بررسی پلی مورفیسم rs699 ژن آنژیوتنسینوژن٬ rs4341و rs4646994 ژن مبدل آنژیوتنسین و rs5186 رسپتور آنژیوتنسین نوع ۱ در بیماران مبتلا به سل ریوی در مقایسه با افراد سالم

سل کماکان یکی از مهم ترین علل مرگ و میر در دنیا است. میزان بروز این بیماری در طی دو دهه اخیر در کشورهای پیشرفته افزایش یافته و در کشورهای در حال توسعه نیز همچنان شیوع بالایی دارد. در سراسر جهان حدود دو بیلیون نفر با باسیل سل آلوده هستند.(1) در حال حاضر بیش از 20 میلیون نفر در جهان مبتلا به بیماری سل هستند که بیش از 80  درصد آن در 22 کشور در حال توسعه است(2).میزان بروز سل درایران حدود 4/13در 100000 نفر جمعیت در سال 1387 بر آورد شده که بیشترین میزان بروز آن  مربوط به استان سیستان و بلوچستان بوده که در طی سال های اخیر بین 40 تا 70 در صد هزار جمعیت برآورد شده است.(3)

بیماری سل عوارض بسیاری دارد و در صورت عدم درمان در بیش از نیمی از موارد در مدت پنج سال به مرگ بیمار منتهی می شود(4). میزان بروز سل ریوی با اسمیر خلط مثبت در کل کشور 618 نفر به اذای هر صدهزار نفر جمعیت می باشد(5) و در بین افراد آلوده به مایکوباکتریوم توبرکلوزیس، بروز بیماری بالینی بسیار کمتر از شیوع عفونت است و عموماً در 90 درصد افراد آلوده هرگز بیماری سل ایجاد نمی شود و از 10 درصد باقیمانده نیمی از آنها طی 2 سال به سمت بیماری سل پیشرفت می کند(6).

 این بیماری توسط باکتری میله ای شکل مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ایجاد می شود. این باسیل اغلب در رنگ آمیزی گرم خنثی می مانند ،اما زمانی که رنگ بگیرند نمی توان آنها را با اسید الکل بی رنگ کرد و به همین سبب آنها را باسیل اسید فست می نامند (5) . بیماری سل به دو شکل ریوی و خارج ریوی تظاهر می نماید که سل ریوی 85%  موارد و سل خارج ریوی 15% موارد آنرا تشکیل می دهد.

مطالعات اپیدمیولوژیک بیانگر این است که ترکیب ژنتیکی بعضی گروه های نژادی ممکن است زمینه ی مساعد ابتلا به عفونت و پیشرفت به سمت بیماری سال را فراهم کند. مدارک اخیر از نقش فاکتورهای ژنتیکی متعدد میزبان، در استعداد ابتلا به بیماری سل حمایت می کنند تخمین زده می شود که فقط 10 درصد افراد آلوده به باکتری که HIV منفی هستند در طول عمرشان به بیماری بالینی مبتلا می شوند؛ بنا بر این عده ای از اشخاص استعداد بیشتری برای ابتلا دارند که احتمالاً نتیجه ی تعامل بین عوامل متعدد میزبان و محیط می باشد(6و5).

مشاهدات متعددی مطرح کننده ی این موضوع هستند که فاکتورهای ژنتیکی نقش کلیدی در مقاومت ذاتی به عفونت و ایجاد بیماری با مایکوباکتریوم توبرکلوزیس دارند. وجود این مقاومت که طبیعت پلی ژنتیک دارد به وسیله ی درجات متفاوت حساسیت به مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در جمعیت های مختلف مطرح شده است.

ACE  یک آنزیم Dipeptidyl carboxypeptidase ا زگروه کینازها ست. این آنزیم یکی از عوامل طبیعی در جدار اندوتلیوم عروق می باشد و غلظت طبیعی این آنزیم در افراد طبیعی به جنسیت ارتباط نداشته و در افراد بالغ در سنین مختلف تغییری ندارد تنها در زیر ۲۰ سال میزان آن بیشتر است .

در بدن ابتدا پیش ساز هورمون یعنی آنژیوتانسینوژن توسط کبد ساخته، در خون آزاد می‌شود. پروتئین آنژیوتانسینوژن توسط هورمون رنین به آنژیوتانسین یک تبدیل می‌شود و آنژیوتانسین یک توسط آنزیم مبدل آنژیوتانسین (ACE) که بیشتر در مویرگهای ریه یافت می‌شود به آنژیوتانسین دو تبدیل می‌شود. این آنزیم از بخش کوچکی از انتهای C آنژیوتانسین یک (دواسید آمینه لوسین-هیستیدین) را حذف می‌کند (7).البته این آنزیم در سایر نقاط نیز یافت می‌شود ولی محل تجمع اصلی آن آندوتلیوم مویرگهای ریه‌است.
مقدار ACE در سرم در واقع نموداری از شدت ضایعات گرانولومایی بدن بوده و بدین لحاظ با شدت بیماری ارتباط مستقیم دارد،به طوری که در دوره پیشرفت بیماری و در صورت موفقیت درمان مقدار ان نشان دهنده عود بیماری است (8).

تا به حال مطالعات بسیاری در سراسر جهان و ایران به بررسی ارتباط بین سطح سرمی ACE و بیماری های مختلف پرداخته است.

Bonfim-Silva و همکارانش در سال 2016 در طی یک مطالعه مورد-شاهدی به بررسی پلی مورفیسم در ژن ACE و بیماری های قلبی-عروقی و هایپرتانسیون سیستمیک در جمعیت آفریقایی-برزیلی پرداختند و نتایج نشان داد که پلی مورفیسم AGT و M235T با افزایش ریسک ابتلا به هایپرتانسیون مرتبط بوده است اما با ابتلا به بیماری های قلبی-عروقی ارتباطی نداشته است و در نهایت اعلام کردند که پلی مورفیسم ACE I/D با بیماری های قلبی-عروقی و همچنین هایپرتانسیون هیچ ارتباطی نداشته است (9).

در پژوهشی دیگر، Mlak  و دیگران در سال 2016 تاثیر پلی مورفیسم I/D ژن ACE را بر خطر پیشرفت و دوره بیماری مزمن انسدادی ریه مورد بررسی قرار دادند و در پایان نتایج آنها نشان داد که ACE با یک ژن مستعدکننده برای ابتلا به COPD نمی باشد اما یک ژن تغییردهنده ی بیماری می باشد. از آنجایی که تاثیر پلی مورفیسم I/D ژن ACE بر خطر ابتلا به COPD متوسط یا ناچیز میباشد و بررسی تغییرات مولکولی که ممکن است به پیش بینی پیشرفت بیماری کمک کنند را توصیه کردند (10).

Pringle و همکارانش هم (2016) در مطالعه شان پلی مورفیسم ژن سیستم رنین-آنژیوتانسین را در کانسر اندومتریال مورد بررسی قرار دادند و در نهایت اعلام کردند که شیوع دو SNP که منجر به افزایش فعالیت سیستم RAS میگردد در بیماران زن مبتلا به کانسر اندومتریال در مقایسه با گروه شاهد کنترل متفاوت بوده است(11).

در طی پژوهشی اخیرا توسط Zhang و همکارانش در چین، ارتباط بین پلی مورفیسم ACE I/D و سل ریوی را در جمعیت چینی مورد بررسی قرار دادند و پس از بررسی 186 بیمار مبتلا به سل ریوی و 398 شاهد سالم نشان دادند که پلی مورفیسم ژن Ace I/D با استعداد ابتلا به سل ریوی مرتبط نبوده است (12).

Yilmaz و دیگران (2012) هم پلی مورفیسم I/D ژن ACE و خطر پیشرفت سارکوئیدوز را در بیماران مورد بررسی قرار دادند و نتایجشان نشان داد که اگرچه فراوانی آلل D  در مبتلایان به سارکوئیدوز در مقایسه با گروه شاهد بالاتر بوده است اما تفاوت معنادار نبوده است و در نهایت یافته هایشان نشان داد که بین پلی مورفیسم ژن ACE و استعداد پیشرفت بیماری سارکوئیدوز ارتباطی وجود ندارد (13).

با توجه به شیوع بالای سل ریوی و اینکه این بیماری هنوز هم در کشورهای در حال توسعه از جمله ایران و به ویژه در استان سیستان و بلوچستان بحران بهداشتی است و عوارض ابتلا به آن بسیار گسترده است، بر آن شدیم تا به بررسی پلی مورفیسم ژن ACE به عنوان یکی از شایع ترین آنزیم های موجود در مویرگ های ریوی و ارتباط آن با بیماری سل در بیماران مبتلا به سل ریوی مراجعه کننده به بیمارستان بوعلی شهر زاهدان در سال 1396 بپردازیم.

1. فراوانی پلی مورفیسم ژن rs699‌ژن آنژیوتنسینوژن در بیماران مبتلا به سل ریوی و  افراد سالم متفاوت است
2. فراوانی پلی مورفیسم rs4341  ژن مبدلآنژیوتنسین در بیماران مبتلا به سل ریوی و  افراد سالم متفاوت است
3. فراوانی پلی مورفیسم rs4646994 ژن مبدلآنژیوتنسین در بیماران مبتلا به سل ریوی و  افراد سالم متفاوت است
4. فراوانی پلی مورفیسم rs5186 ژن رسپتور آنژیوتنسین نوع ۱ در بیماران مبتلا به سل ریوی و  افراد سالم متفاوت است

تعیین و مقایسه پلی مورفیسم  rs699 ژن  آنژیوتنسینوژن٬ rs4341و rs4646994 ژن مبدل آنژیوتنسین و rs5186 رسپتور آنژیوتنسین  نوع ۱ در بیماران مبتلا به سل ریوی در مقایسه با افراد سالم

۱-مقایسه فراوانی پلی مورفیسم ژن rs699‌ژن آنژیوتنسینوژن در بیماران مبتلا به سل ریوی با افراد سالم

۲- مقایسه فراوانی پلی مورفیسم rs4341  ژن مبدلآنژیوتنسین در بیماران مبتلا به سل ریوی با افراد سالم

۳- مقایسه فراوانی پلی مورفیسم rs4646994 ژن مبدلآنژیوتنسین در بیماران مبتلا به سل ریوی با افراد سالم

۴- مقایسه فراوانی پلی مورفیسم rs5186 ژن رسپتور آنژیوتنسین نوع ۱ در بیماران مبتلا به سل ریوی با افراد سالم

دانشگاه علوم پزشکی زاهدان، مرکز تحقیقات دانشکده علوم پزشکی، بیمارستان آموزشی درمانی امام علی زاهدان-بخش تحقیقات سلولی-مولکولی ، سایر مراکز تحقیقاتی

مورد-شاهدی

بیماران مبتلا به سل ریوی تایید شده به عنوان گروه بیمار مراجعه کننده به بیمارستان عفونی بوعلی شهر زاهدان و گروه شاهد از افراد سالم جامعه

• معیارهای ورود به مطالعه :داشتن  سل ریوی تایید شده
• معیارهای خروج از مطالعه :  داشتن بیماری زمینه ای دیگر

150بیمار  مبتلا به سل ریوی و150 نفر از افراد سالم جامعه

آسان و در دسترس (Convenient Sampling)

فرم جمع آوری اطلاعاتی طرح شامل بررسی های آزمایشگاهی و ژنتیکی می باشد.

این مطالعه از نوع مورد-شاهدی می باشد.کلیه بیمارانی که با تشخیص سل ریوی شناخته شده اند و معیارهای خروج از مطالعه را نداشته باشند وارد این مطالعه می شوند. جهت بررسی مقایسه ای به تعداد نمونه گروه مورد گروه شاهد نیز انتخاب می شوند. .گروه شاهد از افراد سالم جامعه با در نظر گرفتن نداشتن مشکلات جسمانی و ایمونولوژی انتخاب شده و پس از همسان سازی گروه شاهدو بیماران از نظر سن ،جنس و قومیت شرکت کنندگان وارد مطالعه میشوند.

پس از ورود افراد به مطالعه و کسب رضایت آگاهانه از هر نفر به میزان 5 سی سی خون در لوله های حاوی EDTA جمع آوری می شود و در فریزر 20- درجه سانتیگراد نگهداری می شود. DNA نمونه خون این افراد به روش salting out تخلیص می‌شود، سپس با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ، ابتدا قطعه مورد نظر توسط تکنیک  PCR تکثیر و توسط آنزیم محدود الاثر برش داده می شود . سپس قطعات برش داده شده توسط  ژل آگارز 2% با رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید جدا گردیده  و ژنوتیپ افراد تعیین می گردد.در نهایت کلیه اطلاعات و داده ها وارد نرم افزار آماری SPSS می شوند و برای تحلیل از تست های آماری مناسب استفاده خواهد شد.

نتایج با استفاده از آزمون های توصیفی شامل فراوانی درصد و جداول و نمودارها توصیف شده و  با استفاده از نرم افزار spss ver20 و تست های آماری کای دو ، logistic regression  و آزمون دقیق فیشر تحلیل می شوند

کدهای 1، 2، 3، 8، 10، 11، 13، 15، 18، 25، 28، مصوب کمیته کشوری اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی که در دفترچه راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش‌های دارای آزمودنی انسانی در جمهوری اسلامی ایران، دربردارنده‌ی اصول و مقررات اخلاقی‎ مطرح  و در سال 1392 در 31 بند تصویب شده است و همچنین کدهای 1، 2، 3، 4، 7 مربوط به دفترچه راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی در جمهوری اسلامی ایران از قسمت راهنمای عمومی در این طرح رعایت می شود. تمامی بیماران تحت مطالعه آگاهانه و برای مقاصد علمی  اقدام به دادن نمونه خواهند کرد. شرکت در این طرح هیچ گونه هزینه ای برای بیماران ندارد و نام و مشخصات بیماران گزارش نخواهد شد

عدم همکاری بیماران - مشکلات مربوط به تهیه مواد اولیه و تجهیزات آزمایشگاهی مورد نیاز

پلی مورفیسم، آنژیوتنسینوژن٬ مبدل آنژیوتنسین٬ رسپتور انژیوتنسین٬ سل ریوی

• مراجع مورد استفاده براساس رفرانس نویسی ونکوورتنظیم گردد.

1. Fitzgerald DW, Sterling TR, Haas DW. Mycobacterium tuberculosis. In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R, editors. Principle and practice of infectious diseases. 8th ed.  Churchill Livingstone, New York  2015: 2787-2818.
2. Hassanein   KH , Hosny H, Mohamed R,et al. ROLE OF ADENOSINE DEAMINASE (ADA) IN THE DIAGNOSIS OF PULMONARY TUBERCULOSIS. Egyptian Journal of Bronchology 2010; 4( 1):11-18
3. Kamholz SL. Drug resistant tuberculosis. Assoc Acad Minor Phys 2002; 13 (2): 53- 6.
4. Raviglione MC, OBrien R J . Tuberclosis. Braunwald E‚Hauser SL‚Longo DI‚Kasper DI‚Fauci AS.Harrison῾s Principles of  Internal Medicine. 17 th Edision. United States of America;Mc Graw Hill; 2008:1006-15
5. Haoues M et al. Forkhead box O3 (FOXO3) transcription factor mediates apoptosis in BCG-infected macrophages, cellular microbiology. 2014; 16(9) : 1378-1390
6. Khazaei HA et al. epidemiology of tuberculosis in the southeastern Iran. Zabol university of medical sciences, Iran, Epidemiology, 2005; 20(10): 879-83.
7. Skeggs LT, Jr., Kahn JR, Shumway NP. The preparation and function of the hypertensin-converting enzyme. J Exp Med. 1956;103(3):295-9.
8. Hemming ML, Selkoe DJ. Amyloid beta-protein is degraded by cellular angiotensin-converting enzyme (ACE) and elevated by an ACE inhibitor. J Biol Chem. 2005;280(45):37644-50.
9. Bonfim-Silva R, Guimaraes LO, Souza Santos J, Pereira JF, Leal Barbosa AA, Souza Rios DL. Case-control association study of polymorphisms in the angiotensinogen and angiotensin-converting enzyme genes and coronary artery disease and systemic artery hypertension in African-Brazilians and Caucasian-Brazilians. J Genet. 2016;95(1):63-9.
10. Mlak R, Homa-Mlak I, Powrozek T, Mackiewicz B, Michnar M, Krawczyk P, et al. Impact of I/D polymorphism of ACE gene on risk of development and course of chronic obstructive pulmonary disease. Arch Med Sci. 2016;12(2):279-87.
11. Pringle KG, Delforce SJ, Wang Y, Ashton KA, Proietto A, Otton G, et al. Renin-angiotensin system gene polymorphisms and endometrial cancer. Endocr Connect. 2016;5(3):128-35.
12. Zhang Y, Li X, Wu Z, Fan H. Association between ACE I/D polymorphism and pulmonary tuberculosis in Chinese population. Mol Biol Rep. 2014;41(5):3187-9.
13. Yilmaz D, Karkucak M, Coskun F, Yakut T, Kunt Uzaslan E. ACE gene I/D polymorphism and risk of sarcoidosis development in Turkish patients. Tuberk Toraks. 2012;60(3):201-6.

طی این طرح پژوهشی رابطه بین اختلافات ژنتیکی و استعداد ابتلا به بیماری سل ریوی بررسی میشود.

نمونه گیری وتخلیص DNA  از خون تام و انجام PCR

این تحقیق اگر چه فایده فوری نخواهد داشت اما بعلت بررسی استعداد ابتلا به بیماری سل ریوی برای سایر افراد جامعه مفید خواهد بود.

در این طرح بغیر از خونگیری که توسط پرسنل مجرب صورت میگیرد،نمونه ای از بیمار گرفته نمیشود.تنها عارضه جانبی ممکن در زمان خونگیری خواهد بود که با توجه به خبره بودن پرسنل،بعید بنظر میرسد.

جبران عوارض احتمالی بر عهده پژوهشگران خواهد بود.

کلیه هزینه های تشخیصی به عهده مجریان طرح خواهد بود و بیمار هزینه ای را پرداخت نخواهد کرد.

در این قسمت باید شرح داده شود که در صورت عدم پذیرش روش انتخابی پژوهشگر، بیمار از چه روشهای درمانی یا تشخیصی دیگرتوسط پژوهشگر می تواند استفاده نماید.

نتایج آزمایشها و روشهای به کار رفته به اطلاع بیمار خواهد رسید و این نتایج بصورت کاملاً محرمانه و صرفاً جهت مقاصد پژوهش به کار خواهد رفت و هویت بیماری وی در چارچوب قانون و جامعه و خانواده محرمانه خواهد ماند

دکتر محمد نادری

بیمارستان بوعلی

شرکت من در مطالعه کاملاً اختیاری است و آزاد خواهم بود که از شرکت در مطالعه امتناع نموده یا هر زمان  که مایل بودم بدون آنکه تغییری در نحوه رفتار پزشک درمانگر یا نحوه درمان و مراقبت از بیماری اینجانب ایجاد شود از پژوهش مذکور خارج شوم.

با توجه به اطلاعات موجود در این فرم و توضیحات حضوری مجری یا همکاران طرح موافقت خود را با شرکت در این مطالعه اعلان می نمایم. یک نسخه از این فرم به من داده شده و فرصت خواندن آن را داشته ام.