بررسی آلودگی و تعیین گونه های پلاسمودیوم به روش Nested- PCR در پشه های آنوفل صید شده از روستاهای شاهد شهرستان های چابهار و کنارک استان سیستان و بلوچستان،ایران در6 ماهه دوم سال 1396

انگل مالاریا متعلق به سلسله: Eukaryota،   کینگدام:Archezoa،      شاخه:Apicomplexa، رده:Haematozea، راسته:Haemosporida، زیرراسته:Haemosporina خانواده:Plasmodiidae، جنس:Plasmodium میباشد.در این زیر راسته تمامی گونه ها در بیشتر دوره زندگی ،انگل درون سلولی اجباری بوده ودارای دو میزبان می باشند. میزبان مهره دار که در آن تولید مثل غیر جنسی انگل صورت می گیرد را میزبان واسط گویندومیزبان غیر مهره دار یا حشره خونخوار را میزبان قطعی گویند.ویژگی بارز شاخه اپی کمپلکسا حضورکمپلکس راسی است که در مراحل خاصی از زندگی آنها تظاهر یافته وشامل میکرونم،حلقه های قطبی،راپتری وکونوئید  است.انگل مالاریادارای156 گونه آلوده کننده در پستانداران،پرندگان وخزندگان است .عوامل ایجاد کننده مالاریای انسانی شامل پنج گونه(پلاسمودیوم فالسی پاروم ،پلاسمودیوم ما لاریه ،پلاسمودیوم اووال،پلاسمودیوم ویواکس،پلاسمودیوم ناولزی)است. (1)         تظاهرات این بیماری به صورت عفونت حاد و در بیشتر مواقع وخیم و گاها با دوره طولانی همراه با تب متناوب  به همراه حمله های روده ای ،آنمی و بزرگی طحال بروز مینماید. به علت آنمی و بروز عود های مکرر اتلاف نیروی کار ایجاد شده و این امر در وضعیت اقتصادی و کشاورزی و فعالیت های بدنی تاثیر گذار میباشد. در حال حاضر بیشتر از 90 کشور در دنیا جزء کشور های مالاریا خیز محسوب شده که حدود نیمی از آنها کشورهای آفریقایی میباشند که به علت فقر فرهنگی و اقتصادی در این مناطق شدت و حجم بروز بیماری افزایش میابد.با وجود بهبود وضعیت اقتصادی و اجتماعی در کشور های درگیر در سالهای اخیر و اجراء برنامه های مبارزاتی علیه بیماری از تعداد این کشور های در معرض خطر کاسته شده ولی تعداد موارد بروز بیماری و مرگ و میر ناشی از آن متاسفانه هنوز به حدی است که میبایست آن را به عنوان یک معضل و مشکل بهداشتی مورد توجه قرار داد .(2)

مالاریا یکی از شایعترین بیماریهای عفونی در مناطق گرمسیر جهان است وبه دلیل اهمیت آن از نظر بهداشتی ودرمانی به عنوان یکی از شش بیماری مهم پژوهشی سازمان بهداشت جهانی تحت عنوان Tropical disease researchمطرح میباشد.

در بیش از 107 کشور جهان این بیماری اندمیک می باشد .هرسال 207 میلیون نفر با ظهور علائم بالینی مالاریا به این بیماری مبتلا میگردند گفته میشود در هر ثانیه 10 مورد مالاریا در کشورهای در حال توسعه جهان پدیدار می شود.(3, 4)سالیانه 627 هزار میلیون مرگ از مالاریا اتفاق می افتد که 90 % آن کودکان آفریقایی هستند هر روز 3000 نفر از مالاریا می میرند ومالاریا به تنهایی سبب بیش از 70% مرگ ومیر کودکان در جهان سوم میباشد. (3, 4)پلاسمودیوم فالسی پاروم وپلاسمودیوم ویواکس مهمترین انگل های ایجاد کننده مالاریا در انسان محسوب میشوند.(5) پلاسمودیوم ویواکس حدود 80 میلیون مورد مالاریا را در جهان ایجاد میکند .(6)این بیماری از دیر باز در کشور ما شیوع داشته وهمواره برنامه های کنترل مالاریا مطرح بوده است بر طبق آمارمرکز مدیریت بیماریهای وزارت کشور از سال 2008 تا کنون تعداد موارد مالاریا در ایران کاهش داشته است .اکثر موارد ابتلا مربوط به 3 استان جنوبی کشور شامل سیستان وبلوچستان،هرمزگان وجنوب کرمان بوده است .موارد ابتلا در سال 2014 در استان سیستان وبلوچستان 521مورد گزارش گردیدکه87.7%پلاسمودیوم ویواکس 10.94%پلاسمودیوم فالسی پاروم و1.36%مربوط به موارد میکس ویواکس وفالسی پاروم میباشد.(7)اگر چه بیماری ناشی از پلاسمودیوم ویواکس در مقایسه با فالسی پاروم میزان مرگ ومیر کمتری دارد اما دارای اثرات اقتصادی واجتماعی زیادی دارد.(5) عفونت پلاسمودیوم ویواکس با توجه به عودهای مکرر ووجود گزارش های اخیر مبنی بر  نقش ویواکس در ایجاد علائم مالاریای سخت وفقدان داروی مناسب برای گونه های مقاوم مشکلات موجود را بارزتر ونمایان تر میکند. (2, 8, 9)با توجه به اهمیت بیماری مالاریا تشخیص سریع ودقیق موارد مالاریا در کمتر از 48 ساعت ضروری میباشد.در ایران آزمون استاندارد جهت تشخیص انگل در نمونه های خونی همانند سایر کشورهاتشخیص میکروسکوپی انگل در گسترش خونی رنگ آمیزی شده با گیمسا می باشد.از مزایای این روش در صورتی که توسط تکنسین مجرب وآموزش دیده شود تمایز مراحل تکاملی انگل ،تعیین تعداد انگل میباشد از سایر محاسن این روش راحت بودن وعدم نیاز به تجهیزات گران قیمت میباشد. از معایب این روش  میتوان به حساسیت نسبتا کم آن (توانایی تشخیص 5-10 انگل در هر میکرولیتر خون)که تحت تاثیر عواملی چون مهارت تکنسین وکیفیت موادمیباشد اشاره کرد.(10, 11) با توجه به گزارشاتی مبنی بر میزان بالای اشتباه در تشخیص میکروسکوپی مالاریا در ایران  در سالهای اخیر بخصوص در موارد میکس پلاسمودیوم فالسی پاروم وویواکس که نیاز به درمان رادیکال برای ویواکس دارد میتوان برای تشخیص مالاریااز شناسایی DNA انگل در نمونه خون بیمار با تکنیکهای متنوع  PCR استفاده کرد. (12-14)میزان آلودگی به اسپروزوئیت در آنوفل ها که نقش هر کدام از گونه ها در انتقال بیماری را مشخص می کند یکی از شاخص های مهم اپیدمیولوژیک است که برای برنامه ریزی روش های کنترلی و پیشگیری مالاریا متناسب با شرایط محلی ضروری است. یکی از روش های مرسوم و متداول تعیین آلودگی در پشه های آنوفل به انگل مالاریا تشریح غدد بزاقی آنوفل های ماده صید شده با اسنفاده از استرئومیکروسکوپ و میکروسکوپ نوری می باشد به هرحال روش مذکور بسیار پرزحمت ،وقت گیر و از حساسیت پایینی برخوردار است.مشخص شده که سطح انگل در ناقلین مالاریا حتی در مناطقی که مالاریا به صورت  آندمیک وجود دارد بسیار پایین است واز طرف دیگر با میکروسکوپ نوری نمی توان انگل را در نمونه های کمتر از 500 اسپروزوئیت مشخص کرد.(15, 16) بعلاوه این روش با قاطعیت به تعیین انگل های موجود در پشه  بپردازد.(17)

روش الیزا (ELISA)که اساس آن تشخیص پروتئین های سطحی اسپروزوئیت (CS)در پشه های آلوده  با استفاده از آنتی بادی های مونوکلونال می باشدتوسط Wirtz و همکاران (1987) شرح داده شد.(17) در این روش نیز مقدار انگل باید به اندازه کافی زیاد باشد به نحوی که  نتایج وقتی قابل اعتماد است که بیش از 1000 اسپروزوئیت در غدد بزاقی وجود داشته باشد.علاوه بر در این روش موارد مثبت کاذب در صورتیکه پشه ها از خون گاو و خوک تغذیه کرده باشند گزارش شده است.(18) بیشترین نقطه ضعف این روش وجود آنتی ژن در سینه پشه حتی بدون وجود انگل می باشد.(19) مناسب ترین جایگزین برای روش های میکروسکوپی و الیزا استفاده از روش های  وابسته به DNA است. با استفاده از روش PCR امکان سنتز خارج سلولی میلیون ها کپی از سکانس DNA هدف وجود دارد.(20) روش PCR دارای حساسیت بسیار بالا و کاملا اختصاصی است و نه تنها گونه انگل را بلکه تنوع ژنتیکی بین و یا داخل جمعیت ها را می تواند مشخص نماید.(15)

مناطق خاصی از ژن های ریبوزومال (rDNA) به نام ssrDNA در گونه های مختلف انگل مالاریا دارای توالی های اختصاص به گونه می باشند که از این مناطق برای طراحی پرایمرهای مخصوص تکنیک Nested-PCR استفاده خواهد شد.درمرحله اول PCR   پرایمرهای  rPLU5 و rPLU6  و در مرحله ی دوم پرایمرهای rFAL1 , و rFAL2  برای تشخیص گونه پلاسمودیوم فالسی پاروم و rVIV1 و rVIV2 برای تشخیص گونه ی پلاسمودیوم ویواکس استفاده خواهند شد.این پرایمرها ابتدا جهت تشخیص انگل در خون طراحی و استفاده شدند و بعد برای تشخیص آلودگی در پشه ها نیز با موفقیت مورد استفاده قرار گرفت.  (15, 18, 19, 21)این مطالعه با هدف اصلی بررسی میزان و نوع آلودگی پشه های آنوفل ماده به اسپروزوئیت انگل مالاریا با استفاده از روش مولکولی Nested PCR در جنوب استان سیتان و بلوچستان انجام خواهد شد. با توجه به اینکه استان سیستان و بلوچستان در مرحله حذف مالاریا قرار دارد با توجه به اینکه استان سیستان و بلوچستان در مرحله حذف مالاریا قرار دارد بهترین و موثرترین روش جهت پایش برنامه حذف مالاریا،پایش آلودگی در پشه آنوفل ماده  می باشد.

1- در سال 1993، Snounou و همکاران در تایلند ،از روش Nested PCR استفاده کردند و براساس آن توانستند 4 گونه انسانی انگل مالاریا را در سطح گونه شناسایی کنند.(22)

2- مطالعه ایی که  توسط آسمار و همکاران در سال 1998، تحت  عنوان  تعیین گونه های پلاسمودیوم در مناطق مالاریا خیز به روش   nested PCR انجام شد . در این مطالعه، 333 نمونه خون از موارد ابتلا به مالاریا با استفاده از آزمون میکروسکوپی  مثبت  شده بودند ، مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد 244 مورد (73.27٪) به عنوان پلاسمودیوم ویواکس تشخیص داده شد، 87 نفر (26.13٪) پلاسمودیوم فالسیپاروم و 2 مورد (0.6٪) عفونت مخلوط از هر دو  پلاسمودیوم  تشخیص داده شده بود.(23)

3- در مطالعه  دکتر عشاقی و همکاران در سال 2003   ، با عنوان  تشخیص گونه های انگل مالاریا به روش nested PCR در پشه های ناقل و خون های آلوده منطقه چابهار و ایرانشهر انجام شده است که نتایج این مطالعه نشان می دهد که گونه غالب انگل مالاریا ،گونه پلاسمودیوم ویواکس است . با این حال بخشی از نمونه های خون آلوده ، دارای آلودگی توام با پلاسمودیوم ویواکس و فالسیپاروم بودند .(24)

4- ذاکری و همکاران در سال 2002 به جهت بررسی تشخیص عفونت مالاریا به روش nested-PCR در جنوب شرقی ایران  به مطالعه پرداختند که در این مطالعه 120 نمونه  با هدف قرار دادن  ژن ssr RNA مورد بررسی مولکولی قرار گرفتند، که نتایج شامل   58% پلاسمودیوم ویواکس ،  10 % پلاسمودیوم فالسیپاروم و 32 % میکس پلاسمودیوم ویواکس و پلاسمودیم فالسیپاروم  تشخیص داده شد.(12)

5- در مطالعه دکتر آسمار و همکاران در سال 2005، با عنوان بررسی میزان آلودگی گونه های آنوفل استفنسی و آنوفل کولیسفاسیس به اسپروزوئیت مالاریا در کانون های آندمیک ایران به روش PCR  انجام شده است که نتایج این مطالعه نشان می دهد که گونه غالب انگل مالاریا،گونه پلاسمودیوم ویواکس است.و یک مورد از آنوفل های استفنسی جمع آوری شده دارای آلودگی توام با پلاسمودیوم ویواکس و فالسیپاروم بود.(25)

6- مطالعه ایی که توسط ابراهیمی و همکاران در سال 2006، با عنوان تشخیص گونه های پلاسمودیوم  انسانی به روش PCR-RFLP انجام شد. در این مطالعه، 46 نمونه خون از موارد ابتلا به مالاریا با استفاده از آزمون میکروسکوپی  مثبت  شده بودند ، مورد بررسی قرار گرفتند.35 مورد پلاسمودیوم ویواکس و11مورد پلاسمودیوم فالسی پاروم تشخیص داده شد، در حالیکه با روش مولکولی،2مورد از 11 مورد پلاسمودیوم فالسی پاروم به عنوان پلاسمودیوم ویواکس و 3 مورد از 35 مورد پلاسمودیوم ویواکس  به عنوان پلاسمودیوم فالسی پاروم مشخص شد.(26)

7- ابراهیم  زاده و همکاران در سال2007 ،گونه های مالاریا را  با روش مولکولی مورد مطالعه قرار دادند که در این تحقیق 140 نمونه مورد بررسی قرارگرفت که نتایج شامل  3/94  نمونه مثبت بود که نمونه های مثبت شامل،  4/51 درصد  پلاسمودیوم ویواکس،  6/12 پلاسمودیوم فالسیپاروم و 3/29 میکس پلاسمودیوم ویواکس و پلاسمودیم فالسیپاروم گزارش شده است.هم چنین  پلاسمودیوم مالاریه  نیز گزارش شد. (28)

8-در سال 2008، Indera Vythilingam وهمکاران با استفاده از روش Nested-PCR پلاسمودیوم ناولزی را در انسان ،میمون و پشه ها در شبه جزیره مالزی مورد مطالعه قرار دادند که نتایج نشان داد 77 نمونه (37%/69) از 111 نمونه انسانی و 10 نمونه (90%/6) از 145 نمونه خون میمون ها و 2 مورد (%7/1) از 339 پشه آلوده به پلاسمودیوم ناولزی بودند.(30)

9- ذاکری و همکاران  در سال 2010 ، به جهت بررسی تشخیص عفونت مالاریا با گونه های میکس پلاسمودیوم فالسیپاروم و پلاسمودیوم  ویواکس به روش nested-PCR در پاکستان ،ایران ، افغانستان به مطالعه پرداختند که در این بررسی 100 نمونه از ایران بود که با روش میکروسکوپی پلاسمودیوم ویواکس مثبت تشخیص داده شدند مورد بررسی مولکولی قرار گرفت و 22% نمونه ها میکس تشخیص داده شد.(31)

10-Indera Vythilingam و همکاران در سال 2006 ، انتقال طبیعی پلاسمودیوم ناولزی به انسان ها را به وسیله ی آنوفل های Latens  در ساراواک مالزی به روش          Nested-PCR مورد بررسی قرار دادند  که نتایج نشان داد گونه غالب آنوفل Latens  بوده است.(27)

11-Cheong H Tan و همکاران در سال 2008 ، مطاله ای با عنوان بوم شناسی آنوفل هایLatens  در Kapit ، ساراواک و جزیره بورنئو مالزی با استفاده از روش Nested-PCR  انجام  دادند  که نتایج نشان داد گونه غالب آنوفل Latens و تنها گونه آلوده به انگل می باشد. (29)

12-Emmanuel W و همکاران در سال 2017 ، مطالعه ای با عنوان  انجام مداخلات که به طور موثر با هدف قرار دادن پشه های آنوفل Funestus  به منظور کنترل بیماری مالاریا در جنوب شرق تانزانیا با استفاده از روش Multiplex PCR  انجام دادند، که نتایج نشان داد بالاترین میزان آلودگی به اسپروزوئیت انگل مالاریا مربوط به پشه های آنوفل Funestus می باشد و به طور انحصاری فقط از انسان خون خواری می کنند.(32)

13-John B و همکاران در سال 2017 ، مطالعه ای با عنوان انتخاب میزبان به وسیله ی ناقلین مالاریا در پاپوا گینه نو با استفاده از روش PCR  انجام دادند که نتایج نشان داد انتخاب میزبان در گونه های مختلف  پشه آنوفل به انسان دوست یا حیوان دوست بودن پشه بستگی دارد . که در این مطالعه پشه های آنوفل Koliensis به طور مداوم انسان را برای خون خواری انتخاب می کردند.(33)

1. توزیع فراوانی انگل مالاریا با استفاده ازتکنیکNested-PCR  در پشه های آنوفل ماده چقدر است؟
2. گونه غالب انگل مالاریا با استفاده ازتکنیکNested-PCR  در پشه های آنوفل ماده کدام است؟

بررسی آلودگی و تعیین گونه های پلاسمودیوم به روش Nested- PCR در پشه های آنوفل صید شده از روستاهای شاهد شهرستان های چابهار و کنارک  استان سیستان و بلوچستان،ایران در6 ماهه دوم سال 1396

1. بررسی توزیع فراوانی انگل مالاریا با استفاده ازتکنیکNested-PCR  در پشه های آنوفل ماده
2. تعیین گونه غالب انگل مالاریا با استفاده ازتکنیکNested-PCR  در پشه های آنوفل ماده

-استفاده از نتایج طرح در برنامه ریزی و کنترل بیماری مالاریا در استان سیستان و بلوچستان

-پلاسمودیوم ویواکس:

تک یاخته انگلی داخل سلولی از شاخه آپیکمپلکساوخانواده پلاسمودیده که قادر به ایجاد مالاریای سه –یک خوش خیم درانسان میباشد

2-پلاسمودیوم فالسیپاروم:تک یاخته انگلی داخل سلولی از شاخه آپیکمپلکسا وخانواده پلاسمودیده که قادر به ایجاد مالاریای سه –یک بدخیم در انسان میباشد

3-اسپوروزاییت:

فرم فعال وعفونت زای انگل برای انسان که از پشه به انسان منتقل میگردد.

4-مروزوئیت:

فرم حاصل از تکثیر غیر جنسی انگل در بدن میزبان واسط(انسان) که به دو فرم داخل گلوبولی و خارج گلبولی انجام میشود.

5-شیزوگونی:

تکثیر غیر جنسی انگل در بدن میزبان واسط که به دو شکل شیزوگونی خونی وشیزوگونی نسجی (کبدی) است

6-واکنش زنجیره پلی مراز (PCR) :

 در زیست شناسی ملکولی واکنش زنجیره پلی مراز روشی است برای تکثیر یک یا چند نسخه از یک قطعه ملکول DNA که موجب تولید میلیونها نسخه از یک توالی خاص DNA می گردد. این روش متکی بر چرخه حرارتی ، شامل چرخه هایی از اعمال حرارت و سردکردن واکنش برای ذوب و نسخه برداری آنزیمی ملکول DNA است.

7-واکنش زنجیره پلی مراز آشیانه ای  (Nested-PCR):

واکنش زنجیره پلی مراز آشیانه ای روش تغییر یافته ای از واکنش زنجیره پلی مراز است که برای کاهش آلودگی محصولات حاصله از تکثیر جایگاه های اتصال پرایمرغیر منتظره ابداع گردیده است. در این روش دو دسته پرایمر در دو مرحله متوالی واکنش زنجیره پلی مراز مورد استفاده قرارمی گیرد که دومین سری پرایمر جهت تکثیر یک هدف ثانویه در داخل اولین محصول بکار می رود.

8-روش میکروسکوپی در تشخیص مالاریا:

Gold standard  تشخیص مالاریا که لام تهیه شده ورنگ آمیزی شده به روش گیمسا از خون محیطی بیمار  توسط میکروسکوپ بررسی میشود.

9-رینگ:

فرم حاصل از رها شدن مروزوئیت کبدی در داخل خون که وارد گلبول قرمز شده به فرم گرد در میاید که دارای یک هسته ویک واکوئل غذایی است که توسط سیتوپلاسم احاطه شده است.

10-تروفوزوئیت:

فرم حاصل از رشد انگل در گلبول قرمزکه به3 فرم :تروفوزوئیت جوان،در حال رشدوپیر دیده میشود

توصیفی - مقطعی

پشه های انوفل جمع آوری شده از مناطق آندمیک مالاریا در شهرستان چابهار و کنارک در  استان سیستان و بلوچستان

صید پشه ها با استفاده از روش های صید دستی از اماکن داخلی ( انسانی و حیوانی ) و اماکن خارجی طبیعی و مصنوعی (شلترپیت) انجام می گردد.

سرشماری

جمع آوری پشه های آنوفل 

صید پشه ها با استفاده از روش های صید دستی از اماکن داخلی ( انسانی و حیوانی ) و اماکن خارجی طبیعی و مصنوعی (شلترپیت) انجام می گردد. (30)

مونته کردن نمونه ها: 

بلافاصله بعد از اتمام عملیات جمع آوری، با استفاده از 4 سوزن انسولین، لام و لامل، چراغ الکلی، محلول پوری و لوپ با بزرگنمای بالا، به تشریح نمونه ها اقدام می شود. ابتدا به کمک دو سوزن که روی چراغ الکلی استریل شده اند، یک پشه آنوفل را به زیر لوپ انتقال و سر و سه بند انتهایی بدن آنها در داخل یک قطره آب مقطر استریل جدا می گردد. با همان دو سوزن استریل قسمت میانی بدن پشه به داخل تیوب های 5/1 میلی لیتری انتقال و مشخصات نمونه روی تیوب درج می شود. به هر نمونه یک کد سه حرفی اختصاص داده می شود. سر و انتهای بدن پشه به کمک دو سوزن دیگر در داخل یک قطره پوری مونته می شود. قرار دادن لامل روی محلول پوری به ملایمت انجام می شود طوری که هیچ گونه حبابی ایجاد نگردد. نمونه داخل تیوب بایستی عاری از هر گونه آلودگی باشد حتی کمترین الکل باقیمانده نیز در مراحل بعدی مشکل ساز می گردد. بعد از اتمام کار در تیوب محکم و تا زمان استخراج DNA در یخچال C°20- قرار می گیرد.

- استخراج DNA :

 استخراج DNA از پشه با کیت استخراج DNA  شرکت تکاپوزیست بر اساس دستور العمل شرکت انجام می گیرد.

بعد ازاین مراحل ، پرایمر مخصوص تکنیک NestedPCR طراحی می شود.درمرحله اول PCR   پرایمرهای  rPLU5 و rPLU6  و در مرحله ی دوم پرایمرهای rFAL1 , و rFAL2  برای تشخیص گونه پلاسمودیوم فالسی پاروم و rVIV1 و rVIV2 برای تشخیص گونه ی پلاسمودیوم ویواکس استفاده خواهند شد.

تکنیک مولکولی Nested-PCRانجام ونتایج حاصل از تکنیک Nested-PCRبر روی ژل آگارز رنگ آمیزی شده با ژل رد مشاهده وبه صورت مثبت/منفی در فرم جمع آوری اطلاعات ثبت میشود.

ندارد

1-تهیه مواد و معرف آزمایش که از خارج ازکشور تهیه میشودبه دلیل عدم ساخت در داخل کشور راه حلی ندارد

2-یکی از خطاهای احتمالی، خطای فرد مشاهده گر در قرائت نتایج تستها می باشد . برای برآورد اثر آن ، محقق بر روی 30 نمونه از دو فرد مشاهده گر به طور مستقل استفاده می کند و هر کدام از این افراد نتایج را بدون اطلاع از یکدیگر ثبت می نمایند. در نهایت با محاصبه ضریب توافق کاپا ، میزان توافق دو مشاهده گر تعیین می گردد و در صورتی که ضریب توافق کاپا بالای 95٪ باشد ، خطای مشاهده گر قابل تحمل خواهد بود.

3-یکی دیگر از منابع خطا، خطای ابزار می باشد. فقط از دستگاههایی استفاده خواهد شد که قبلا توسط کارشناسان بخش کالیبره و استاندارد شده باشند(روایی آنها مورد تایید باشد). 

Nested-PCR, Malaria, Anopheles, Sistan and Baluchestan

1.         Cavalier-Smith T. Kingdom protozoa and its 18 phyla. Microbiological reviews. 1993;57(4):953-94.

2.         Gilles HM. Protozoal diseases: Arnold; 1999.

3.         Menendez C. Malaria during pregnancy: a priority area of malaria research and control. Parasitology today. 1995;11(5):178-83.

4.         Organization WH. WHO informal consultation on fever management in peripheral health care settings: a global review of evidence and practice. 2013.

5.         Kocken CH, Dubbeld MA, Van Der Wel A, Pronk JT, Waters AP, Langermans JA, et al. High-level expression of Plasmodium vivax apical membrane antigen 1 (AMA-1) in Pichia pastoris: strong immunogenicity in Macaca mulatta immunized with P. vivax AMA-1 and adjuvant SBAS2. Infection and immunity. 1999;67(1):43-9.

6.         Rodrigues MHC, Rodrigues KM, Oliveira TR, Cômodo AN, Rodrigues MM, Kocken CH, et al. Antibody response of naturally infected individuals to recombinant Plasmodium vivax apical membrane antigen-1. International journal for parasitology. 2005;35(2):185-92.

7.         Sargolzaie N, Salehi M, Kiani M, Sakeni M, Hasanzehi A. Malaria Epidemiology in Sistan and Balouchestan Province during April 2008-March 2011, Iran. مجله تحقیقات علوم پزشکی زاهدان. 2014;16(4):41-3.

8.         Santos-Ciminera PD, Maria das Graças CA, Roberts DR, Quinnan GV. Molecular epidemiology of Plasmodium vivax in the State of Amazonas, Brazil. Acta tropica. 2007;102(1):38-46.

9.         Rajesh V, Elamaran M, Vidya S, Gowrishankar M, Kochar D, Das A. Plasmodium vivax: genetic diversity of the apical membrane antigen-1 (AMA-1) in isolates from India. Experimental parasitology. 2007;116(3):252-6.

10.       Bruce-Chwatt LJ. Essential malariology: William Heinemann Medical Books Ltd; 1985.

11.       Organization WH. Tropical diseases, 1990. 1990.

12.       Zakeri S, Najafabadi ST, Zare A, Djadid ND. Detection of malaria parasites by nested PCR in south-eastern, Iran: evidence of highly mixed infections in Chahbahar district. Malaria journal. 2002;1(1):2.

13.       Zakeri S, Mamaghani S, Mehrizi A, Shahsavari Z, Raeisi A, Arshi S, et al. Molecular evidence of mixed P. vivax and P. falciparum infections in northern Islamic Republic of Iran. 2004.

14.       Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic acids research. 2000;28(12):e63-e.

15.       Arez A, Lopes D, Pinto J, Franco A, Snounou G, Do Rosário V. Plasmodium sp.: optimal protocols for PCR detection of low parasite numbers from mosquito (Anopheles sp.) samples. Experimental parasitology. 2000;94(4):269-72.

16.       Wilson M, Ofosu-Okyere A, Okoli A, McCall P, Snounou G. Direct comparison of microscopy and polymerase chain reaction for the detection of Plasmodium sporozoites in salivary glands of mosquitoes. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 1998;92(5):482-3.

17.       Lombardi S, Esposito F, Zavala F, Lamizana L, Rossi P, Sabatinelli G, et al. Detection and anatomical localization of Plasmodium falciparum circumsporozoite protein and sporozoites in the afrotropical malaria vector Anopheles gambiae sl. The American journal of tropical medicine and hygiene. 1987;37(3):491-4.

18.       Póvoa MM, Machado RL, Segura MN, Vianna GM, Vasconcelos AS, Conn JE. Infectivity of malaria vector mosquitoes: correlation of positivity between ELISA and PCR-ELISA tests. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 2000;94(1):106-7.

19.       Vythilingam I, Nitiavathy K, Yi P, Bakotee B, Hugo B, Singh B, et al. A highly sensitive, nested polymerase chain reaction based method using simple dna extraction to detect malaria sporozoites in mosquitos. 1999.

20.       Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 1988;239(4839):487.

21.       Perandin F, Manca N, Piccolo G, Calderaro A, Galati L, Ricci L, et al. Identification of Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale and P. malariae and detection of mixed infection in patients with imported malaria in Italy. The new microbiologica. 2003;26(1):91-100.

22.       Snounou G, Viriyakosol S, Zhu XP, Jarra W, Pinheiro L, do Rosario VE, et al. High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Molecular and biochemical parasitology. 1993;61(2):315-20.

23.       Assmar M, Terhovanessian A, Jahani MR, Nahrevanian H, Amirkhani A, Piazak N, et al. Molecular epidemiology of malaria in endemic areas of Iran. Southeast Asian journal of tropical medicine and public health. 2003;34:15-9.

24.       محمدعلی ع, محمدتقی م, بهروز تل. تشخیص گونه های انگل مالاریا به روش Nested-PCR در پشه های ناقل و خون های آلوده منطقه چابهار و ایرانشهر ایران.

25.       Assmar M, Ter Hovanessian A, Naddaf S, Piazak N, Masomi H. PCR Detection of malaria parasites in Anopheles stephensi and Anopheles culicifacies mosquitoes collected from southern endemic foci of Iran. Journal of School of Public Health and Institute of Public Health Research. 2005;3(3):19-26.

26.       ابراهیمی, دلیمی‌اصل, کاظمی. تشخیص گونه‌های پلاسمودیوم انسانی با روش PCR-RFLP. پژوهش‌های آسیب‌شناسی زیستی. 2007;10:1-7.

27.       Vythilingam I, Tan C, Asmad M, Chan S, Lee K, Singh B. Natural transmission of Plasmodium knowlesi to humans by Anopheles latens in Sarawak, Malaysia. Transactions of the royal society of tropical medicine and hygiene. 2006;100(11):1087-8.

28.       Ebrahimzadeh A, Fouladi B, Fazaeli A. High rate of detection of mixed infections of Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum in South-East of Iran, using nested PCR. Parasitology international. 2007;56(1):61-4.

29.       Tan CH, Vythilingam I, Matusop A, Chan ST, Singh B. Bionomics of Anopheles latens in Kapit, Sarawak, Malaysian Borneo in relation to the transmission of zoonotic simian malaria parasite Plasmodium knowlesi. Malaria journal. 2008;7(1):52.

30.       Vythilingam I, NoorAzian YM, Huat TC, Jiram AI, Yusri YM, Azahari AH, et al. Plasmodium knowlesi in humans, macaques and mosquitoes in peninsular Malaysia. Parasites & Vectors. 2008;1(1):26.

31.       Zakeri S, Kakar Q, Ghasemi F, Raeisi A, Butt W, Safi N, et al. Detection of mixed Plasmodium falciparum & P. vivax infections by nested-PCR in Pakistan, Iran & Afghanistan. 2010.

32.       Kaindoa EW, Matowo NS, Ngowo HS, Mkandawile G, Mmbando A, Finda M, et al. Interventions that effectively target Anopheles funestus mosquitoes could significantly improve control of persistent malaria transmission in south–eastern Tanzania. PloS one. 2017;12(5):e0177807.

33.       Keven JB, Reimer L, Katusele M, Koimbu G, Vinit R, Vincent N, et al. Plasticity of host selection by malaria vectors of Papua New Guinea. Parasites & vectors. 2017;10(1):95.

34.       Organization WH. Manual of the international statistical classification of diseases, injuries, and causes of death: World Health Organization; 1975.

ندارد