بررسی شیوع و تعیین گونه بابزیا در شتر های شهرستان زاهدان بااستفاده از روش PCR

بابزیوزیس (پیروپلاسموزیس) به وسیله گونه های مختلف بابزیا ایجاد میشود که میزبانهای مهره دار گوناگون شامل حیوانات اهلی و وحشی وانسان را آلوده می کند. این تک یاخته انگل داخل سلولی است و در داخل گلبولهای قرمز یافت میشود (1)

گونه هایی که باعث ایجاد بیماری در حیوانات و انسان میشوند عبارتند از :

بابزیا اویس وبابزیا موتازی در گوسفند ، بابزیا بوویس ، بابزیا بایژمینا ،بابزیا دایورجنس در گاو ، بابزیا اکویی وبابزیا کابالی در تکسمیان ، بابزیا ترتمانی درخوک وبابزیا میکروتی در جوندگان و انسان(2). احتمال ابتلای افرادی که در تماس با این موجودات باشند وجود دارد (3). اولین گزارش از ابتلا ء انسان به این بیماری در سال 1956 از یک کشاورز یوگسلاویایی بود که مبتلا به بابزیا دایورجنس که گونه گاوی است شد ونهایتا باعث مرگ وی شد. انسان به گونه بابزیا بوویس نیز مبتلا میشود (4). حضور انگل در بدن میزبان همواره باعث بروز علائمی از قبیل: تب ، همولیز داخل عروقی ، هموگلوبینمی، هموگلوبینوری ،آنمی همولیتیک ، یرقان  و نارسایی کلیه میشود . موارد انسانی بابزیا مربوط به بابزیا میکروتی می باشد ، ولی ممکن است به بابزیا بوویس ،بابزیا دایورجنس ، بابزیا کابالی ودر صورت تماس نزدیک با گوسفند به بابزیا اویس نیز مبتلا شود(5 و6). در گوسفند سه گونه بابزیا اویس ، بابزیا موتازی ، بابزیا کراسا عامل بابزیوز میباشند و در گاو سه گونه بابزیا بوویس ،بابزیا بایژمینا و بابزیا دایورجنس و در شتر بابزیا کابالی و ندرتا اکوئی عامل بابزیوز میباشند (7 و1). بابزیا اویس و بابزیا موتازی به عنوان شایعترین گونه های بابزیا در گوسفند هستند و بابزیا بوویس وبابزیا بایژمینا در گاوان ایران دارای اهمیت هستند(8 و1). ناقلین بابزیا کنه های خانواده ایکسودیده هستند که عبارتند از : همافیزالیس پونکتاتا ، ریپی سفالوس بورسا ،ریپی سفالوس سانگئی نئوس ، ایکسودس رسینوس و بندرت درماسنتور (9). در سراسر دنیا تحقیقات فراوانی از این انگل شده است. به عنوان مثال در ترکیه تشخیص بابزیا در نشخوارکنندگان کوچک با استفاده از روشRLB انجام گرفته است (10) و یا در سوئیس ،تشخیص بابزیا در کنه های جمع آوری شده از نشخوارکنندگان اهلی و وحشی با روش واکنش زنجیرهای پلیمراز((PCR انجام گردید(11). بابزیا در نشخوارکنندگان ایران بخصوص در گوسفندان ، گاوها و شترها واجد اهمیت است. این انگل سالانه تلفات و خسارت اقتصادی زیادی به دامداریهای کشور وارد می سازد بطوری که بابزیا اویس وبابزیا موتازی به عنوان شایعترین عوامل بابزیای بیماریزا وبابزیا کراسا به عنوان بابزیای غیر بیماریزا مطرح است. بابزیا بوویس وبابزیا بایژمینا در گاوهای ایران دیده شده است. در سال 1893 اسمیت و کیلبورن گزارش کردند که کنه ها، بابزیا بایژمینا را که عامل تب گاوهای تگزاس است را انتقال می دهند (9و1).  دلپی در سال 1936 برای اولین بار در ایران در موسسه سرم سازی رازی وجود انگل را در خون گوسفند وبز تحت عنوان بابزیا اویس گزارش کرد(12) و رفیعی در سال 1966 پراکندگی بابزیا موتازی را در شمال غرب کشور اعلام نمود(13). در مطالعه ای که توسط توسلی و حاجی قهرمانی(1379) بروی 181رأس گوسفند در شهرستان اردبیل جهت تعیین گونه انجام گرفت از 181 رأس 90 مورد آلوده به بابزیا بودند که از این تعداد 78 مورد بابزیا اویس ، 1 مورد بابزیا موتازی و 10 مورد عفونت توأم با هر دو گونه بودند(9). در مطالعه ای دیگر که توسط غیاثی(1376) انجام گرفته شده معلوم شد که از 60 رأس گوسفند آلوده به بابزیا در منطقه ارومیه 45 مورد آلوده به بابزیا اویس بودند(14). در تحقیقاتی که توسط قره خانی و توسلی (1388) در گوسفندان منطقه ماکو انجام گرفت معلوم شد که از بین 183 رأس گوسفند 38 مورد آلوده به بابزیا بودند که از این تعداد 33 مورد بابزیا اویس ، 2 مورد بابزیا موتازی و3 مورد آلودگی توأم به هر دو گونه داشتند(15). تحقیقات و نتایج حاصله از آن در قسمت شمال غرب کشور در منطقه آذربایجان نشان میدهد که احتمال وقوع آلودگی در دامهای روستاهای اطراف شهرستان تبریز وجود دارد.

درسال 2003 حبیبی وهمکاران نشان دادند که تکنیک PCR در تشخیص گونه بابزیا اویس اختصاصی بوده  ودارای حساسیت بالایی است(16).

با اینکه روش تشخیص بابزیا معمولا بر اساس پارامترهای ریخت شناسی، رنگ آمیزی با رنگهای رومانوفسکی و مشاهده آن در زیر میکروسکوپ نوری است ولی با این حال این روش مشکلاتی نیز در بر دارد از جمله شباهت گونه های بابزیا به  گونه های پلاسمودیوم، شباهت گونه های بابزیا به یکدیگر و عدم کارآیی اختصاصات مربوط به میزبان در طبقه بندی علمی انگل (16). با توجه به موارد فوق و به ویژه مشابهت فراوان ریخت شناسی گونه ها به نظر میرسد تمایز ویا تعیین گونه در چنین مواردی از طریق روشهای بیولوژی مولکولی مانند واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR) امکان پذیر باشد(17).

     طبق آخرین آمار سازمان دامپزشکی کشور، تعداد 000/143 نفر شتر در ایران وجود دارد که در نواحی و استان های مختلف کشور پراکنده می باشند و همچنین در سال، قریب به 000/20 نفر شتر نحر می گردند که وزن تقریبی هر لاشه تقریبا 300 کیلوگرم می باشد (18). بنابراین با توجه به اهمیت پرورش شتر در برخی از نواحی ایران از جمله استان سیستان و بلوچستان و همچنین امکان انتقال تعدادی از بیماری ها از این حیوان به سایر نشخوارکنندگان و حتی انسان، ضرورت مطالعه راجع به آن بیش از پیش احساس می گردد.

با توجه به موارد پیشگفت و و همچنین فقدان مطالعه بابزیوز بر روی شتر در ایران  و با توجه به نبود اطلاعات در مورد پراکندگی بابزیوز در استان سیستان و بلوچستان و ویژگیهای ژنتیکی این انگل در استان مطالعه حا ضر طراحی و پیشنهاد گردیده است.

1) شیوع  بابزیا در شترهای  شهرستان زاهدان با استفاده از روش PCR  چگونه است؟

2) گونه  آلوده کننده  بابزیا در شترهای  شهرستان زاهدان با استفاده از روش PCR   کدام است؟

تعیین شیوع و تعیین گونه بابزیا در شتر های شهرستان زاهدان بااستفاده از روش PCR

1) تعیین شیوع  بابزیا در شترهای  شهرستان زاهدان با استفاده از روش PCR 

2) تعیین گونه  بابزیا آلوده کننده  در شترهای  شهرستان زاهدان با استفاده از روش PCR   

مراکز خدمات بهداشتی – درمانی

1. کمک به ارتقا آگاهیهای ژنومیک دررابطه با تک یاخته های پاتوژن زئونوز به منظور درک بیشتر پاتوژنزیسیته آن ها
2. استفاده از مورد بالا جهت بررسی های تشخیصی و کنترل عفونت
3. منا سب تر کردن بستر تحقیقاتی وسیعتر و کارآمدتر در رابطه با روش های زیست شناسی مولکولی و کاربرد آنها در تحقیقات پزشکی مربوط به تک یاخته های بیماریزای زئونوز     

 1-بابزیا:

تک یاخته انگلی داخل سلولی از شاخه: آپی کمپلکس ،زیرشاخه: اسپوروزوآ ،کلاس: اسپوروزوا ،زیرکلاس: پیروپلاسمیا ،راسته: پیروپلاسمیدا ،خانواده: بابزیده وجنس: بابزیا بوده که قادر است در انسان ایجاد بیماری به نام های  بابزیوز - تب گاوهای تگزاس- تب صفراوی در سگ ها - عامل تب پیش آب قرمز- پیروپلاسموزیس نموده و سبب مرگ شود.

2-اسپوروزاییت:

فرم فعال وعفونت زای انگل برای انسان که از بندپا به انسان یا مهره دار منتقل میگردد.

3-مروزوئیت:

فرم حاصل از تکثیر غیرجنسی در RBC بصورت جوانه زدن خارجی (Budding) یا تقسیم 2 تایی در بدن میزبان واسط(انسان) بوده و تولید مروزوئیت های 4 تایی (تتراد) برای حمله به گلبول های سرخ جدید می نماید

4-شیزوگونی:

تکثیر غیر جنسی انگل در بدن میزبان واسط که به فقط به شکل شیزوگونی خونی است.

5-واکنش زنجیره پلی مراز (PCR) :

 در زیست شناسی ملکولی واکنش زنجیره پلی مراز روشی است برای تکثیر یک یا چند نسخه از یک قطعه ملکول DNA که موجب تولید میلیونها نسخه از یک توالی خاص DNA می گردد. این روش متکی بر چرخه حرارتی ، شامل چرخه هایی از اعمال حرارت و سردکردن واکنش برای ذوب و نسخه برداری آنزیمی ملکول DNA است.

6-روش میکروسکوپی در تشخیص بابزیا:

Gold standard  تشخیص بابزیا که لام تهیه شده ورنگ آمیزی شده به روش گیمسا از خون محیطی بیمار  توسط میکروسکوپ بررسی میشود.

توصیفی - مقطعی

در این مطالعه طی فصول بهار وتابستان 1396 از 100 نفر شتر که آماده ذبح بوده و به کشتارگاههای  شهرستان زاهدان انتقال داده شده اند  اقدام به خونگیری به مقدار لازم از ورید وداج  نموده و گسترش خونی نازک از آنها تهیّه خواهد شد.

با توجه  و استناد به مطالعات قبلی(18) در مورد سایر پیروپلاسما ها و انگل های زئونوز در ایران و همچنین مطالعات بابزیوز بر روی شتر در سایر نقاط جهان که در بخش بررسی متون به آنها اشاره شد حجم نمونه 100 نفر شتر در نظر گرفته شد.

n=(Z_1-α/2)²p(1-p)/ d² = (1.96)²(0.1843)(0.6617)/(0.07)²~ 100

که در آن داریم:

p= براساس درصد عفونت بابزیا

a= احتمال خطای نوع اول=0.05

d= دقت مطالعه در برآورد نسبت حساسیت = 0.07

غیر احتمالی  در دسترس.

برای ثبت نتایج مشاهدات از یک فرم جمع آوری اطلاعات استفاده می  شود . این فرم شامل نتایج  آزمون میکروسکوپیک  ، نتیجه آزمون PCR  وروز مشاهده می باشدکه ضمیمه نموده ایم 

 در این مطالعه طی فصول بهار وتابستان 1396 اقدام به خونگیری به مقدار لازم از ورید گوش و ورید وداج 100 نفر شتر از روستاهای بیابانی استان سیستان و بلوچستان که دارای علائم بالینی مشکوک به بابزیوزهستند وهمچنین ازکشتارگاه های صنعتی وبزرگی که درسطح شهرزاهدان وجودداردنمونه گیری به عمل خواهد آمدودرصورت تعطیلی این کشتارگاه ها، نمونه گیری ازگشتارگاه های سنتی وکوچک که درسطح شهروجودداردصورت خواهدگرفت وبه صورت تهیّه گسترش خونی نازک از آنها خواهد بود. نمونه های خونگیری شده  در تیوپ ویا ظرفهای استریل حاوی EDTA ریخته شده و به آزمایشگاه انگل شناسی ارجاع خواهند شد. در آزمایشگاه ، ابتدا گسترشهای خونی تهیّه شده با رنگ گیمسا رنگ آمیزی شده و از نظر آلودگی به بابزیا با استفاده از میکروسکوپ نوری بررسی خواهد شد . نمونه های خونگیری شده را در فریزر 20- درجه سانتیگراد تا هنگام استخراج DNA نگهداری می کنیم ، در مرحله بعد اقدام به استخراج DNA از تمام نمونه های خونی خواهد شد .

استخراج DNA  نمونه ها  با استفاده از کیت تجاری یکی از شرکتهای سازنده کیت طبق دستور کار شرکت سازنده کیت انجام خواهد شد. سپس نمونه هایی که DNA آنها استخراج شده است، را دوباره در فریزر 20- درجه سانتیگراد تا انجام عملیات PCR منتقل خواهیم کرد(19).

جهت انجام عملیات مولکولی روی نمونه های شتر یک مرحله PCRانجام خواهد گرفت.

باتوجه به این که انتقال بیماری فقط توسط کنه به روش بیولوژیکی به صورت مرحله به مرحله ویا به صورت ارثی ازحیوان آلوده به حیوان سالم وحساس منتقل می شود. بنابراین شاخص انتقال بیماری بابزیوز، کنه های جنس های متفاوت خانواده ایکسودیده می باشندکه می توانند درشترها وجود داشته باشندوچون بابزیوزمی تواند به عنوان یک بیماری مشترک درنظرگرفته شود،انسان رامبتلا کنند.

اجرای مرحله PCR :

بطور کلی سیستم واکنش PCR را برای حجم 25 میکرولیتر طراحی میکنیم . اجزای واکنش PCR و حجم هریک به این ترتیب خواهد بود: حجم لازم از  (2x) مسترمیکس 12.5 میکرولیتر  ، مقدار9.5 میکرولیتر آب نوکلئاز فری  ،0.5 میکرولیتر(10Mm) از هر پرایمر،2میکرولیتر از DNA الگو .

پس از تهیّه این مخلوط نمونه ها را در داخل دستگاه ترماسیکلر گذاشته وجهت را در 45 سیکل زمان و درجه حرارت لازم به شرح ذیل تنظیم میگردد:

برای بدست آوردن محصول تکثیر شده با وزن مولکولی 400 bp  بطورکلی در 45 سیکل زمان ودرجه حرارت لازم دستگاه به شرح ذیل تنظیم میگردد . هر سیکلPCR  شامل 95 درجه سانتیگراد به مدت 2دقیقه ، 94 درجه سانتیگراد به مدت 30ثانیه برای مرحله دناتوراسیون ،65 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه برای مرحله آنیلینگ ،72 درجه سانتیگراد به مدت 30ثانیه  و برای اکستنشن .مرحله اکستنشن نهایی در دمای 72 درجه به مدت 5 دقیقه خواهد بود. در پایان محصول PCR  بر روی ژل آگارز 2درصد الکتروفورز شده سپس با ژل رد رنگ آمیزی شده بعد با دستگاه لومیناتور زیر اشعه UV بررسی خواهد شد (20)

توالی پرایمرها: ITS1

Bab-sp-F (GTTTCTGCCCCATCAGCTTGAC)

Bab-sp-R (CAAGACAAAAGTCTGCTTGAAAC)

سپس نمونه های مثبت جهت تعیین گونه، توالی یابی خواهند شد.

با استفاده از روش های آمار توصیفی ( تنظیم جداول توزیع فراوانی ، رسم نمودار ، تعیین شاخص های مرکزی و پراکندگی  ) در سطح اطمینان 95 % و توسط نرم افزار spss  داده ها تجزیه و تحلیل خواهند شد .         

نمونه های موردآزمایش برای ذبح آماده شده ونتایج موارد آلوده به اداره دامپزشکی معرفی میگردند

• عدم همکاری جهت نمونه گیری

راه حل : توضیح دادن در مورد منافع این طرح و این که هیچ ضرری متوجه آنان نخواهد شد

• عدم نمونه گیری مناسب

   راه حل: آموزش به فرد  نمونه گیر

• دشوار بودن مسیرها

راه حل : در اختیار قرار گذاشتن ماشین  در اختیار محقق

Nested-PCR, Babesia , Zahedan

1. توسلی ، موسی(1385): تک یاخته شناسی دامپزشکی؛ انتشارات جهاد دانشگاهی واحد استان آذربایجانغربی
2. محبعلی ، مهدی(1375): بیماریهای مشترک بین انسان و حیوان؛ نشر نادی
3. نعمان ، وحید . جهانگیرنژاد ، علی اکبر . نبی نژاد ، عبدالرضا .1384. بررسی شیوع و شناسایی انگل بابزیا در گوسفند و بز کوچرو وعشایر استان اصفهان . مجله پژوهش و سازندگی . شماره67
4. جی . تی .کرایر (1375) : تک یاخته های انگلی ؛ ترجمه شاهمرادی ، احمد ؛ انتشارات شاهد ، تهران .
5. ادریسیان ،غلامحسین و همکاران (1386) : تک یاخته شناسی پزشکی ؛ انتشارات دانشگاه علوم پزشکی تهران .
6. توسلی ، موسی . رهبری ، صادق .1380. نشانیهای درمانگاهی در بابزیوز تجربی با بابزیا اویس در گوسفند .مجله دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران ، دوره 56 ، شماره 2 .
7.    Uilenberg.G.1995;International Collaborative research significant of tick born hemoparasitic disease to word animal health.Vet.parasitology.57:41-189.
8.    Urquhart,G.M., Armour,J.,Duncan,J.L.,Dunn,A.M. and Jennings,F.W.(1992):Veterinary Parasitology , Longman scientic & technical,london uk.pp:234-241
9. توسلی، موسی. حاجی قهرمانی،شاهین.1379. تعیین گونه های بابزیوز گوسفندی وپراکندگی کنه ها در گوسفندان بیمار شهرستان اردبیل . مجله دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران .دوره 59. شماره 1.
10. INCI, Abdullah. Ica,Anil.yildirim,Alparlan . Identification  of  babesia  and  thileria  species  in  small  ruminants  in  central  Anatolia (Turkey) via  reverse line  blotting .Turk.j.vet .Anim .sci.2010;34(2):205-210 .
11. Hilper tshauser , H. Deplazes,P. Schnyder , M.Gern,L.Mathis, A ; Babesia spp. Identified  by PCR  in  Ticks  collected  from  Domestic  and  wild  Ruminants  in  southern  switzerland . oct .2006, p.6503-6507.
12. Delpy,R.L.P.(1936): Agents en Iran dans le sang  desanimaux domestiques.Bull .Path.Exot.29:157-161.
13.  رفیعی، ع.1357؛ تک یاخته شناسی دامپزشکی و مقایسه ای. انتشارات دبیرخانه شورای پژوهشهای کشور صفحه 657-709
14.  غیاثی،ف.(1376): تعیین گونه های عامل بابزیوز گوسفندی و چگونگی پراکندگی کنه ها در گوسفندان بیمار شهرستان ارومیه، پایان نامه شماره 428 دانشکده دامپزشکی دانشگاه ارومیه، صفحه 26 و 56 .
15.  قره خانی ، احمد . توسلی ، موسی .1389؛ بررسی آلودگی تک یاخته های خونی و شناسایی کنه های ناقل در گوسفندان نژاد ماکویی در منطقه ماکو. مجله دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی.شماره 10.سال چهارم.             

16) Habibi,G.R.,Hashemi-Fesharki,R.and Bordbar,N;DETECTION OF BABESIA USING POLYMERAS  CHAIN REACTION.arch.Razi INS.57.2004.PP:1-10

17)شایان ،پرویز.نبیان،صدیقه.1386؛استفاده از رنگ آمیزی ایمنوژنیک برای تشخیص بابزیوز و  تیلریوز وبیان ژن پروتئین هسته وابسته به تکثیر سلولی در سلولهای آلوده به تیلریا. مجله دامپزشکی ایران.دوره سوم.شماره3 .صفحه 28-

18) El – Naga TRA,Barghash SM(2016) Blood Parasites in Camels (camelus dromedaries)in Northen West Coast of Egypt. J Bacteriol Parasitol 7.258.doi: 10.4172/2155-9597.1000258

19) اسکندری، ع. (1381): بررسی فاسیولیازیس در شترهای نحر شده در کشتارگاه مشهد، پایان نامه جهت دریافت درجه دکترای عمومی دامپزشکی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد گرمسار، شماره 247.

19)Abdalla Mohamed Ibrahim, Ahmed A. H. Kadle, and Hamisi Said Nyingilili: 20)Microscopic and Molecular Detection of Camel Piroplasmosis in Gadarif State, Sudan, Hindawi Publishing Corporation Veterinary Medicine International Volume 2017, Article ID 9345231, 5 pages

فرم اطلاعاتی پایان نامه تحقیقاتی بررسی میزان شیوع و تعیین گونه بابزیا در شتر های شهرستان زاهدان بااستفاده از روش PCR