بررسی ارتباط پلی مورفیسم های rs11071720 , TPM1, ، rs3803499،rs12148828 ، rs1972041 در مبتلایان شکاف لب و یا شکاف کام غیر سندرمی در جمعیت سیستان و بلوچستان

شکافهای دهانی غیر سندرمیک جزء بیشترین آنومالی های مادرزادی در تولد های زنده است. و شامل دو نوع جداگانه است: شکاف لب با و بدون شکاف کام (CL/P) و شکاف کام به تنهایی (CPO)(1, 2) . شکاف لب آسیبی است مادرزادی که به صورت شکافی در لب فوقانی خودنمایی می کند. شکاف مزبور ممکن است تمام یا قسمتی از لب را فرا گرفته و گاهی یک طرفه و زمانی دو طرفه باشد(3, 4). در پاره ای از موارد نوزادی متولد می شود که شکافی در سقف دهان دارد.(3) این شکاف ممکن است سرتاسر کام و یا قسمتی از آن را فرا گیرد، برخی اوقات یک طرفه و زمانی دو طرفه می باشد. ناهنجاری مزبور مادرزادی است و گاهی به تنهایی دیده می شود و زمانی هم توأم با شکاف لب ظاهر می گردد(4).

CPO شیوع کمتری داشته و به مقدار 1 به ازای 1500 تولد زنده، در بیشترین میزان بروز است. درمقابل CL/P میزان شیوع تقریباً 2-1 به ازای 1000 تولد زنده دارد. که این میزان در آسیایی ها نسبت به اروپایی ها و آفریقایی ها بیشتر است. فراوانی شکاف لب در ایران 1163/1 است(3).

از نظر تکامل جنینی در پایان هفته چهارم برجستگی های صورتی ظاهر میشوند. در طی هفته پنجم، پلاکود های (ضخیم شدگی های) بینی به داخل می روند و گوده های بینی را به وجود می آورند. در طی دو هفته بعد، برجستگی های ماگزیلا(فک بالایی) بزرگ می شوند و در همین هنگام به سمت داخل هم رشد می کنند و برجستگی های میانی بینی را به طرف خط وسط می فشارند سپس شکاف بین برجستگی های میانی بینی و برجستگی های ماگزیلاری از بین می رود، و این دو به هم جوش می خورند. بنابراین لب بالایی توسط دو برجستگی میانی و دو برجستگی ماگزیلاری تشکیل می شود. ساختاری که از ادغام دو برجستگی ماگزیلاری تشکیل می شود، قطعه بین دو ماگزیلا(Inter maxillary segment) نام دارد. گرچه کام اولیه از قطعه بین دو ماگزیلا مشتق می شود، بخش اصلی کام نهایی توسط دو بیرون زدگی طاقچه مانند از برجستگی های ماگزیلاری ساخته می شود. در هفته هفتم این زوائد بالا می روند تا در بالای زبان به صورت افقی درآیند و به یکدیگر متصل شده، کام ثانویه را ایجاد کنند. این اتصال در هفته هشتم شروع و در هفته دوازدهم کامل می شود(5).

لب شکری به علت نچسبیدن یا اتصال ناقص برجستگی های ماگزیلاری به برجستگی های میانی بینی در یک طرف و یا دو طرف ایجاد می شوند.

کام شکری به علت نچسبیدن طاقچه های کامی به یک دیگر ایجاد می شود(1). معلوم شده است که طاقچه های کامی در جنس مونث تقریبا یک هفته دیرتر از جنس مذکر به هم می چسبند. این مسئله می تواند توجیهی برای شیوع بیشتر کام شکری منفرد در جنس مونث باش(2).

اتیولوژی شکاف های دهانی مخلوطی از فاکتورهای ژنتیکی و محیطی است. در بیماران با جمعیت های مختلف که سابقه خانوادگی مثبت دارند، فاکتور های ژنتیکی نقش مهمی در تولد های زنده همراه با این مشکل ایفا می کنند(1). محققین در سال های اخیر به این نتیجه رسیدند که فاکتور های ژنتیکی مشخص، یک محیط مناسب برای اثر فاکتور های محیطی خارجی ایجاد میکند که این باعث شروع مکانیسم آن ها می شود و هر دو با هم شکاف را ایجاد می کند.

درمان شکاف لب همراه با شکاف کام و یا بدون آن، انجام جراحی‌های متعدد، گفتار درمانی و درمان‌های ارتودنسی و دندانی را بخصوص در ۱۸ سال اولیه عمر می‌طلبد. ارائه اطلاعات لازم به والدین این کودکان و انجام درمان‌های پزشکی- دندانپزشکی به هنگام، می‌تواند در بهبود وضعیت بسیار مؤثر باشد.

بستگی به میزان و محل شکاف کام یا لب عوارض آن نیز فرق می کند. به طور کلی یک یا چند و یا تمام عوارض زیر ممکن است روی دهد:

تنفس: ناهنجاری فک و کام باعث مشکل تنفسی می شود. در مان شامل جراحی و بکارگیری پروتزهای دهانی است

تغذیه: تغذیۀ نوزادان مبتلا به شکاف نیز با مشکلاتی روبروست. همکاری متخصص تغذیه و گفتار درمانی ممکن است سودمند باشد. دستگاههای ویژه ای نیز به منظور تغذیه نوزاد در دسترس هستند^.

عفونت های گوش و کاهش شنوایی: هر ناهنجار ی دستگاه تنفسی فوقانی می تواند عملکرد شیپور استاش را مختل کند و احتمال تجمع مایع در گوش میانی را افزایش دهد. این امر شانس عفونت گوش میانی را زیاد می کند. کاهش شنوایی نیز نتیجۀ عفونت های مکرر گوش میانی است.

تأخیر در تکلم : برای اینکه کودک بتواند بدرستی صدا و کلمات واضحی راتولید کند رشد و تکامل طبیعی لب و کام ضروری است. می توان باعمل جراحی شکاف را ترمیم کرده و با گفتار درمانی به تکامل گفتار ی کودک کمک نمود.

مشکلات دندانی: گاهی شکاف شامل لثه و فک نیز می شود و این امر بر رشد صحیح دندانها و فک تأثیر می گذارد. دندانپزشک اطفال یا متخصص ارتودنسی می تواند به رفع این مشکل کمک کند

ژنTPM1 برروی کروموزوم15q22 قراردارد که برتوسعه ی پالپ ریشه دندان دخالت داشته و در طی ادونتوژنز نقش اساسی ایفا می کند.(6)

ژن TPM1 در هنگام پیشرفت NSOC بر روی ایجاد فاصله هماهنگ درز تمپورال در طرفین جمجمه در دوره تکامل جنینی که از طریق مهاجرت سلولی ، تکثیر،تفکیک و آپوپتوز اثر می گذارد. این نشان دهنده تاثیر ژن TM1 در تکامل سر و صورت می باشد.(3)

ژن TPM1با اثر بر روی پایداری ساختار فیلامنت های اکتین و فعالیت اسکلت سلولی از طریق مهاجرت سلولی ، سیتوکینز ، تکثیر ، آپوپتوز و حرکت ویزیکول های داخل سلولی تحت تاثیر قرار می دهد.(11)

متیلاسیون بیش از حد DNA بیان TPM1 را سرکوب می کند(7).

ژن BMP4 باعث سرکوب تومور ایجاد شده از طریق TPM1 ومهار micro RNA21 در کراتینوسیت های اپیدرمی می گردد.(8) ژن BMP4 ) Bone Morphogenetic Protein 4 ( بر روی کروموزوم 14q22-q23 قرار داشته و نقش مهمی در تکامل لب و رشد کام ثانویه ایفاء می کند .

ژنTGFB در افزایش بیان ژن TPM1 تاثیر دارد.

بررسی متون و مقالات گذشته

-یک مطالعه انجام شده درسال 2015 جمعیت شهر )هان ( در شرق چین در یک گروه 673 بیمارو 705فرد سالم توسط Yajing Quanوهمکارانش انجام شد که این مطالعه ارتباط معناداری را نشان می دهد.

- درمورد پلی مورفیسم مربوط به ژن TPM1مطالعاتی در چین توسط Kobayashiوهمکارانش در سال 2013 انجام شد که بین این ژن و مشکلات دندانی مرتبط بود اما با شکاف لب و کام ارتباط معناداری مشاهده نشد .

-درمورد پلی مورفیسم مربوط به ژن TPM1مطالعاتی توسط Rahimove وهمکارانش در سال 2012 بین ژن TPM1 پیشرفت NSOC بر روی ایجاد فاصله هماهنگ درز تمپورال در طرفین جمجمه در دوره تکامل جنینی که از طریق مهاجرت سلولی ، تکثیر،تفکیک و آپوپتوز اثر می گذارد. که ژن TM1 در تکامل سر و صورت تاثیر دارد.(3)

-یک مطالعه انجام شده درسال 2011 توسط احمد و همکارانش بر روی ژن TPM1 نشان داد ژن BMP4 باعث سرکوب تومور ایجاد شده از طریق TPM1 به وسیله مهار رشد سلول های تومور می گردد.ومهار micro RNA21 در کراتینوسیت های اپیدرمی می گردد.(8)

این نقص که به صورت سندرمیک وغیرسندرمیک بروز کرده ازلحاظ شناسایی عوامل ایجادکننده بسیارپیچیده است. این ناهنجاری عوارض فردی واجتماعی متعدد و درازمدتی رادرپی دارد. مبتلایان با احتساب وقت وهزینه بالا دوره طولانی از عمرشان را باید صرف درمان های جراحی، دندانی فکی، گفتاردرمانی و سایکولوژیک ناشی از این ناهنجاری ها نمایند.

• در کشور هایی نظیر آمریکا ، کانادا، لهستان، چین، اسلونی تحقیقات فراوانی بر روی اتیولوژی ژنتیکی این بیماران انجام گرفته است که به نقش این ژن ها در استعداد ابتلا به این بیماری اشاره شده بر این اساس ما بر آن شدیم که در این استان که ازدواج های فامیلی درصد بالایی از ازدواج ها را به خود اختصاص می دهد بیماران مبتلا به شکاف لب و کام را از نظر بررسی درمورد پلی مورفیسم های مربوط به ژن TPM1با چهار جایگاه rs3803499
• rs12148828 rs11071720
• rs1972041

مورد مطالعه و بررسی قرار دهیم و ببینیم که این پلی مورفیسم در برابر ابتلا به بیماری شکاف کام و لب نقش محافظتی دارد یا این که به عنوان عامل مستعد کننده عمل می کند.

• توزیع فراوانی پلی مورفیسم های rs3803499)TPM1)در مبتلایان به شکاف لب و/یا کام غیر سندرمی با افراد سالم متفاوت است

• توزیع فراوانی پلی مورفیسم های rs12148828)TPM1 ) در مبتلایان به شکاف لب و/یا کام غیر سندرمی با افراد سالم متفاوت است.
• توزیع فراوانی پلی مورفیسم های rs1872041)TPM1 )درمبتلایان به شکاف لب و/یا کام غیر سندرمی با افراد سالم متفاوت است

توزیع فراوانی پلی مورفیسم rs1107172)TPM1) در مبتلایان به شکاف لب و/یا کام غیر سندرمی با افراد سالم متفاوت است

بررسی ارتباط پلی مورفیسم ژن TPM1 rs11071720, ، rs3803499، ،rs12148828، , rs1972041 در مبتلایان شکاف لب و یا شکاف کام غیر سندرمی در جمعیت سیستان و بلوچستان

مقایسه فراوانی پلی مورفیسمrs3803499)TPM1)در مبتلایان به شکاف لب و/یا کام غیر سندرمی با افراد سالم

مقایسه فراوانی پلی مورفیسمrs12148828)TPM1 ) در مبتلایان به شکاف لب و/یا کام غیر سندرمی با افراد سالم

مقایسه فراوانی پلی مورفیسمrs1872041)TPM1 )درمبتلایان به شکاف لب و/یا کام غیر سندرمی با افراد سالم

مقایسه فراوانی پلی مورفیسم rs1107172)TPM1) در مبتلایان به شکاف لب و/یا کام غیر سندرمی با افراد سالم

دانشگاه و مراکز تحقیقاتی

• SNP: پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی که یک نوکلئوتید چایگزین نوکلئوتید دیگر میشود.
• آنومالی: ناهنجاری
• CL/P: شکاف لب و/ یا شکاف کام
• CPO: شکاف کام به تنهایی
• کرانیوفاسیال: استخوان های سر و صورت
• موتاسیون: جهش

موردی- شاهدی(case- control)

گروه بیمار :

افراد مبتلاء به شکاف لب و/یا کام غیرسندرمیک بومی استان سیستان و بلوچستان ( نمونه های قبل و همچنین نمونه های جدید)

کلیه مبتلایان به شکاف لب و/یا کام غیرسندرمی مراجعه کننده به کلنیک ENT و نوزادان دارای شکاف لب و/یا کام غیرسندرمیک تازه متولد شده در سطح زایشگاههای استان در گروه افراد بیمار قرار می گیرند. .

معیارهای خروج افراد از مطالعه :

بیماران دارای قومیتی غیر از سیستانی و بلوچستان

بیماران مبتلاء به شکافهای سندرمیک

گروه شاهد :

افراد سالمی که هیچگونه عارضه و شکاف مادرزادی  یا غیرسندرومی درناحیه سر و صورت نداشته  باشد و این افراد بطور داوطلبانه و با کسب رضایت انتخاب می شود. 

نمونه گیری آسان و در دسترس برای نمونه های کنترل و شاهد

با توجه به محدودیت زمانی و افزایش هزینه طرح ،حجم نمونه 110 نفر در نظر گرفته شد تا در تجزیه و تحلیل آماری نیز خللی ایجاد نگردد و نمونه گیری بصورت آسان (حداقل 110 نفر بیمار و 110 نفر سالم) انجام می شود.(در بررسی که در موردTPM1توسط Yaging Quanوهمکاران صورت گرفت673 نفربیمار و705نفربه عنوان کنترل شرکت کردند.(

روش نمونه گیری آسان می باشد.

مشاهده و بررسی های آزمایشگاهی

پس از تصویب پروپوزال پرایمرهای اختصاصی برای بررسی پلی مورفیسم ها جهت تعیین پلی مورفیسم های ژن TPM1و rs3803499 و rs12148828 وrs1972041 و s11071720 r به روش PCR-RFLP طراحی می شود. در مرحله بعد شرایط PCR برای تعیین این پلی مورفیسم های بهینه شده ، سپس پلی مورفیسم های ژنی ذکر شده درDNA نمونه خون افراد گروه شاهد و مورد(که به روش salting outتلخیص شده)با این تکنیک آنالیز می شوند.

پس از گردآوری اطلاعات لازم، یافته ها در نرم افزار آماری SPSS وارد گشته و داده ها با استفاده از آزمون­های آماری χ2 مورد تجزیه و تحلیل قرار خواهند گرفت.همچنین از آزمون رگرسیون لجستیک استفاده خواهد شد.

کدهای 1، 2، 3، 8، 10، 11، 13، 15، 18، 25، 28، مصوب کمیته کشوری اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی که در دفترچه راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش‌های دارای آزمودنی انسانی در جمهوری اسلامی ایران، دربردارنده‌ی اصول و مقررات اخلاقی‎ مطرح و در سال 1392 در 31 بند تصویب شده است و همچنین کدهای 1، 2، 3، 4، 7 مربوط به دفترچه راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی در جمهوری اسلامی ایران از قسمت راهنمای عمومی در این طرح رعایت می شود. تمامی بیماران تحت مطالعه آگاهانه و برای مقاصد علمی اقدام به دادن نمونه خواهند کرد. شرکت در این طرح هیچ گونه هزینه ای برای بیماران ندارد و نام و مشخصات بیماران گزارش نخواهد شد.

• عدم همکاری بیماران و خانواده هایشان در روند نمونه گیری که با توضیح اهمیت پژوهش و آموزش صحیح میتوان آنرا تسهیل نمود.
• مطالعه بیماران دارای عارضه غیر سندرمیک میتواند در تعداد نمونه ها محدودیت ایجاد می کند که با افزایش زمان اختصاص یافته جهت نمونه گیری می توان به تعداد نمونه واجد شرایط دست یافت.
• مشکل تهیه مواد و امکان طولانی شدن زمان دریافت آنها.

Polymorphism,CL/P,CPO

1. Mossey PA, Little J, Munger RG, Dixon MJ, Shaw WC. Cleft lip and palate. The Lancet. 2009;374(9703):1773-85.
2. Lidral AC, Moreno LM, Bullard SA, editors. Genetic factors and orofacial clefting. Seminars in orthodontics; 2008: Elsevier.
3. Rahimov F, Jugessur A, Murray JC. Genetics of nonsyndromic orofacial clefts. The Cleft Palate-Craniofacial Journal. 2012;49(1):73-91.
4. Dixon MJ, Marazita ML, Beaty TH, Murray JC. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature Reviews Genetics. 2011;12(3):167-78.
5. Stanier P, Moore GE. Genetics of cleft lip and palate: syndromic genes contribute to the incidence of non-syndromic clefts. Human molecular genetics. 2004;13(suppl 1):R73-R81.
6. Lin JJ-C, Eppinga RD, Warren KS, McCrae KR. Human tropomyosin isoforms in the regulation of cytoskeleton functions. Tropomyosin: Springer; 2008. p. 201-22.
7. Varga AE, Stourman NV, Zheng Q, Safina AF, Quan L, Li X, et al. Silencing of the Tropomyosin-1 gene by DNA methylation alters tumor suppressor function of TGF-β. Oncogene. 2005;24(32):5043-52.
8. Ahmed MI, Mardaryev AN, Lewis CJ, Sharov AA, Botchkareva NV. MicroRNA-21 is an important downstream component of BMP signalling in epidermal keratinocytes. J Cell Sci. 2011;124(20):3399-404.

9-Zhu S, Si M-L, Wu H, Mo Y-Y. 2007. MicroRNA-21 targets the tumor

suppressor gene tropomyosin 1 (TPM1). J Biol Chem 282: 14328–14336.

10-Pan Y, Han Y, Zhang H, Zhou L, Li D, Cai Q,MaJ, ZhangW, Wang L. 2013.

Association and cumulative effects of GWAS-identified genetic variants

for nonsyndromic orofacial clefts in a Chinese population. Environ Mol

Mutagen 54:261–267.

11-Gunning P, O’Neill G, Hardeman E. 2008. Tropomyosin-based regulation

of the actin cytoskeleton in time and space. Physiol Rev 88:1–35.

GupteTM,HaqueF,GangadharanB,SunithaMS,MukherjeeS,AnandhanS,

Rani DS, Mukundan N, Jambekar A, Thangaraj K, Sowdhamini R,

Sommese RF, Nag S, Spudich JA, Mercer JA. 2015. Mechanistic heterogeneity

in contractile properties of alpha-tropomyosin (TPM1)

mutants associated with inherited cardiomyopathies. J Biol Chem 290:

12-Borovikov YS, Avrova SV, Karpicheva OE, Robinson P, Redwood CS.

2011. The effect of the dilated cardiomyopathy-causing Glu40Lys TPM1

mutation on actin-myosin interactions during the ATPase cycle. Biochem

Biophys Res Commun 411:496–500.

13- Choi C, Kim D, Kim S, Jeong S, Song E, Helfman DM. 2012. From skeletal

muscle to cancer: insights learned elucidating the function of tropomyosin.

J Struct Biol 177:63–69.

14-deAquino SN, Messetti AC, Hoshi R, Borges A, Viena CS, Reis SRA, Swerts

MSO, Graner E, Martelli-Junior H, Coletta RD. 2014. Analysis of

susceptibility polymorphisms for nonsyndromic cleft lip with or without

cleft palate in the Brazilian population. Birth Defects Res Part A: Clin Mol

Teratol 100:36–42.

ندارد