به سل ریوی (دارای علایم: سرفه همراه با خلط و کاهش وزن، هموپتزی، درد قفسه سینه، بی اشتهایی، خستگی و تعریق شبانه) اسمیر مستقیم خلط و کشت باسیل مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (به عنوان روش استاندارد تشخیصی) انجام خواهد شد و با توجه به زمان بر بودن آماده شدن نتایج کشت، در بیمارانی که حداقل دو نمونه اسمیر خلط مثبت داشته باشند نمونه گیری خون انجام شده و بررسی پلی مورفیسم تنها در بیمارانی انجام خواهد شد که کشت مثبت هم داشته باشند.  گروه شاهد همراهان افراد مراجعه کننده غیر مبتلا به سل که از نظر معاینات پزشکی نرمال باشند خواهد بود و دو گروه از نظر سن و جنس همسان سازی خواهند شد. بعد از کسب رضایت از تمامی افراد مورد بررسی 3 میلی لیتر خون وریدی در لوله های حاوی ماده ضد انعقاد EDTA جمع آوری خواهد شد و در دمای 20-  درجه سانتی گراد نگهداری خواهد شد.  DNA توسط روش Salting out استخراج خواهد شد. DNA استخراج شده با استفاده از پرایمرهای اختصاصی و روش PCR تکثیر خواهد شد سپس محصول واکنش با آنزیمهای محدودالاثر برش داده خواهد شد. محصول واکنش در ژل آگاروز 2 درصد با اتیدیوم بروماید رنگ امیزی گردیده بارگذاری خواهد شد و آلل و  ژنوتیپ در دو گروه مشخص خواهد شد..

اطلاعات توسط نرم افزار آماری SPSS تجزیه و تحلیل خواهد شد. برای مقایسه آلل و ژنوتیپ در دو گروه از آزمون Fisher's exact و برای مقایسه پارامترهای دموگرافیک کیفی مثل جنس در دو گروه نیز از آزمون Fisher's exact و برای مقایسه پارامترهای دموگرافیک کمی مثل سن در دو گروه از آزمون t-test استفاده خواهد شد و p کمتر از 05/0 بعنوان سطح معنی داری در نظر گرفته خواهد شد. همچنین Odds Ratio با محدوده اطمینان 95 درصد (CI 95%) نیز برای افراد دارای اختلال ژنی برای ابتلا به سل ریوی محاسبه خواهد شد.

کدهای 1، 2، 3، 8، 10، 11، 13، 15، 18، 25، 28، مصوب کمیته کشوری اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی که در دفترچه راهنمای عمومی اخلاق در پژوهشهای دارای آزمودنی انسانی در جمهوری اسلامی ایران، دربردارنده ی اصول و مقررات اخلاقی‎ مطرح  و در سال 1392 در 31 بند تصویب شده است و همچنین کدهای 1، 2، 3، 4، 7 مربوط به دفترچه راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی در جمهوری اسلامی ایران از قسمت راهنمای عمومی در این طرح رعایت می شود. تمامی بیماران تحت مطالعه آگاهانه و برای مقاصد علمی  اقدام به دادن نمونه خواهند کرد. شرکت در این طرح هیچ گونه هزینه ای برای بیماران ندارد و نام و مشخصات بیماران گزارش نخواهد شد.

محدودیت اجرایی که برای طرح حاضر قابل پیش‌بینی است، عدم همکاری بیماران می‌باشد که در صورت بروز این مسئله فرد دیگری با خصوصیات مشابه جایگزین خواهد شد.

سل ریوی  (pulymornary tuberculosis) ، پلی مورفیسم (polymorphism)  ،  MYD88

1. Kasper DL. Harrison's principles of internal medicine. 17th ed. New York: McGraw-Hill: 2008;p.1006-10020

2. Hass DW. Mycobacterial Disease. In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R, editors. Principles and Practice of Infectious Diseases. 7^th ed. New York: Churchill Livingstone: 2010; p. 3129-63.

 3. Alavi – Naini,Hashemi M,Mohaghegh-Montazeri M , etal.Glutaraldehyde test for rapid diagnosis off pulmonarytuberculosis intg tubere lung dis 2009,13(5):601-605

1. . میر حقانی لیلا و همکاران. راهنمای کشوری مبارزه با سل. مجموعه انتشارات مر کز تحقیقات سل و بیماری های ریوی.. مر کز مدیریت بیماریها. معاونت سلامت. وزارت بهداشت و درمان وآموزش پزشکی1388

5.  ملیحه متانت و دیگران. اپیدمیولوژی سل دردهه اخیر و مروری بر وضعیت آن در جنوب شرق ایران. مجله تحقیقات علوم پزشکی زاهدان، سال 90، دوره 13، شماره 9

6. Khazaei HA, Rezaei N , Bagheri GR , etal. Epidemiology of tuberculosis in the southeastern Iran. Eur J Epidemiol 2005; 20(10) : 879-83

 7. Velez DR, Wejse C, Stryjewski ME, Abbate E, Hulme WF, Myers JL, et al. Variants in toll-like receptors 2 and 9 influence susceptibility to pulmonary tuberculosis in Caucasians, African-Americans, and West Africans. Hum Genet 2010 Jan; 127(1): 65-73.

 8. Velez DR, Hulme WF, Myers JL, Stryjewski ME, Abbate E, Estevan R. Association of SLC11A1 with tuberculosis and interactions with NOS2A and TLR2 in African-Americans and Caucasians. Int J Tubercul Lung Dis 2009 Sep; 13(9): 1068-76.

9. Kawai T, Akira S (2010) The role of pattern-recognition receptors

in innate immunity: update on Toll-like receptors. Nat

Immunol 11:373–384

10. Medzhitov R, Preston-Hurlburt P, Janeway CA Jr (1997) A

human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation

of adaptive immunity. Nature 388:394–397

11. Warner N, Nunez G (2013) MyD88: a critical adaptor protein

in innate immunity signal transduction. J Immunol 190:3–4

12. Wang JQ, Jeelall YS, Ferguson LL, Horikawa K (2014) Toll-

Like Receptors and Cancer: MYD88 Mutation and Inflammation.

Front Immunol 5:367

13. R. Capparelli, F. De Chiara, A. Di Matteo, C.Medaglia, and D.

Iannelli, “The MyD88 rs6853 and TIRAP rs8177374 polymorphic

sites are associated with resistance to human pulmonary

tuberculosis,” Genes and Immunity, vol. 14, no. 8, pp. 504–511,

2013.

14. H. Von Bernuth, C. Picard, Z. Jin et al., “Pyogenic bacterial

infections in humans with MyD88 deficiency,” Science, vol. 321,

no. 5889, pp. 691–696, 2008.

15. Fremond CM, Yeremeev V, Nicolle DM, Jacobs M, Quesniaux

VF, Ryffel B (2004) Fatal Mycobacterium tuberculosis infection

despite adaptive immune response in the absence of

MyD88. J Clin Invest 114:1790–1799

16. C. A. Scanga, A. Bafica, C. G. Feng, A. W. Cheever, S. Hieny,

and A. Sher, “MyD88-deficient mice display a profound loss in

resistance to Mycobacterium tuberculosis associated with partially

impaired Th1 cytokine and nitric oxide synthase 2 expression,”

Infection and Immunity, vol. 72, no. 4, pp. 2400–2404,

2004.

17. V. Mollaki, T. Georgiadis, A. Tassidou et al., “Polymorphisms

and haplotypes in TLR9 and MYD88 are associated with the

development of Hodgkin’s lymphoma: a candidate-gene association

study,” Journal of Human Genetics, vol. 54, no. 11, pp. 655–

659, 2009.

18. Z. Daniil, V.Mollaki, F.Malli et al., “Polymorphisms and haplotypes

in MyD88 are associated with the development of sarcoidosis:

a candidate-gene association study,”Molecular Biology

Reports, vol. 40, no. 7, pp. 4281–4286, 2013.

19. T. P. Bonnert, K. E. Garka, P. Parnet, G. Sonoda, J. R. Testa, and

J. E. Sims, “The cloning and characterization of humanMyD88:

a member of an IL-1 receptor related family,” FEBS Letters, vol.

402, no. 1, pp. 81–84, 1997.

20. R. Lazarus, D. Vercelli, L. J. Palmer et al., “Single nucleotide

polymorphisms in innate immunity genes: abundant variation

and potential role in complex human disease,” Immunological

Reviews, vol. 190, pp. 9–25, 2002.

بررسی پلی مورفیسم  rs4988453 (-938C/A)   ژن    MYD88 در بیماران مبتلا به سل ریوی و افراد سالم شهر زاهدان  

نمونه گیری وتخلیص DNA  از خون تام و انجام PCR

این تحقیق اگر چه فایده فوری نخواهد داشت اما بعلت بررسی استعداد ابتلا به بیماری سل ریوی برای سایر افراد جامعه مفید خواهد بود.

در این طرح بغیر از خونگیری که توسط پرسنل مجرب صورت میگیرد،نمونه ای از بیمار گرفته نمیشود.تنها عارضه جانبی ممکن در زمان خونگیری خواهد بود که با توجه به خبره بودن پرسنل،بعید بنظر میرسد.

جبران عوارض احتمالی بر عهده پژوهشگران خواهد بود.

کلیه هزینه های تشخیصی به عهده مجریان طرح خواهد بود و بیمار هزینه ای را پرداخت نخواهد کرد.

نتایج آزمایشها و روشهای به کار رفته به اطلاع بیمار خواهد رسید و این نتایج بصورت کاملاً محرمانه و صرفاً جهت مقاصد پژوهش به کار خواهد رفت و هویت بیماری وی در چارچوب قانون و جامعه و خانواده محرمانه خواهد ماند

شرکت من در مطالعه کاملاً اختیاری است و آزاد خواهم بود که از شرکت در مطالعه امتناع نموده یا هر زمان  که مایل بودم بدون آنکه تغییری در نحوه رفتار پزشک درمانگر یا نحوه درمان و مراقبت از بیماری اینجانب ایجاد شود از پژوهش مذکور خارج شوم.

با توجه به اطلاعات موجود در این فرم و توضیحات حضوری مجری یا همکاران طرح موافقت خود را با شرکت در این مطالعه اعلان می نمایم. یک نسخه از این فرم به من داده شده و فرصت خواندن آن را داشته ام.

ندارد