شناسایی مولکولی گونه های لیشمانیازیس جلدی با استفاده از واکنش زنجیره پلی مراز ژن kDNA در میرجاوه و ریگ ملک در سال 1396.

         لیشمانیوزها مجموعه ای از بیماریها هستندکه توسط انگل های داخل سلولی اجباری تاژکدار متعلق به جنس  لیشمانیا ایجاد می شود(1). لیشمانیوز یکی از مهمترین بیماریهای گرمسیری است که در انسان به اشکال جلدی (سالک)،احشایی(کالا آزار) و جلدی مخاطی ظاهر می شود که در ایران دو نوع جلدی و احشایی شایع ونوع جلدی مخاطی تاکنون از ایران گزارش نشده است(2و3). سالک به دو فرم روستایی(مرطوب) وشهری(خشک) دیده می شودکه عامل آنها به ترتیب لیشمانیا ماژور و لیشمانیا تروپیکا می باشد. لیشمانیا در فرم روستایی بوسیله گزش پشه خاکی(فلبوتوموس پاپاتاسی) از مخازن حیوانی(جوندگان تحت خانواده جریبلیده) ودر فرم شهری بوسیله گزش پشه خاکی (سرجانتی)از مخازن (انسان وسگ) به انسان منتقل می شود(4و5). %90موارد لیشمانیازیس جلدی از کشورهای افغانستان ،الجزایر،برزیل،ایران،پرو،عربستان وسوریه گزارش می شود. در این بین ایران وعربستان بیشترین میزان شیوع بیماری را دارند. این بیماری یکی از مهمترین و شایعترین بیماریهای بومی ایران ودومین بیماری انگلی قابل سرایت توسط بند پایان بعد از مالاریا است. سالانه حدود 20هزار مورد لیشمانیازیس جلدی  از نقاط مختلف کشور گزارش می شودکه البته میزان واقعی آنراچند برابر میزان گزارش شده تخمین می زنند(11و12) .

       از آنجا که اولین گام در برنامه ریزی جهت کنترل و مبارزه با بیماری،تعیین مشخصات دقیق عامل بیماری است ،آگاهی از از مخازن موجود در هر منطقه و میزان آلودگی آنها،شناسایی گونه ها و سویه های لیشمانیا وآگاهی از تغییرات ژنتیکی آنها می تواند نقش اساسی در برنامه ریزی،کنترل وپیشگیری از بیماری داشته باشد(6).

       به طور کلی یکی از اصول مهم در کنترل و پیشگیری بیماری لیشمانیوز ،شناسایی و تعیین مشخصات گونه های مختلف ایجاد کننده آن است. از سوی دیگر،تعیین سوش غالب در یک منطقه می تواند در مطالعات دارویی،تهیه واکسن وتهیه آنتی ژن مناسب به منظور تشخیص بیماری کاربرد داشته باشد(7). تنوع زیادی که در اشکال بالینی وموقعیت های اپیدمیولوژیک بیماری وجود دارد، نشان دهنده این است که هر کانونی به اصول و روش های کنترلی خاص خود نیاز دارد (8). بیماری سالک در بیش از نیمی از استان های کشوربه صورت بومی وجود داردکه در یازده استان شامل گلستان، اصفهان، سمنان، یزد،کرمان، فارس،بوشهر،هرمزگان خوزستان،ایلام وسیستان وبلوچستان شیوع بالایی دارد(9). بالاترین فراوانی موارد جدید در کشور در سالهای اخیر بوده است .استانهای غربی وشمال غربی دارای کمترین میزان بروز سالک(کمتر از 10مورد در صد هزار نفر) در کشور می باشند(13).

        در سالیان اخیر این بیماری در برخی مناطق کشور به دلایل افزایش نسبی حرارت،توسعه مکانیزه شدن کشاورزی،افزایش سطح زیر کشت و مهاجرت افراد غیر مصون به مناطق آلوده،کویرزدائی و گسترش سریع و بدون برنامه شهر ها و روستا ها ،تغیرات محیط زیست ومهاجرت مخازن انگل به مناطق جدیدونبود واکسن مناسب برای پیشگیری رو به افزایش گذاشته است(14). معمولابه منظور تشخیص آلودگی های لپتو مونادی از توالی های تکراری مانندDNA کینتو پلاست استفاده می شود. انتخاب این توالی ها در سطح جنس یا گونه موجب افزایش حساسیت روش می شود(9). روش های میکروسکپی و یا کشت به عنوان روش های استاندارد طلایی مطرح هستند که هر چند ویژگی بالایی دارند اما از حساسیت متفاوتی برخوردارند. در حال حاضر روش معمول میکروسکپی به عنوان معتبرترین و در دسترس ترین روش برای تشخیص لیشمانیوز پوستی در نظر گرفته می شود. این روش از حساسیت بالایی برخوردار نیست زیرا در بعضی از موارد تعداد انگل کم می باشدو جواب آزمایش منفی کاذب گزارش می شود. تست  PCR یک روش حساس برای تشخیص است که نتیجه رامی توان درمدت کوتاهی گزارش کرد.در دهه گذشته روش های مولکولی متعددی برای مطالعات اپید میولوژیک لیشمانیازیس به کار گرفته شده اند.تکنولوژیPCR در این مطالعات روش موفقی بوده که بدون نیاز به کشت می تواند عفونت را در حد گونه تشخیص دهد.(10). از جمله مزایای روش مولکولی می توان به مواردی ازجمله میزان کمDNA،عدم تاثیر شرایط مخدوش کننده محیط ومیزبان وقابلیت بررسی تعداد کم نمونه در یک زمان بسیار کوتاه وحساسیت بالا اشاره نمود(11). 

         شرایط جغرافیائی استان،مرز مشترک با بعضی کشورها که دارای شیوع بالای بیماری اند و افزایش محصولات کشاورزی در مناطق جدید و گرم شدن تدریجی هوا، باعث تغییراتی در اکولوژی مخزن ،ناقل واحتمالا باعث تغییر در سویه انگل شده است. این شرایط جدید می تواند بقا وگسترش بیماری را در منطقه فراهم می کند.از این رو تحقیقات جامع  روی موارد انسانی ضروری است. بروز وشیوع لیشمانیازیس در سالهای اخیر در استان افزایش یافته است. در این مطالعه به کمک ژنهای kdna با بهره گیری از روش PCR برای ردیابی و پیدا کردن گونه های  انگل در مبتلایان استفاده می شودواین امکان را به ما می دهدکه کانون های جدید آلودگی با انگل لیشمانیا را در استان را شناسائی کنیم.

          یکی از خصوصیات خانواده تریپانوزوماتیده این می باشد که DNA در انگل های لیشمانیا در هسته وخارج از هسته ی آنها هر دو یافت می شود. DNA ای  که خارج از هسته قرار دارد در درون اندامکی به نام کینتوپلاست تجمع یافته است که به هنگام رنگ آمیزی با گیمسا به رنگ بنفش در می آید. کینتوپلاست از نظر میکروسکوپی به صورت دیسکی بر روی غشای میتوکندری، در قاعده ی تاژک قرار گرفته است و از حلقه های بزرگ و کوچک DNA تشکیل یافته است. حلقه های بزرگ از 50-30 کپی بوده و دارای وزن مولکولیbp40000-20000 می باشند و حامل ژن هایی هستند که آنزیم های میتوکندری را می سازند.حلقه های کوچکDNA  به طور متوسط دارای bp 800  می باشد وتا 10000 کپی ازآنها در درون سلول وجود دارد. این ساختار خاص کینتوپلاستیدا می باشد و به نظرمی رسد طی مراحل اولیه ی تکامل از دیگر یوکاریوت ها بوجود آمده        است (15).

1- در مطالعه ای که توسط راواسان و همکاران که در سال 2008 انجام شد مشخص گردید ژنوم کینتوپلاست DNA ،بخش های غیر قابل ترجمه ژن های ریبوزوم و ژن سیستئئین پروتئازB  به ترتیب برای تعیین لپتوموناد یا بررسی های اولیه ، شناسایی کمپلکس دونوآنی و تعیین هویت اعضای کمپلکس  دونوآنی مناسب هستند.(16)

2- مراغی و همکاران در سال 2007 در اهواز با استفاده از ژن kDNA و روش Nested –PCR  ،100 بیمار مبتلا به لیشمانیازیس جلدی را مورد مطالعه قرار دادند و 90%  لیشمانیا میجر و 10% لیشمانیا تروپیکاگزارش کردند(17).

3- پرویزی و همکاران در سال 2008  با تکثیرکامل وتعیین توالی ژن های   ITS- rDNA وkDNA  را طراحی کردندکه قادر است ، استرینهای ژنتیکی لیشمانیا میجر را در پشه خاکی های ایران تشخیص دهد (18).

4- در مطالعه ای که در سال2011 توسط ولاند و همکاران ، ژن لیشمانیا KDNA از  بیماران مبتلا به لیشمانیوز جلدی  با استفاده از PCR  مورد بررسی قرار گرفت و مشخص شد که این ژن در نمونه ادرار 21% از این افراد قابل تشخیص بوده و می توان از آن به عنوان یک عامل تشخیصی و گاهی اوقات به عنوان یک فاکتور پیش آگهی دهنده مورد استفاده قرار گیرد . (19).

5-باریو و همکاران در سال 2007با استفاده از  واکنش زنجیره ای پلیمراز ژن KDNA به عنوان یک روش تشخیصی و حساس از لیشمانیوز تگومنتاری آمریکایی در مناطق بومی شمال آرژانتین استفاده کردند و مشخص نمودند که PCR در افتراق و تشخیص لیشمانیوزیس از سایر میکروارگانیسم ها با ضایعات مشابه دارای حساسیت و اختصاصیت 100% بود . (20).

           در همیین راستا  ما برآنیم در این تحقیق با مشاهدات میکروسکوپی لام های رنگ آمیزی شده با گیمسا و روش PCR  به وجود آلودگی و حضور انگل پی برده سپس این روش ها را مورد مقایسه قرار دهیم و هم چنین گونه های لیشمانیا را با روش مولکولی در شهرستانهای میرجاوه و ریگ ملک مورد بررسی قرارداده زیرا تعیین هویت نوع انگل در انسان در شناسایی جنبه های اپیدمیولوژیک بیماری وارائه برنامه کنترل اهمیت زیادی دارد.

1-  فراوانی موارد لیشمانیوز جلدی بر اساس یافته های  کلینیکی و پارازیتولوژی در جنوب  شرق ایران چقدر است؟

2- فراوانی انگل لیشمانیا با روش واکنش زنجیره پلی مراز  ژن  kDNA  در جنوب شرق ایران چقدر است؟

3-  فراوانی گونه های انگل لیشمانیا با روش واکنش زنجیره پلی مراز  ژن  kDNA  در جنوب شرق ایران چگونه است؟

4- میزان حساسیت و ویژگی یافته های بررسی شده با روش واکنش زنجیره پلی مراز  ژن  kDNA  و روش مستقیم پارازیتولوژی چگونه است؟

شناسایی مولکولی گونه های لیشمانیازیس جلدی با  استفاده از واکنش زنجیره پلی مراز  ژن  kDNA  در جنوب شرق ایران در سال 1396.

1- تعیین  فراوانی موارد لیشمانیوز جلدی بر اساس یافته های  کلینیکی و پارازیتولوژی در جنوب شرق ایران

2-  تعیین فراوانی انگل لیشمانیا با روش واکنش زنجیره پلی مراز  ژن  kDNA  در جنوب شرق ایران

3-  تعیین فراوانی گونه های انگل لیشمانیا با روش واکنش زنجیره پلی مراز  ژن  kDNA  در جنوب شرق ایران

4- مقایسه میزان حساسیت و ویژگی یافته های بررسی شده با روش واکنش زنجیره پلی مراز  ژن  kDNA  و روش مستقیم پارازیتولوژی

• استفاده از نتایج طرح در برنامه ریزی و کنترل بیماری لیشمانیازیس جلدی در استان .
• معرفی روش های جدید مولکولی جهت تشخیص قطعی گونه های لیشمانیادر انسان و استفاده از این روش ها در مراکز دانشگاهی، تحقیقاتی و آزمایشگاه ها و مراکز بهداشتی درمانی کشور .

پروماستیگوت : فرم ﻓﻼژل دار و ﻣﺘﺤﺮک  انگل ﺑـﻮده که ﺑـﻪ صورت اجسام دوکی تاژک دار به طول μ 25-15 و عرض μ 3-2 می باشد.(21)

آماستیگوت: فرم غیر متحرک انگل بوده که حدودا μ 5-2 اندازه  داشته و فاقد تاژک آزاد است. (21)

لیشمانیازیس: لیشمانیازیس یکی از بیماریهای مشترک بین انسان و حیوان میباشدکه به سه شکل جلدی (سالک)،احشایی (کالازار ) وجلدی مخاطی بروزمی کند. (21)

واکنش زنجیره پلی مراز (PCR) :

واکنش زنجیره‎ای پلی‎مراز (PCR) که قطعه‎ای از DNA را با اندازه و سکانس خاصی آمپلی فای می‎کند که با استفاده از یک قطعه ملکول DNA ، موجب تولید میلیونها نسخه از یک توالی خاص DNA می گردد. این روش متکی بر چرخه حرارتی ، شامل چرخه هایی از اعمال حرارت و سردکردن واکنش برای ذوب و نسخه برداری آنزیمی مولکول DNA است. (23)

ACL : از آنجا که مخــــــزن لیشمانیا تروپیکا عمدتاً افراد مبـــــتلا می باشند، به نام نــــوع آنـــــتروپــونـتیک (گفته می شود .(21)

ZCL : لیشمانیا ماژور به دلیل داشتن مخزن جونده به نام نوع زئونوتــــیک نیز نامیده می شود. (21)

لیشمانیا تروپیکا: لیشمانیوز جلدی نوع شهری بوده که به دلیل عدم وجود ترشح در ضایعه به نام نوع خشک نامیده می شود. (21)

لیشمانیا ماژور: لیشمانیوز جلدی نوع روستایی بوده که به دلیل وجود ترشح در ضایعه به نام نوع مرطوب نامیده می شود. (21)

روش مستقیم پارازیتولوژی: در این روش از اطراف زخم نمونه گیری کرده و پس از تهیه گسترش و رنگ آمیزی با گیمسا به دنبال جسم لشمن   می گردیم. (22)

kDNA:

DNA  ای که خارج از هسته قرار دارد در درون اندامکی به نام کینتوپلاست تجمع یافته است که به هنگام رنگ آمیزی با گیمسا به رنگ بنفش در می آید. کینتوپلاست از نظر میکروسکوپی به صورت دیسکی بر روی غشای میتوکندری، در قاعده ی تاژک قرار گرفته است و از حلقه های بزرگ و کوچک DNA تشکیل یافته است.

توصیفی- مقطعی

بیماران مشکوک به لیشمانیوز جلدی(روستایی و شهری) شهرستان های میرجاوه و ریگ ملک که در سال 1396 به مراکز بهداشتی درمانی مراجعه نموده و تشخیص مشکوک بودن توسط پزشک مربوطه داده شده است.

معیار ورود: تمامی کسانی که زخم جلدی دارند و مشکوک به سالک هستند

معیار خروج: افرادی که رضایت به همکاری نداشته اند پس از درمان از مطالعه خارج می شوند.

با توجه به میزان شیوع بیماری در منطقه مورد مطالعه،  نمونه برداری در بازه زمانی یکسال به شکل پاسیو برنامه ریزی شده است، کلیه ی بیماران مشکوک به لیشمانیوز جلدی را مورد بررسی قرار داده تا در طول یکسال حداقل 50 نمونه مثبت بدست آید در صورت عدم دستیابی به تعداد نمونه مورد اشاره در بازه زمانی یکسال ، نمونه برداری یا بصورت اکتیو (فعال) و یا با اضافه نمودن زمان نمونه برداری تا تامین حداقل 50 نمونه صورت خواهد پذیرفت.

روش نمونه گیری به روش سر شماری می باشد و کلیه موارد مشکوک بیماری را که به مراکز بهداشتی و درمانی شهرهای میرجاوه و ریگ ملک  در استان سیستان و بلوچستان مراجعه نموده و پزشک مرکز مشکوک به بیماری لیشمانیوز جلدی شده و همچنین شرایط ورود به مطالعه را داشته باشد وارد مطالعه می شوند.

1.فرم جهت شناسایی افراد مبتلا به سالک 

2.روش میکروسکوپی تهیه ی لام از بافت مشکوک

3.روش مولکولی PCR

در این مطالعه که به صورت توصیفی  تحلیلی انجام خواهد شد، ابتدا اطلاعات مربوط به افراد مشکوک به لیشمانیوز جلدی از مراکز بهداشت و درمان شهرستان های میرجاوه و ریگ ملک دریافت و ضمن مراجعات حضوری از ضایعات پوستی و زخم هایی که مشکوک به سالک می باشد، نمونه برداری صورت خواهد گرفت در مورد هر فرد، اطلاعات فردی، نوع زخم، مدت ابتلا به زخم، تعداد ضایعات، محل ضایعه، سابقه مسافرت به مناطق اندمیک و سابقه مصرف دارو ثبت  خواهد شد. برای نمونه برداری، ابتدا سطح زخم با الکل 70 % ضدعفونی میشود.چنانچه زخم پوشیده از عفونت باکتریایی یا قارچی باشد، قسمت مورد نظر برای نمونه برداری از ضایعات عفونی پاک می شودو سپس به کمک لنست یکبار مصرف استریل، از لبه و حاشیه زخم در جهت مرکز شکافی در زیر ناحیه متورم ایجاد، سپس مقداری از سروزیته توسط لنست به سطح لام منتقل کرده و به خوبی پخش می کنیم. نمونه برداری طوری انجام می شود که حتی المقدور در نمونه خون وارد نشود.  بلافاصله نام و شماره بیمار در کنار لام نوشته میشود. برای مشاهده میکروسکوپی و اسمیرهای تهیه شده از ضایعات بیمار با متانول 95 % به مدت 30 ثانیه فیکس کرده و سپس با رنگ گیمسا (رقت1:10 با آب مقطر (به مدت 20 تا 30 دقیقه رنگ آمیزی می کنیم.پس از رنگ آمیزی، لام ها با آب شسته و بعد از خشک شدن لام، آماستیگوت های انگل روی لام در زیر میکروسکوپ نوری با روغن ایمرسیون و درشت نمایی x1000 جستجو می کنیم.

 آماده سازی نمونه برای کار مولکولار :

1. استخراج  DNA از روی لام های رنگ آمیزی شده با استفاده از کیت تکاپوزیست ، طبق پروتکل آن انجام می دهیم.

2.  غلظت DNA  را با استفاده از روشهای  اسپکتروفتومتری و کیفیت DNA را بعد از الکتروفورز بر روی ژل آگارز بررسی می کنیم

3. جهت انجام PCR از DNA استخراج شده(1.5 میکرولیتر)، پرایمر اختصاصی و Premix-PCR استفاده می گردد . تفاوت در اندازه (size variation) ایجاد شده به وسیله الکتروفورز  بر روی ژل آگارز 2 درصد و رنگ آمیزی SAFE STAIN و مقایسه با ladder marker  تعیین خواهد گردید.

ابتدا اطلاعات  بدست امده از بیماران مربوط به سن , جنس و مشخصات زخم ها جمع بندی و نتایج تنها با استفاده از ازمون  کای اسکوربا استفاده از نرم افزار spss نسخه 20 مورد تجزیه و تحلیل اماری قرار می دهیم و سپس با استناد به روش های آماری توصیفی (جداول توزیع فراوانی و رسم نمودار) داده ها تجزیه و تحلیل خواهند شد. برای  تعیین توافق چند روش از تست آماری kappa statistics  استفاده خواهد شد.

در این پژوهش کدهای اخلاقی زیر از دفترچه راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی  رعایت شده است.    

با کد های ( 1، 2، 3، 4، 5، 7، 10، 11، 12، 13، 14، 15، 16، 17، 18، 19، 20، 21، 22، 23، 25، 26، 27، 28، 29، 30 و 31)

همچنین در این پوهش بر رعایت کدهای زیر از کتاب راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسان  تاکید شده است 

(1-2-3-4-6-7-8-9-12)

کد اخلاقی این پژوهش IR.ZAUMS.REC.1396.119 می باشد 

• عدم همکاری بیمار

راه حل : توضیح دادن در مورد منافع این طرح و این که هیچ ضرری متوجه آنان نخواهد شد و اطلاعات آنها به طور محرمانه باقی خواهد ماند و نامشان به هیچ عنوان فاش نخواهد شد.

• دشوار بودن مسیرها

راه حل : در اختیار قرار گذاشتن ماشین  در اختیار محقق توسط مرکز بهداشت شهرستانهای فوق با همکاری و هماهنگی معاونت دانشگاه علوم پزشکی زاهدان

• اسکان محقق

راه حل : در اختیار قرار دادن خوابگاه توسط مرکز بهداشت شهرستانهای فوق با همکاری و هماهنگی معاونت دانشگاه علوم پزشکی زاهدان

گونه،  لیشمانیوز جلدی، PCR   و  kDNA

1.Bates PA.Transmission of Leishmania metacyclic  Promastigotes by phlebotomine sand flies. Int j Parasitol.2007 Aug:37(10):1097-1106

     2.Killick-Kendric R.Phlebotomine vectors of the Leishmaniases: A review. Vet.Entomol;1990;4;1-2Mhe4

    3. bali M Yaghobi-Ershadi MR Akhavan AA, Hajjaran H ,Abaei MR.                                                     Characterization of Leishmsnia infection in rodents from endemic areas of the Islamic  Republic of Iran.East.med. Health j; 2004;10;591-599

   4.Parvizi P,Ready PD. Nested PCRs and sequencing of nuclear ITrDNA fragment detect three Leishmania species of gerbils in sandflies from Iranian foci of Zoonotic cutaneouse Leishmaniasis.Trop.Med.Int;2008;13;1

   5.Nadim A,Seyedi-Rashti M.A brif reviwew of the epidemiology of various types of leishmaniasis in Iran.Acta Med.Iran;1971;14;99-106

    6.Nadim A,Faghih M .The epidemiology of cutaneous Leishmaniasis in the Isfahan  Province of Iran .I. The Reservoir.II.The human disease .Trans.R.Soc. Trop.Med.Hyg;1986;61;534-542

    7.Albors A,Pouladfar GR, Fakhr M,Motazedian MH,HatamGR,Kadivar MR.Isolation of leshmania tropical from a patient With visceral  leishmaniasis and  disseminated cutaneous leishmaniasis, Southern Iran. Am j Trop Med Hyg 2008; 79(3);435-7 

     8.Goda T.New dimension for parasitology in the 21st century. In Ozcel A.Alkan MZ(eds)    parasitology for 21st century CAB International 1996;1-13 

    9.Banuls AL,Hide M,Prugnoll F. Leishmania and the leishmaniasis ;A Parasite   Genetic Update and Advances in Taxonomy, Epidemiology and Pathogenicity in Human. Adv. Parasitol 2007;64;1-109.

    10. liveira OFS,Pimerz C,Piers MQ, Brazil RP,Pcheco RS. PCR-based diagnosis for  detection of leishmania in skin and blood of rodents from an endemic area cutaneous and visceral leishmaniasis in brazil. Vet Parasitol 2005;129;219-27

    11.. Leishmaniasis and leishmania/HIV co-infection.In: WHO report on global   surveillance of epidemic-prone infectious diseases WHO/CDS,CSR/ISR/2000.I:121

12. Yaghoobi-   Ershadi MR, Zahraei-Ramezani AR, Akhavan AA, Jalali-    Rodent   control operations against zoonotic cutaneous leishmaniasis in      Iran. Ann Saudi Med 2005; 25 (4):309-312 

    13-Athari A, Jalallu N. [Epidemiological survey ofcutaneous leishmaniasis in Iran 2001-2005. Sci J Isfahan Univ Med Sci 2006;24(82):8-13 (Persi 

14- Baily, M. S., Lockwood, D. N. J., 2007. Cutaneous Leishmaniasis. Clinics in Dermathology. 25, 1 203-21 

15. Banuls, A.L.,  Hide, M., Prugnolle, F. (2007). Leishmania and the Leishmaniases: A Parasite Genetic Update and Advances in Taxonomy, Epidemiology and Pathogenicity in Humans. Advances in Parasitology; Vol 64.naturelle de Phlebotomus papatasi dans un foyer de leishmaniose cutanée zoonotique en Tunisie. Bulletin de la Société de Pathologie Exotique.80, PP:613-614.

16- Ravasan civilian adviser, Mohammad Ishaq, al-esteem Javadian, Rasi, M. Mohebali, Zabihullah the eternal Mulla ..Zarei, Fatemeh Hon. Detection and identification of Leishmania species isolated from sandflies using a three-position three loci of kDNA،ribosomal(rDNA)، and cysteine protease B(CPB) 2008،11, Number 1, 2: 81

17- Maraghi S, Samarbaf Zadeh A, Sarlak AA, Ghasemian M, Vazirianzadeh B. Identification of Cutaneous Leishmaniasis Agents by Nested Polymerase Chain Reaction (Nested-PCR) in Shush City, Khuzestan Province, Iran. Iranian J Parasitol:.2,(3): 2007:13-15.

18-Parvizi, P., Ready, P.D. (2008).  Nested PCRs of nuclear ITS-rDNA fragments detect three Leishmania species of gerbils in sanflies from Iranian Foci of zoonotic cutaneous leishmaniasis. Tropical Medicine and International Health Journal, 13, 1159-1171.

19.Veland N, Espinosa D, Valencia BM, Ramos AP, Calderon F, Arevalo J, et al. Polymerase chain reaction detection of LeishmaniakDNA from the urine of Peruvian patients with cutaneous and mucocutaneousleishmaniasis. Am J Trop Med Hyg. 2011;84:556-61.

20. Barrio A, Mora MC, Ramos F, Moreno S, Samson R, Basombrío MA. Short report: use ofkDNA-based polymerase chain reaction as a sensitive and differentially diagnostic method of American tegumentaryleishmaniasis in disease-endemic areas of northern Argentina. Am J Trop Med Hyg. 2007;77:636-9.

21. D J. Markell and Voges Medical Parasitology. St Louis: Sanders. 2006.

22. Azani S, Rasi Y, Oshaghi M, Ershadi M, Mohebali M, Abaei M. Diagnosis and characterization of leishmania species in patients and rodents giemsa-stained slides by PCR-RFLP in damghan district, iran. Scientific Journal of Hamadan University of Medical Sciences and Health Services Winter. 2011;17(4):5-9.

23. Tanabe K SN, Kaneko O, Saito-Ito A, Kimura M. A PCR method for molecular epidemiology of Plasmodium falciparum Msp-1. The Tokai journal of experimental and clinical medicine 1998;23(6):375-81.

اینجانب دکتر فرزانه گرگانی مبادرت به انجام مطالعه ایی در زمینه ارزیابی روش مولکولی در تشخیص لیشمانیوز جلدی و شناسایی گونه های لیشمانیا  در شهرستانهای میرجاوه و ریگ ملک نموده ام.

ندارد

این مطالعه کمک بزرگی به تشخیص وتعیین گونه انگل لیشمانیا می کند.

در این روش تشخیصی هیچ گونه عوارض جانبی شما را تهدید نمی کند و تا حد امکان احتمال هر نوع عارضه ایی کاهش یافته است

در صورت بروز هر نوع مشکل که در ارتباط با روند پژوهش باشد، جبران کلیه خسارات احتمالی بر عهده مجریان طرح می باشد .

هر گونه هزینه تحقیق و درمانی این طرح تحقیقاتی بر عهده مجریان طرح می باشد و هیچ هزینه ای متوجه شما نخواهد شد

ندارد

نتایج آزمایشها و روشهای به کار رفته به اطلاع بیمار خواهد رسید و این نتایج بصورت کاملاً محرمانه و صرفاً جهت مقاصد پژوهش به کار خواهد رفت و هویت بیماری وی در چارچوب قانون و جامعه و خانواده محرمانه خواهد ماند

1. مرکز تحقیقات عفونی و گرمسیری

2- میدان مشاهیر -طبقه اول- بخش انگل شناسی

05412417478

شرکت من در مطالعه کاملاً اختیاری است و آزاد خواهم بود که از شرکت در مطالعه امتناع نموده یا هر زمان  که مایل بودم بدون آنکه تغییری در نحوه رفتار پزشک درمانگر یا نحوه درمان و مراقبت از بیماری اینجانب ایجاد شود از پژوهش مذکور خارج شوم.

با توجه به اطلاعات موجود در این فرم و توضیحات حضوری مجری یا همکاران طرح موافقت خود را با شرکت در این مطالعه اعلان می نمایم. یک نسخه از این فرم به من داده شده و فرصت خواندن آن را داشته ام.