1-عنوان فارسی:

ارزیابی تاثیر همزمانی مصرف باکتری پروبیوتیک تجزیه کننده اگزالات و عصاره گیاه موثر  بر کاهش اگزالات ادراری  به روی رت های آزمایشگاهی.

2-عنوان انگلیسی:

 Evaluation of  the impact of the simultaneous use of  Oxalate-degrading bacteria, probiotics and plant extracts in reducing urinary oxalate  on laboratory rats.

3-مسئله تحقیق   :

تشکیل سنگ های ادراری را سومین بیماری شایع در دستگاه ادراری- تناسلی می دانند که با وجود داشتن سابقه دیرین در جامعه پزشکی، هنوز به عنوان یک بیماری مزمن به شمار می رود و درمان قطعی برای پیشگیری از آن وجود ندارد (1). تشکیل شن یا سنگ کلیه بیشتر به دلیل عدم تعادل در مصرف غذاهای غنی از اگزالات، کلسیم و فرآورده های گوشتی می باشد و از طرفی زمینه ارثی و عدم بیان یکسری آنزیم های ضروری و لازم در روند تجزیه اگزالات غذایی، در ظهور این بیماری بی اثر نیست (2). سنگ تشکیل شده در بخش های کالیکس فوقانی و تحتانی، گاهی از محل خود جدا شده و وارد لگنچه و از آنجا وارد حالب ها و مثانه می شود که می تواند در آن محل تشکیل سنگ مثانه را دهد (1). برای خارج کردن سنگ از بخش های مختلف دستگاه ادراری نیاز به روش های پیشرفته از جمله سنگ شکنی با امواج برون اندامی (خارج بدن) (^[1]ESWL) ، سنگ شکنی درون اندامی (داخل شکمی) (^[2]TUL) و جراحی بدون برش سنگ کلیه (خروج سنگ از راه ادرار) (PCNL^[3]) می باشد که بسیار پر هزینه  است (3). گاهی تجمع کریستال های اگزالات کلسیم یا آمونیوم در دستگاه ادراری می تواند سبب التهاب لگنچه و  بافت کلیه شود که همراه با درد و خونریزی می باشد ( 2). همچنین وجود سنگ کلیه زمینه ساز خیلی از بیماری های کلیوی از جمله اختلال در عملکرد کلیه ، تخریب بافت کلیه و نهایتا سبب نارسایی حاد و یا مزمن کلیه در افراد  می شود که همگی موارد ، فرد را مستعد به از دست دادن کلیه و پیوند مجدد کلیه می کند (1و2). 

 سنگ مجاری ادراری در واقع یک قطعه سخت و جامد ناشی از تجمع و رسوب ترکیبات آلی و غیر آلی در ادرار می باشد که در قسمت های مجاری ادراری تشکیل می شود (2). این سنگ ممکن است در کلیه بماند یا این که توسط ادرار به بخش های پائین تر دستگاه ادراری برود. همه سنگ های کلیه یک جنس و شبیه یکدیگر نیستند نوع رژیم غذایی ، نژاد افراد و مناطق جغرافیایی ،علاوه بر اینکه روی شیوع سنگ موثر است روی جنس سنگ نیز تاثیر دارد (4). شایع ترین سنگ های ادراری شامل سنگ های اگزالات کلسیم ( به میزان 80 درصد ) و فسفات کلسیم (18%) است که در بیماران مبتلا به هیپراگزالوریا [4] ( افزایش اگزالات ادراری ) ، به فراوانی دیده می شود (3).  میزان شیوع سنگ کلیه در افراد 10 الی 15 % می باشد (4) . در کشور ما آمار افراد مبتلا به سنگ کلیه نسبتا بالاست و از هر 8 نفر یکی به سنگ کلیه مبتلا می باشد . بروز سنگ کلیه در مردان 2 تا 3 برابر زنان می باشد و در نژاد سفید پوست نسبت به سیاه پوستان بیشتر دیده می شود ( 5) .

اگزالات موجود در سنگ های کلیوی یک ترکیب توکسیک قوی است که تجمع آن در بافت های مختلف ( از قبیل کلیه و کبد) سبب اختلال و نارسایی بافت می شود. مقدار طبیعی دفع آن از راه ادرار 2/0 مول در 24 ساعت است. دفع مقادیر بیشتر سبب افزایش اگزالات ادراری و نهایتا تشکیل سنگ های اگزالات کلسیمی می شود (6) .

هیپراگزالوریا به دلیل تولید اندوژنی اگزالات و جذب بیش از حد اگزالات روده ای ایجاد می شود که یک ریسک فاکتور اصلی در تشکیل سنگ های اگزالات کلسیمی است (4) . افزایش اگزالات ادراری به دو صورت هیپراگزالوریای روده ای[5] و هیپراگزالوریای غذایی[6] دیده می شود (3و4). در هیپراگزالوریای روده ای عدم جذب اگزالات درون غذا ( به هر دلیلی از جمله بیماری های مربوط به روده کوچک ، افزایش باکتری های پاتوژن روده و یا کاهش باکتری های تجزیه کننده اگزالات ) اتفاق می افتد در نتیجه غلظت اگزالات آزاد در روده افزایش یافته که با جذب اگزالات به ادرار ، سبب افزایش اگزالات ادراری می شود ( 6). اما در هیپراگزالوریای غذایی ، با مصرف زیاد غذای غنی از اگزالات ( از جمله شکلات ، اسفناج، کرفس، چای سیاه، آجیل و قهوه ) در روز ، جذب اگزالات از روده به ادرار افزایش یافته که منجر به افزایش غلظت اگزالات در ادرار می شود ( 1).

بررسی های آزمایشگاهی نشان می دهد که بیشتر پستانداران قادر به تجزیه اگزالات نبوده و بدین ترتیب با دفع آن از راه ادرار و ایجاد رسوب کریستال های اگزالات ( به همراه دیگر املاح در ادرار از جمله کلسیم ، یون آمونیوم و یا فسفات ) سبب تشکیل سنگ در مجاری ادراری از جمله کلیه ها می شود (2).

امروزه اثبات شده که باکتری های تجزیه کننده اگزالات که در دستگاه گوارش قرار دارند سبب متعادل سازی و تجزیه آن می شوند (7). Allison در طی بررسی های انجام شده بر کولون حیوانات نشخوارکننده ( که غذای غنی از اگزالات مصرف کرده بودند ) گزارش داد باکتری اگزالوباکتر فورمی ژنز[7] قادر است اگزالات را به ترکیبات ساده تر تجزیه کرده و بدین ترتیب مانع افزایش اگزالات ادراری می گردد (8). تحقیقات گسترده روی باکتری های دستگاه گوارش نشان می دهد که باکتری های پروبیوتیک ( از جمله لاکتوباسیلوس ) نیز قدرت تجزیه کنندگی اگزالات بالایی دارند (5). باکتری های تجزیه کننده اگزالات طی مسیرهای آنزیمی خاص، اگزالات را تبدیل به فورمات و دی اکسیدکربن می کنند . در این مسیر دو آنزیم اگزالیل کوآنزیم A دکربوکسیلاز ([8]OXC) و فورمیل کوآنزیم A ترانسفراز ([9]FRC) نقش کلیدی ایفا می کنند (7) .

پژوهش های گسترده روی باکتری های پروبیوتیک ( از جمله لاکتوباسیلوس ها ) نشان می دهد این باکتری ها به طور معناداری سبب کاهش اگزالات ادراری در افراد مبتلا به هیپراگزالوریا می شوند ( 9) . در پژوهشی به رژیم غذایی رت های آزمایشگاهی،باکتری های پروبیوتیک اضافه کردند، پس از دو روز کاهش معناداری در میزان اگزالات ادراری رت ها مشاهده شد (7). در مطالعه ای دیگر با اضافه کردن باکتری های لاکتوباسیلوس و بیفیدوباکتریوم ها به غذای افراد داوطلب مبتلا به سنگ کلیه، کاهش سطح اگزالات ادرای 30 درصد را مشاهده کردند (10). پروبیوتیک ها^[10] ارگانیسم های زنده ای هستند که با تعدیل فلور میکروبی روده ، اثرات مفیدی بر روی سلامت میزبان اعمال می کنند . آنها عموما از منابع انسانی بوده و غیر بیماری محسوب می شوند .( 11). پروبیوتیک هایی که بیش از همه در زمینه های مختلف مورد مطالعه قرار گرفته اند، باکتریهای تولید کننده اسید لاکتیک شامل گونه های لاکتوباسیلوس و بیفیدو باکتریها هستند (12) . مکانیسم های اثر پروبیوتیک ها کاملا شناخته شده نیست  ولی به تولید ترکیبات مهار کننده باکتریهای روده، مسدود کردن جایگاه های اتصال باکتریها، رقابت برای جذب مواد غذایی و تقویت سیستم ایمنی را از جمله مهمترین این مکانیسم ها  دانسته اند ( 13).

 امروزه با رویکرد جدید علم پزشکی به گیاهان دارویی، راه های درمانی تازه ای برای بهبود بیماری های مختلف از جمله سنگ کلیه باز شده است. از دیرباز در نقاط مختلف دنیا از جوشانده و عصاره یکسری گیاهان دارویی بعنوان درمان سنتی بیماری های مجاری ادراری از جمله سنگ کلیه و مثانه استفاده می شده است (14). جوشانده چندین گیاه به عنوان سنگ شکن های طبیعی معرفی شده اند که به طور مستقیم موجب خرد شدن سنگ های کلیوی، شل شدن عضله صاف مجاری ادراری و دفع آنها از کلیه ها می شود (15). از جمله مهمترین این گیاهان می توان  گزنه[11] ، خارخاسک[12] ، کاکل ذرت[13] نام برد که با داشتن ترکیبات مختلف بعنوان کمک کننده در دفع سنگ کلیه ، کمک به کاهش التهاب و کاهش عفونت دستگاه ادراری عمل می کنند (14).

اخیراٌ در ایران از عصاره های گیاهی ( بصورت آماده در بازار ) بعنوان تسهیل کننده دفع سنگ کلیه استفاده می کنند. اما از غلظت و مقدار ماده موثره آنها گزارشی نشده است. بعنوان نمونه قطره سنکل که بصورت عصاره ترکیبی 7 گیاه ( رازیانه ،برگ بو، خارخاسک، زیره سبز، تخم خربزه، کاکل ذرت و دم گیلاس ) به همراه ترکیبات صنعتی است که دقیقا مشخص نیست موثرترین عصاره کدام ( با چه غلظت و درصدی) است از اینرو در این پژوهش خالص سازی و عصاره گیری ( تهیه عصاره آبی و هیدروالکلی) گیاه گزنه، خارخاسک، کاکل ذرت با دستگاه سوکسله و دستگاه روتاری انجام خواهد گرفت . همچنین در این پژوهش به منظور بررسی مواد موثره گیاهان مورد مطالعه، گزنه ( Otles etal.,2012) (Moradi etal.,2017) ،خارخاسک  (etal.,2008  Breu) و  کاکل ذرت (etal.,2008  Suzuki) آنالیز عصاره های گیاهی به روش کروماتوگرافی –گازی (GC) انجام می گیرد.

نتایج تاثیر مصرف عصاره های گیاهی مختلف بر اساس منطقه جغرافیایی تا حدودی تفاوت دارند. بررسی های آزمایشگاهی روی موش های مبتلا به سنگ کلیه نیز حاکی از اثر عصاره های گیاهی بر کاهش اگزالات و کلسیم ادراری می باشد (16).

با توجه به مشکلات بالینی مذکور و هزینه های درمانی ناشی از افزایش اگزالات ادراری و مشکل عودهای مکرر سنگ کلیه ، و با توجه به اینکه باکتری های پروبیوتیک و نیز عصاره های گیاهی می توانند تاثیر مستقیمی بر کاهش التهاب بافت کلیوی، اگزالات ادراری و تشکیل سنگ کلیه داشته باشند، و با توجه به اینکه تاکنون پژوهش چندانی در مورد ارتباط بین مصرف همزمان باکتری های پروبیوتیک تجزیه کننده اگزالات و عصاره های گیاهی با بروز سنگ کلیه بروی مدل های حیوانی-آزمایشگاهی انجام نشده ، لذا ما بر آن شدیم که تاثیر غلظت های مختلف باکتری های پروبیوتیک و غلظت های مختلف عصاره های گیاهی موثر بر سنگ های کلیوی را در رت های آزمایشگاهی ارزیابی و مقایسه کنیم. در مرحلۀ بعد رابطه همزمانی مصرف این پروبیوتیک ها و عصاره ها را در این حیوانات مطالعه گردد.

بدیهی است که در صورت موفقیت طرح و کسب نتایج مطلوب، می توان با ساخت داروهای ترکیبی حاوی پروبیوتیک و عصاره های گیاهی مذکور و ترکیبات متنوع حاصله ، ضمن کاهش هزینه های درمانی و تسکین آلام این گروه از بیماران و پیشگیری از عود سنگ های ادراری ، با تولید انبوه و صنعتی سازی این داروها ، در جهت نیل به اهداف سیاست اقتصاد مقاومتی و تولید ملی گام برداشت.

 مروری بر کارهای دیگران

بیماری تشکیل سنگ  های کلیوی ، از قدیمی ترین بیماری های بشر است (1)  این بیماری یک مشکل جهانی بوده که شیوع آن در نقاط مختلف دنیا 10-15% ( در آمریکا 8 % ، ژاپن 7%  ، کره 4%  و آلمان 5% ) و در ایران 5 تا 8 درصد گزارش شده است (15). در طی یک مطالعه کهورت در ایران ، بر اساس محل جغرافیایی شیوع سنگ کلیه در نقاط مختلف متفاوت گزارش شد بطوریکه بیشترین فراوانی تشکیل سنگ کلیه در نواحی جنوب شرقی و شهرهای جنوبی به ترتیب 6/9 درصد و 5/8 درصد و کمترین فراوانی در استان های شمالی 1/4 درصد بود ( 17). عواملی از جمله نوع رژیم غذایی افراد، عدم مصرف مایعات، مصرف بالای نمک ، عفونت دستگاه ادراری ، مصرف بالای آنتی بیوتیک و ژنتیک را بعنوان مهمترین عوامل موثر بر شیوع سنگ کلیه در ایران گزارش داده اند. در بررسی های نیک پی در سال 2016 ، شیوع سنگ اگزالات کلسیمی 25/61 درصد و سنگ هایی با ترکیبات اگزالات آمونیوم و فسفات کلسیمی را 25/31 درصد در ایران ذکر گردیده است (18). امروزه عود سنگ های کلیوی را مهم ترین مشکل در مسیر درمان این بیماری می دانند (1). نتایج بررسی ها حاکی از رابطه مستقیم بین عود تشکیل سنگ در دستگاه ادراری و نوع غذای مصرفی (غذای غنی از اگزالات ) و نیز مصرف انواع آنتی بیوتیک ها در مقیاس وسیع می باشد چرا که بسیاری از آنتی بیوتیک های رایج مصرفی سبب کاهش باکتری های پروبیوتیک ( تجزیه کننده اگزالات ) دستگاه گوارش می شوند که افزایش اگزالات ادراری در پی خواهد داشت (13و14). بر اساس بررسی های مربوط به ایران در بیماران با سابقه سنگ کلیه قبلی ، میزان عود بیماری پس از یکسال 16% و پس از 10 سال 53% برآورد شده است (17و18).

بر اساس بررسی Kwak در مبتلایان به سیستیک فیبروزیس، بدلیل مصرف بالای آنتی بیوتیک های مختلف ، تعداد باکتری های تجزیه کننده اگزالات و فلور گوارشی در دستگاه گوارش کاهش یافته و زمینه تشکیل سنگ اگزالات کلسیمی فراهم می گردد ( 12). Johari نیز با بررسی افراد مبتلا به نارسایی مزمن کلیوی ، دریافت که در این افراد پس از پیوند کلیه، افزایش سطح اگزالات ادراری و عود تشکیل سنگ کلیه دیده می شود که آن را مرتبط با مصرف بالای آنتی بیوتیک پس از پیوند دانست که سبب کاهش باکتری های تجزیه کننده اگزالات می شود. (19). بر اساس بررسی  Federiciبر روی غذای مصرفی افراد مبتلا به سنگ های کلیوی ، افزایش اگزالات ادراری بدلیل مصرف بالای غذاهای غنی از اگزالات ( اسفناج، کرفس و ... ) می باشد (10). Allison  و همکاران در سال 1985 با بررسی باکتری های دستگاه گوارش حیوانات نشخوارکننده ، باکتری تجزیه کننده اگزالات به نام اگزالوباکترفورمی ژنز را شناسایی کردند که قادر به تجزیه اگزالات به مواد ساده بوده و از این طریق انرژی و ماده ی کربنی مورد نیاز خود را فراهم می کند (8).

 Cornick سال 1996 با مطالعه بیشتر اگزالوباکترها ، دو آنزیم اگزالیل کوآنزیم A دکربوکسیلاز (oxc) و فورمیل کوآنزیم A ترانسفراز (frc) را شناسایی کرد که در تجزیه اگزالات به دی اکسید کربن و فورمات نقش مهمی دارند(20) و Kim در سال 2005 این دو آنزیم را در باکتری های پروبیوتیک نیز شناسایی کرد که قادر به تجزیه اگزالات بودند (21).

با توجه به اثرات مفید باکتری های پروبیوتیک، تاکنون هیچگونه عوارض جانبی و التهابی را نشان نداده اند امروزه تحقیقات گسترده ای در جهت استفاده از ترکیبات پروبیوتیکی بر درمان سنگ های کلیوی شده است از جمله این ترکیبات می توان کپسول های خوراکی Oxadrop  و [14]AKSB نام برد (22).

اخیراٌ بیشترین تحقیقات صورت گرفته در ارتباط با تاثیر پروبیوتیک ها بر کاهش اگزالات ادراری ،کپسول Oxadrop  می باشد. این کپسول حاوی ترکیب های متفاوت و غلظت های مختلفی از باکتری های پروبیوتیک ( لاکتوباسیلوس ها ، بیفیدیوباکترها و استرپتوکوکوس ترموفیلوس ) است که در طی بررسی تاثیر درمانی آنها بر کاهش اگزالات ادراری، نتایج متفاوت و موثری گزارش شده است (9-13) . موثرترین باکتری های پروبیوتیک بر تجزیه اگزالات در شرایط Invivo و  Invitroدر بین سویه های لاکتوباسیلوس را لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس[15], لاکتوباسیلوس پلانتاروم[16] ،لاکتوباسیلوس برویس [17]،لاکتوباسیلوس کزئی^[18]و لاکتوباسیلوس پاراکزئی^[19] و در بین سویه های بیفیدیوباکتریوم را بیفیدیوباکتریوم انیمالیس^[20] ، بیفیدیوباکتر اینفنتیس[21] ، بیفیدیوباکتر لانگوم^[22] ، بیفیدیوباکتر بریو^[23] و استرپتوکوکوس ترموفیلوس[24] ذکر کرده اند (19-22).

کپسول پروبیوتیکی AKSB ، حاوی ترکیبات پری بیوتیک[25] ( فروکتو-الیگوساکارید[26]، انتروکوکوس فاسیوم[27]، ساکارومیسیس سرویزئه[28]و ساکارومیسیس بولاردی[29](   به همراه باکتری های پروبیوتیک می باشد که اولین بار در مرکز درمانی مایو[30]  ( در آمریکا ) به منظور کاهش اگزالات ادراری به بیماران مبتلا به هیپراگزالوریا و سنگ کلیه توسط دکتر Lieske  تجویز شد که نتایج این پژوهش نشانگر کاهش معنادار اگزالات ادراری در افراد مورد مطالعه بود. این بعنوان یک آزمایش اولیه از مصرف این کپسول در آمریکا می باشد (22 ) تاکنون نتایج بسیار کم در طی استفاده از این کپسول گزارش شده است .

Campieri  با بررسی تاثیر 4 گرم Oxadrop (حاوی مخلوطی از لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس[31], لاکتوباسیلوس پلانتاروم[32] ،لاکتوباسیلوس برویس [33]، بیفیدیوباکتر اینفنتیس[34] ، استرپتوکوکوس ترموفیلوس[35] با تعداد10¹¹×4 ) به مدت 30 و 60 روز بروی 6 فرد مبتلا به سنگ اگزالات کلسیم، به ترتیب کاهش 40% و 50% در سطح اگزالات ادراری افراد مشاهده کرد (7). در آزمایشی دیگرLieske  در سال 2005 ، مخلوطی از لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس، لاکتوباسیلوس پلانتاروم ،لاکتوباسیلوس برویس ، بیفیدیوباکتر اینفنتیس ، استرپتوکوکوس ترموفیلوس ( با تعداد 10¹¹×8  ، 10¹¹×16 ، 10¹¹×24 ) را به مدت 4 هفته به 6 فرد مبتلا به هیپراگزالوریا خوراند که کاهش 19% ،24% و 2% در سطح اگزالات ادراری مشاهده کرد (9).

Goldfarb  و همکارانش نیز با اضافه کردن 12 گرمOxadrop  ( مخلوطی از لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس، لاکتوباسیلوس برویس ، بیفیدیوباکتر اینفنتیس ، استرپتوکوکوس ترموفیلوس با تعداد10¹¹×10.8 ) به رژیم غذایی 20 فرد مبتلا به هیپراگزالوریا در طی 4 هفته ، قادر به کاهش 6 درصدی اگزالات ادراری افراد شدند (23).

گزارشات بالا بیانگر آن است که همیشه با افزایش مقدار و تعداد باکتری های پروبیوتیک کاهش بیشتری در سطح اگزالات ادراری افراد مشاهده نمی شود بعبارت دیگر افزایش بیش از حد باکتری ها در دستگاه گوارش می تواند بعنوان یک منع کننده باشد و اثر عکس بر فعالیت تجزیه کنندگی اگزالات توسط باکتری های پروبیوتیک داشته باشد. (28).

در مطالعه ای Okombo  در سال 2010 مخلوطی از 8 نوع باکتری ( لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس، لاکتوباسیلوس پلانتاروم ،لاکتوباسیلوس برویس، بیفیدیوباکتر اینفنتیس، استرپتوکوکوس ترموفیلوس،بیفیدیوباکتر لانگوم ، لاکتوباسیلوس دلبروکئی[36]، لاکتوباسیلوس پاراکزیی با تعداد 10¹¹×8 ) را به روی 11 فرد مبتلا به سنگ کلیه در طی 4 هفته مورد بررسی قرار داد که سطح اگزالات ادراری به میزان 33 درصد کاهش یافت ( 24) . در حالیکه Lieske   با بررسی تاثیر Oxadrop  ( حاوی مخلوطی از لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس، لاکتوباسیلوس برویس ، بیفیدیوباکتر اینفنتیس ، استرپتوکوکوس ترموفیلوس با تعداد 10¹⁰ ×1) بر روی40 فرد مبتلا به هیپراگزالوریا ( در طی 4 هفته ) هیچ تغییری در سطح اگزالات ادراری افراد مشاهده نکرد (25).

Sasikumar   در سال 2014، لاکتوباسیلوس پلانتاروم را بروی محیط کشت حاوی اگزالات آمونیوم کشت داد. این باکتری قادر به تجزیه اگزالات به میزان 77% بود و سپس این باکتری را به رت های مبتلا به سنگ کلیه خوراند که کاهش معناداری در سطح اگزالات ادراری رت ها مشاهده کرد (26).

در آزمایشی دیگرTrunni  با بررسی سویه های لاکتوباسیوس و بیفیدیوباکتر ، مشاهده کرد میزان درصد تجزیه کنندگی اگزالات توسط باکتری های پروبیوتیک در محیط Invivo و   Invitroبه یک میزان نیست. بعبارت دیگر ) در حالیکه در طی مصرف باکتری های پروبیوتیک در انسان کاهش اگزالات ادراری 2 تا 65 درصد ذکر کرده اند که می تواند بدلایل متفاوت از جمله نوع هیپراگزالوریا ، غلظت اگزالات در دستگاه گوارش و وجود مواد مغذی دیگر در دستگاه گوارش ( که باکتری از آن بعنوان ماده مغذی استفاده می کند ) دانست. در حالیکه در محیط کشت های اختصاصی حاوی اگزالات آمونیوم باکتری از اگزالات بعنوان ماده کربنی و مغذی استفاده می کند (11و 26 ) .

علیرغم تاثیر مثبت باکتری های پروبیوتیک با فرمولاسیون Oxadrop و  AKS بر کاهش تشکیل سنگ های ادراری ، این ترکیبات قادر به رفع کامل این سنگ ها و جلوگیری از عود آنها نمی باشد. لذا امروزه ایده استفاده از گیاهان دارویی برای کمک به تجزیه و دفع سنگ های ادراری و کلیوی مطرح شده است (27و28). در این راستا، بهمنی و همکاران با بررسی مصرف گیاهان دارویی موثر بر سنگ کلیه  گیاه خار اشتر، خارخاسک ، کاکل ذرت و گزنه را پر کاربردترین گیاهان موثر بر سنگ کلیه معرفی کرده است (27).

بر اساس پژوهش Zhang  در سال 2014 گیاه گزنه به شدت خاصیت دفع سنگ اگزالات کلسیمی دارد و باعث کاهش سطح اگزالات و کلسیم ادراری در موش های مبتلا به سنگ کلیه می شود (29  ).  با بررسی اثر ضد التهابی گیاه گزنه بر روی رت های آزمایشگاهی ، عصاره این گیاه در غلظت های 50 و 100 میلی گرم سبب کاهش التهاب بافتی به میزان 19 و 24 درصد می شود (34 ). در تحقیقی ، شفایی فر با بررسی تاثیر گیاه خار اشتر بر سنگ کلیه در رت های آزمایشگاهی ، گیاه خار اشتر را بعنوان کاهنده اگزالات ادراری معرفی کرد (30). در مطالعه دیگر با تاثیر کاکل ذرت بر سنگ کلیه در رت های آزمایشگاهی، کاهشی در تشکیل کریستال های اگزالات کلسیم مشاهده گردید . بررسی عیدی و همکاران ، حاکی از آن است که افزایش عصاره کاکل ذرت مانع تشکیل هسته اولیه ( هسته گذاری) سنگ های کلیوی می شود (31و32).

Hariprasath  با بررسی فعالیت سنگ شکنی خارخاسک بر روی رت های مبتلا به سنگ کلیه مشاهده کرد که مقدار 100 میلی گرم از عصاره خارخاسک می تواند کراتینین، اسید اوریک و اوره سرمی و ادراری را به سطح نرمال  کاهش دهد و از طرف دیگر، مقدار اگزالات ادراری در رت های مبتلا به سنگ کلیه را نیز کاهش دهد (33). در پژوهشی دیگر با خوراندن همزمان عصاره خارخاسک و کاکل ذرت به رت های آزمایشگاهی مبتلا به سنگ کلیه ، کاهش معناداری در سطح اگزالات و کلسیم ادراری مشاهده شده است ( 35).

در سال 2012 Otles  و همکارانش در ترکیه با بررسی  ترکیبات فنلیک و مواد تشکیل دهنده عصاره گزنه ((Urtica dioica موادی از جمله  gallic acid,syringic, fumaric, vanillic, isorhamnetin, catechin, caffeic, chlorogenic acid , myricetin,, ellagic acid, ferulic, and naringin. These standards have statistical discrepancy.را شناسایی کردند.( Otles etal.,2012  ). همچنین مرادی و همکاران در سال 2017 در مطالعه ای با بررسی ترکیبات گیاه گزنه با روش کروماتوگرافی گازی (GC) مهمترین ترکیبات در عصاره گزنه را بیست ماده که  برترین آنها را Dibutyl phtaleate ،, Neophytadiene، Bis(2-ethyl hexyl) maleate ، 1,2 - benzenedi carboxylic acid ،Phtaleic acid گزارش دادند (Moradi etal.,2017).

Breu  سال 2008 اظهار می دارد که خارخاسک[37] از جمله گیاهانی است که ریشه و برگ آن از قدیم الایام موارد استعمال زیادی از جمله برطرف کننده عطش، مدر، دافع سنگ های کلیه و مثانه می باشد. مواد موثره این گیاه آلکالوئید، پلی فنول­ها، ساپیونین، استروئیدها و گلیکوزیدها همچنین ترکیبات خاص استروئیدی است (etal.,2008  Breu).

    Solihahو Suzuki با بررسی ترکیبات و مواد موثره کاکل ذرت (Zea mays) ، مهمترین ترکیبات در عصاره هیدروالکلی کاکل ذرت را flavonoids, alkaloids, phenols, steroids, glycosides, carbohydrates, terpenoids , tannins و saponin گزارش دادند. (etal.,2012  Solihah). (etal.,2008  Suzuki)

Loizzo و همکارانش در سال 2014 درطی آنالیز و بررسی ترکیبات عصاره خاراشتر ، ترکیبات اصلی آن را  flavonoids ، Tamarixtin 3-O-dirhamnoside,isorhamnetin 3-O-glucosylneohesperidoside, isorhamnetin 3-O-robinoside, isorhamnetin 3-O-rotinoside , quercetin 3-Orhamnoside, kampferol 3-O-galactoside , quercetin3,7-diglycoside, isorhamnetin3-rutinoside, daidzein7,4-dihydroxyisoflavone,calycisin 3 -hydroxyformononetin, isorhamnetin , tamarxtin , aglycones, kaempferol, chrysoeriol, chrysoeriol-7-O-  ,kaempferol-3-galactorhamnoside and isorhamnetin  O -dapio- furanosyl-_-d-galactopyranosideگزارش دادند. (etal.,2014  Loizzo).

 (کدورت باکتری ها  بر حسب CFU/ml می باشد.)

1. متغیرهای ادراری[1] ، سرمی[2] و آنالیز ادراری[3] در بین گروههای دریافت کننده باکتری های پروبیوتیک ( با کدورت  10¹¹ ) و کنترل منفی در زمان های اندازه گیری[4] در موش های مبتلا به سنگ کلیه اختلاف دارد.
2. متغیرهای ادراری ، سرمی و آنالیز ادراری بین گروههای دریافت کننده عصاره گیاه گزنه ( با غلظت موثره  ) و کنترل منفی در زمان های اندازه گیری در موش های مبتلا به سنگ کلیه اختلاف دارد.
3. متغیرهای ادراری ، سرمی و آنالیز ادراری بین گروههای دریافت کننده عصاره گیاه خارخاسک   ( با غلظت موثره  ) و کنترل منفی در زمان های اندازه گیری در موش های مبتلا به سنگ کلیه اختلاف دارد.
4. متغیرهای ادراری ، سرمی و آنالیز ادراری بین گروههای دریافت کننده عصاره گیاه کاکل ذرت ( با غلظت موثره  ) و کنترل منفی در زمان های اندازه گیری در موش های مبتلا به سنگ کلیه اختلاف دارد.
5. متغیرهای ادراری، سرمی و آنالیز ادراری  بین گروههای دریافت کننده همزمان عصاره گیاه گزنه، خارخاسک، کاکل ذرت ( با غلظت موثره  ) و کنترل منفی در زمان های اندازه گیری در موش های مبتلا به سنگ کلیه اختلاف دارد.
6. متغیرهای ادراری ، سرمی و آنالیز ادراری بین گروههای دریافت کننده عصاره گیاه گزنه ( با غلظت موثره  ) و باکتری پروبیوتیک (با  کدورت 10¹¹) و کنترل منفی در زمان های اندازه گیری در موش های مبتلا به سنگ کلیه اختلاف دارد.
7. متغیرهای ادراری ، سرمی و آنالیز ادراری بین گروههای دریافت کننده عصاره گیاه خارخاسک ( با غلظت موثره  ) و باکتری پروبیوتیک (با  کدورت 10¹¹) و کنترل منفی در زمان های اندازه گیری در موش های مبتلا به سنگ کلیه اختلاف دارد.
8. متغیرهای ادراری ، سرمی و آنالیز ادراری بین گروههای دریافت کننده عصاره گیاه کاکل ذرت ( با غلظت موثره) و باکتری پروبیوتیک (با  کدورت 10¹¹) و کنترل منفی در زمان های اندازه گیری در موش های مبتلا به سنگ کلیه اختلاف دارد.
9. متغیرهای ادراری، سرمی و آنالیز ادراری  بین گروههای دریافت کننده همزمان عصاره گیاه گزنه، خارخاسک ( با غلظت  موثره ) و باکتری پروبیوتیک (با  کدورت 10¹¹) و کنترل منفی در زمان های اندازه گیری  در موش های مبتلا به سنگ کلیه اختلاف دارد.
10. متغیرهای ادراری، سرمی و آنالیز ادراری  بین گروههای دریافت کننده همزمان عصاره گیاه گزنه ، کاکل ذرت ( با غلظت موثره  ) و باکتری پروبیوتیک (با  کدورت 10¹¹) و کنترل منفی در زمان های اندازه گیری  در موش های مبتلا به سنگ کلیه اختلاف دارد.
11. متغیرهای ادراری، سرمی و آنالیز ادراری  بین گروههای دریافت کننده همزمان عصاره گیاه خارخاسک، کاکل ذرت ( با غلظت موثره  ) و باکتری پروبیوتیک (با  کدورت 10¹¹) و کنترل منفی در زمان های اندازه گیری  در موش های مبتلا به سنگ کلیه اختلاف دارد.
12. متغیرهای ادراری، سرمی و آنالیز ادراری  بین گروههای دریافت کننده همزمان عصاره گیاه گزنه، خارخاسک، کاکل ذرت ( با غلظت موثره  ) و باکتری پروبیوتیک (با  کدورت 10¹¹) و کنترل منفی در زمان های اندازه گیری  در موش های مبتلا به سنگ کلیه اختلاف دارد.
13. فرض بر این است که بین مواد موثره عصاره گیاه گزنه و کاهش اگزالات ادراری ارتباط معناداری وجود دارد.
14. فرض بر این است که بین مواد موثره عصاره گیاه کاکل ذرت و کاهش اگزالات ادراری ارتباط معناداری وجود دارد.
15. فرض بر این است که بین مواد موثره عصاره گیاه  خارخاسک و کاهش اگزالات ادراری ارتباط معناداری وجود دارد.
     

ارزیابی تاثیر همزمانی مصرف باکتری پروبیوتیک تجزیه کننده اگزالات و عصاره گیاه موثر  بر کاهش اگزالات ادراری  به روی رت های آزمایشگاهی      

 (تمامی کدورت باکتری ها بر حسب CFU/ml می باشد.)

1. مقایسه متغیرهای ادراری[1] ، سرمی[2] و آنالیز ادراری[3] در بین گروههای دریافت کننده باکتری های پروبیوتیک ( با کدورت  10¹¹ ) و کنترل منفی در زمان های اندازه گیری[4] در موش های مبتلا به سنگ کلیه .
2. مقایسه متغیرهای ادراری ، سرمی و آنالیز ادراری بین گروههای دریافت کننده عصاره گیاه گزنه ( با غلظت موثره  ) و کنترل منفی در زمان های اندازه گیری در موش های مبتلا به سنگ کلیه .
3. مقایسه متغیرهای ادراری ، سرمی و آنالیز ادراری بین گروههای دریافت کننده عصاره گیاه خارخاسک   ( با غلظت موثره  ) و کنترل منفی در زمان های اندازه گیری در موش های مبتلا به سنگ کلیه .
4. مقایسه متغیرهای ادراری ، سرمی و آنالیز ادراری بین گروههای دریافت کننده عصاره گیاه کاکل ذرت ( با غلظت موثره  ) و کنترل منفی در زمان های اندازه گیری در موش های مبتلا به سنگ کلیه .
5. مقایسه متغیرهای ادراری، سرمی و آنالیز ادراری  بین گروههای دریافت کننده همزمان عصاره گیاه گزنه، خارخاسک، کاکل ذرت ( با غلظت موثره  )  و کنترل منفی در زمان های اندازه گیری  در موش های مبتلا به سنگ کلیه اختلاف دارد.
6. مقایسه متغیرهای ادراری ، سرمی و آنالیز ادراری بین گروههای دریافت کننده عصاره گیاه گزنه ( با غلظت موثره  ) و باکتری پروبیوتیک (با  کدورت 10¹¹) و کنترل منفی در زمان های اندازه گیری در موش های مبتلا به سنگ کلیه .
7. مقایسه متغیرهای ادراری ، سرمی و آنالیز ادراری بین گروههای دریافت کننده عصاره گیاه خارخاسک ( با غلظت موثره  ) و باکتری پروبیوتیک (با  کدورت 10¹¹) و کنترل منفی در زمان های اندازه گیری در موش های مبتلا به سنگ کلیه .
8. مقایسه متغیرهای ادراری ، سرمی و آنالیز ادراری بین گروههای دریافت کننده عصاره گیاه کاکل ذرت ( با غلظت موثره  ) و باکتری پروبیوتیک ( با  کدورت 10¹¹) و کنترل منفی در زمان های اندازه گیری در موش های مبتلا به سنگ کلیه .
9. مقایسه متغیرهای ادراری، سرمی و آنالیز ادراری  بین گروههای دریافت کننده همزمان عصاره گیاه گزنه، خارخاسک ( با غلظت  موثره ) و باکتری پروبیوتیک (با  کدورت 10¹¹) و کنترل منفی در زمان های اندازه گیری  در موش های مبتلا به سنگ کلیه .
10. مقایسه متغیرهای ادراری، سرمی و آنالیز ادراری  بین گروههای دریافت کننده همزمان عصاره گیاه گزنه ، کاکل ذرت ( با غلظت موثره  ) و باکتری پروبیوتیک (با  کدورت 10¹¹) و کنترل منفی در زمان های اندازه گیری  در موش های مبتلا به سنگ کلیه .
11. مقایسه متغیرهای ادراری، سرمی و آنالیز ادراری  بین گروههای دریافت کننده همزمان عصاره گیاه خارخاسک، کاکل ذرت ( با غلظت موثره  ) و باکتری پروبیوتیک (با  کدورت 10¹¹) و کنترل منفی در زمان های اندازه گیری  در موش های مبتلا به سنگ کلیه .
12. مقایسه متغیرهای ادراری، سرمی و آنالیز ادراری  بین گروههای دریافت کننده همزمان عصاره گیاه گزنه، خارخاسک، کاکل ذرت ( با غلظت موثره  ) و باکتری پروبیوتیک (با  کدورت 10¹¹) و کنترل منفی در زمان های اندازه گیری  در موش های مبتلا به سنگ کلیه .
13. بررسی مواد موثره در عصاره گیاه گزنه با استفاده از روش کروماتوگرافی-گازی .
14. بررسی مواد موثره در عصاره گیاه کاکل ذرت با استفاده از روش کروماتوگرافی-گازی.
15. بررسی مواد موثره در عصاره گیاه خارخاسک با استفاده از روش کروماتوگرافی-گازی.

بیمارستان ها و مراکز تحقیقاتی می توانند از نتایج این طرح استفاده کنند.

** اگر اگزالات در طی روند اگزوژنی و اندوژنی در بدن افزایش یابد و مقدار دفعی اگزالات در عرض 24 ساعت در ادرار بیش از 35 میلی گرم باشد را  هیپراگزالوریا[1] گویند. هیپراگزالوریا به دلیل تولید اندوژنی اگزالات و جذب بیش از حد اگزالات روده ای ایجاد می شود که یک ریسک فاکتور اولیه در تشکیل سنگ های اگزالات کلسیمی است 

تجربی و کار  بروی رت های آزمایشگاهی می باشد

  تعداد 14 گروه شش تایی از رت های آزمایشگاهی مورد بررسی و آزمایش قرار می گیرند.

برای رت های آزمایشگاهی مورد مطالعه در این پژوهش :

پژوهش بر روی موش های رت ویستار ( نر ) و بصورت مورد-شاهدی صورت می گیرد. گروه مورد رت هایی هستند که با اگزالات آمونیوم قبل از شروع دوره مبتلا به سنگ کلیه شده اند. شاهد گروهی از رت ها هستند که در طول پژوهش غذای روزانه بدون اگزالات آمونیوم مصرف می کنند.

3- حجم نمونه و روش محاسبه آن:

با توجه به محدودیت نمونه گیری و هزینه ، با توجه به حجم نمونه سایر مقالات، حجم نمونه برای موش های آزمایشگاهی مورد پژوهش با نظر مشاور آمار و طبق مطالعه (Campieri etal.,2001) (Sasikumar.,2014) n=6  (تعداد هر گروه 4 راس و به دلیل ریزش ما طبق نظر مشاور آمار 6 رت در هر گروه ) در نظر گرفته شد. براساس فرمول زیر تعداد رت های هر گروه 44 راس می باشد که از نظر زمان و هزینه امکانپذیر نمی باشد. بر اساس مقالات و پژوهش های دیگران و نظر مشاور آمار هر گروه 6 راس رت نر آزمایشگاهی در نظر گرفته شد .

بر اساس اهداف فرعی نیاز به 12 گروه تیمار ، که در هر گروه 6 راس در نظر گرفته می شود.

(رت های مورد تیمار 72 می باشد) همچنین 6راس رت بعنوان کنترل منفی و 6راس رت بعنوان شاهد  و از طرفی برای ارزیابی غلظت موثره عصاره های گیاهی جمعا 150 راس رت به مدت 1 ماه و طی 5 مرحله آنالیز سرمی و ادراری مورد مطالعه قرار می گیرند.

a=0.05

b=0.05

 گروه  رت های مورد پژوهش که جمعا شامل 14 گروه 6 تایی از رت های نر ویستار می باشد:

1. یک گروه کنترل منفی
2. یک گروه کنترل (شاهد)
3. گروه مداخله:

1. گروهی که  باکتری های پروبیوتیک با کدورت 10¹¹ مصرف می کنند.
2. گروهی که  عصاره گزنه  با غلظت موثره مصرف می کنند.
3. گروهی که  عصاره خارخاسک  با غلظت موثره مصرف می کنند.
4. گروهی که  عصاره کاکل ذرت  با غلظت موثره مصرف می کنند.
5. گروهی که  عصاره سه گیاه ( گزنه، خارخاسک، کاکل ذرت )  با غلظت موثره مصرف می کنند.
6. گروهی که  عصاره گزنه  با غلظت موثره و باکتری های پروبیوتیک با کدورت 10¹¹  مصرف می کنند.
7. گروهی که  عصاره خارخاسک  با غلظت موثره و باکتری های پروبیوتیک با کدورت 10¹¹ مصرف می کنند.
8. گروهی که عصاره  کاکل ذرت  با غلظت موثره  و باکتری های پروبیوتیک با کدورت 10¹¹ مصرف می کنند.
9. گروهی که عصاره گزنه و خارخاسک با غلظت موثره  و باکتری های پروبیوتیک با کدورت 10¹¹ مصرف می کنند.
10. گروهی که عصاره گزنه  و کاکل ذرت با غلظت موثره و باکتری های پروبیوتیک با کدورت 10¹¹  مصرف می کنند.
11. گروهی که  عصاره خارخاسک و کاکل ذرت با غلظت موثره  و باکتری های پروبیوتیک با کدورت 10¹¹ مصرف می کنند.
12. گروهی که  عصاره گزنه  و خارخاسک و کاکل ذرت با غلظت موثره و باکتری های پروبیوتیک با کدورت 10¹¹ مصرف می کنند.

 - روش نمونه گیری ( نحوه تخصیص تصادفی و همسان سازی در صورت لزوم ذکر شود):

نمونه گیری آسان و در دسترس  می باشد.

اطلاعات جهت تحلیل و توصیف داده ها وارد نرم افزارSPSS  می شود و محاسبه توزیع فراوانی، در صد و میانگین ،آنالیز واریانس، انحراف معیار ،آزمون نرمال بودن داده ها، معادل ناپارامتری ، آزمون  آماری کای دو ، One-Way ANOVA و Paried Samples Ttest آزمون توکی انجام خواهد شد . مقادیر P-Value  کمتر از 05/0 از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته خواهد شد.

- ملاحظات اخلاقی:

بر اساس راهنمای اخلاقی پژوهش بر حیوانات ، کدهای 1و2و3و4 در این طرح رعایت خواهد شد.

 آیا تکمیل و اخذ فرم رضایت از افراد مورد پژوهش ضروری است ؟خیر

 سایر موارد ملاحظات اخلاقی در اجرای طرح را ذکر فرمایید:

محدودیتی در اجرای طرح وجود ندارد.  

در اجرای طرح  که بررسی بروی موش های آزمایشگاهی است محدودیت اجرایی وجود ندارد

Herbal medicine, Hyperoxaluria,Oxalate-Degrading Bacteria

1. Finkielstein VA, Goldfarb DS. Strategies for preventing calcium oxalate stones. CMAJ 2006; 174(10): 1407-9.
2. Guimaraes   RL,   Stotz   HU.   Oxalate   production   by Sclerotinia  sclerotiorum  deregulates  guard  cells  during infection. Plant Physiol 2004; 136(3): 3703-11.
3. Lauderdale DS, Thisted RA, Wen M and Favus MJ. Bone mineral density and fracture among prevalent kidney stone cases in the 3rd National Health and Nutrition Examination Survey. J Bone Miner Res 2001; 16(10): 1893-8.
4. Borghi L, Schianchi T, Meschi T, et al. Comparison of two  diets  for  the  prevention  of  recurrent  stones  in idiopathic hypercalciuria. N Engl J Med 2002; 346(2): 77-84.
5. Park S, Pearle MS. Pathophysiology and management of calcium stones. Urol Clin North Am 2007; 34(3): 323-34.
6. Chattopadhyay N. Effects of calcium-sensing receptor on the secretion of parathyroid hormone-related peptide and its impact on humoral hypercalcemia of malignancy. Am J Physiol Endocrinol Metab 2006; 290(5): E761-770.
7. Campieri C, Campieri M, Bertuzzi V, et al. Reduction of oxaluria after an oral course of lactic acid bacteria at high concentration. Kidney Int 2001; 60(3): 1097-105.
8. Allison  MJ, Dawson  KA,  Mayberry WR  and  Foss JG. Oxalobacter  formigenes  gen.  nov,   sp.  nov:  Oxalate- degrading anaerobes that inhabit the gastrointestinal tract. Arch Microbiol 1985; 141(1): 1-7.
9. Lieske JC, Goldfarb DS, De Simone C and Regnier C. Use of a probiotic to decrease enteric hyperoxaluria. Kidney Int 2005; 68(3): 1244-9.
10. Federici F, Vitali B, Gotti R, et al. Characterization and heterologous   expression   of   the   oxalyl   coenzyme   A decarboxylase  gene  from  Bifidobacterium  lactis.  Appl Environ Microbiol 2004; 70(9): 5066-73.
11. Turroni   S,   Vitali   B,   Bendazzoli   C,   et   al.   Oxalateconsumption  by  lactobacilli:  Evaluation  of  oxalyl-CoA decarboxylase  and  formyl-CoA  transferase  activity  in Lactobacillus acidophilus. J Appl Microbiol 2007; 103(5):1600-9.
12. Kwak C, Jeong BC, Lee JH, et al. Molecular identification of  Oxalobacter  formigenes  with  the  polymerase  chain reaction in fresh or frozen fecal samples. BJU Int 2001;88(6): 627-32.
13. Azcarate-Peril MA, Bruno-Barcena JM, Hassan HM and Klaenhammer TR. Transcriptional and functional analysis of oxalyl-coenzyme A (CoA) decarboxylase and formyl- CoA  transferase  genes  from  Lactobacillus  acidophilus. Appl Environ Microbiol 2006; 72(3): 1891-1899.
14. آریاپور، ع و همکاران – 1389– گیاهان دارویی،معطر و صنعتی جنگل ومرتع –آموزش عالی علمی کاربردی کشاورزی
15. پورفخاران ، م و همکاران – 1390 – راهنمای جامع گیاهان دارویی ، جلد دوّم – گنجینه سلامت.
16. Naber KG. Efficacy and safety of the phytotherapeutic drug Canephron® N in prevention and treatment of urogenital and gestational disease: review of clinical experience in Eastern Europe and Central Asia. Res Rep Urol. 2013; 5: 39-46.
17. Safarinejad MR. Adult urolithiasis in a population-based study in Iran: prevalence, incidence, and associated risk factors. Urol Res. 2007;35: 73-82.
18. Nikpay S, Moradi K, Azami M, Otaghi M, Babashahi M, Borji M. of Kidney Stone Different Compositions in Patients Referred to a Lithotripsy Center in Ilam, West of Iran. J Ped. Nephrology 2016;4(3):102-107.
19. Johri N, Cooper B, Robertson W, et al. An update and practical guide to renal stone management. Nephron Clin Pract 2010; 116(3): c159-71.
20. Cornick   NA,    Meyers    AM,  1996. Hyperoxaluria in patients with recurrent calcium oxalate calculi: Dietary and other risk factors. Br J Urol;68(5): 454-8.
21. Kim SC, Coe FL, Tinmouth WW, et al. Stone formation is proportional  to  papillary  surface  coverage  by  Randall's plaque. J Urol 2005; 173(1): 117-9; discussion 119.
22. Lieske JC, Turner ST, Edeh SN(2016). Heritability of dietary traits that contribute to nephrolithiasis in a cohort of adult sibships. J Nephrol;29:45-51.
23. Goldfarb DS, Modersitzki F, Asplin JR. A randomized, controlled  trial  of  lactic  acid  bacteria  for  idiopathic hyperoxaluria. Clin J Am Soc Nephrol 2007; 2(4): 745-9.
24. Okombo J, Liebman m. Probioticinduced reduction of gastrointestinaloxalateabsorption in healthy subjects. Urol Res 2010; 38:169-178.
25. Lieske JC, Tremaine WJ, De Simone C, et al. Diet, but not oral probiotics, effectively reduces urinary oxalate excretion and calcium oxalate supersaturation. Kidney Int 2010;78:1178-85.
26. Sasikumar p, Sivasamy Gomathi, Kolandaswamy Anbazhagan, Albert Abhishek, Eldho Paul,Varadaraj Vasudevan. Recombinant Lactobacillus plantarum expressing and secreting heterologous oxalate decarboxylase prevents renal calcium oxalate stone deposition in experimental rats. Journal of Biomedical Science 2014 21:86.
27. Bahmani M , Babak Baharvand-Ahmadi , Pegah Tajeddini . (2016) Identification of medicinal plants for the treatment of kidney and urinary stones. J Renal Inj Prev. 5(3): 129-133.
28. Mohammadi  M, Erfan Parvaneh E, Zahra Tolou- Ghamari. Clinical Investigation of Levisticum officinale (Lovage) Effectiveness’ in Patients with Cystinuria 2016. J Urol Res 3(6): 1071.
29. Zheng, W., Wang, S.Y., 2014. Antioxidant activity and phenolic compounds in selected herbs. Journal of Agricultural and Food Chemistry 49, 5165–5170
30. Shafaeifar A , Mehrabi S, Malekzadeh J, Jannesar R. Effect of Hydrophilic Extract of AlhagiMaurorum on Ethylene Glycol-Induced Renal.Stone in Male Wistar Rats.2012.Armaghane-danesh, Yasuj University of Original Article.Medical Sciences Journal (YUMSJ)
31. عیدی، م، صادقی پور ع، شاه محمدی پ، بهار م، عیدی ا. 1389 . تاثیر عصاره هیدروالکلی کاکل ذرت بر جلوگیری از تشکیل سنگ های کلیوی اگزالات کلسیمی در موش های آزمایشگاهی. دانش زیستی ایران،شماره  2،ج4 ،ص12-18.

32. عیدی، م،پویان ا ، شاه محمدی پ، بهار م، عیدی ا. 1387. تاثیر عصاره هیدروالکلی کاکل ذرت بر جلوگیری از کریستالیزاسیون اگزالات کلسیم در .In vitro. دانش زیستی ایران،شماره  2،ج3 ،ص12-17.

33. Hariprasath, T. Triveni, A. Spandana, K. Rama Tejaswi, CH. V. S. Pavan Kumar and E. Raj Kumar.. Antiurolithiatic activity of Tribulus terrestris fruits and Punica granatum seeds in ethylene glycol induced rat models. Indo American Journal of Pharm Research.2013:3(6).

34.  Kamboj, M. Aggarwal, S. Puri,¹ and S. K. Singla. 2011.Effect of aqueous extract of Tribulus terrestris on oxalate-induced oxidative stress in rats. Indian J Nephrol. 21(3): 154–159. doi:  10.4103/0971-4065.83727
35. Al-Ali, M., Wahbi, S., Twaij, H., Al-Badr,A., 2003. Tribulus terrestris: preliminary study of its diuretic and contractile effects and omparison with Zea mays. J Ethnopharmacol 85: 257–260.
36. Otles S  and Buket Y  (2012) Phenolic Compounds Analysis of Root, Stalk, and Leaves of Nettle . The ScientificWorld Journal. . Article ID 564367, 12 .
37. Moradi P, Amini K. (2017) Extraction and Identification of Urtica dioica L Extract and Its Antibacterial and Antifungal Properties, J Mazandaran Univ Med Sci; 27 (151): 74- 85.
38. Breu W, Dorsch W.(2008) Allium cepa L (Onion): Chemistry, analysis and pharmacology In: Wagner H, Farnsworth NR eds. Economic and medicinal plants research Vol. 6. London Academic Press:115–147..
39. Solihah, M.A., Wan Rosli, W.I. and Nurhanan, A.R. (2012). Phytochemicals screening and total phenolic content of Malaysian Zea mays hair extracts .International Food Research Journal 19(4): 1533-1538 Journal homepage: http://www.ifrj.upm.edu.my.
40. Suzuki R,   Iijima M,   Okada Y, Okuyama T.(2008) Chemical Constituents of the Style of Zea mays L. with Glycation Inhibitory Activity . Chem. Pharm. Bull. 55(1) 153—155.
41.  Loizzo M,Rashedb K, Saidb A,Bonesi M (2014).Antiproliferative and antioxidant properties of Alhagi maurorum Boiss (Leguminosae) aerial parts. Industrial Crops and Products 53 . 289– 295.
42. Sidhu H, Allison MJ, Chow JM.(2001). Rapid reversal of hyperoxaluria in a rat model after probiotic administration of Oxalobacter formigenes. J Urol;166:1487–91.

43. Mohsenimasoleh A , Rostamzad A , Naraki M , Emyiazi G , Sadeghifard N (2015) Effect of Ammoniphilus oxalaticus DIM Bacterium on Reducing the Risk of Hyperixaluria Induced by Ammonium Oxalate in Wistar Rat. Scientific Journal of Ilam University of Medical Sciences.6(26)51-61

44. Mahdavi S, Isazadeh A, Haj Azimian S, Moghtaran Bonab N, Shekar F, et al. Isolation of Lactobacillus Species from Domestic Dairy Products of Mahabad City, Int J Infect. 2018;5(1):e62152. doi: 10.5812/iji.62152.
45. Navidghasemizad S, Hesari J, Saris P, Nahaei MR. Isolation of lactic acid bacteria from Lighvan cheese, a semihard cheese made from raw sheep milk in Iran. Int J Dairy Technol. 2009;62(2):260-4.
46. Edalatian MR, Najafi MBH, Mortazavi SA, Alegria A, Nassiri MR, Bassami MR. Microbial diversity of the traditional Iranian cheeses Lighvan and Koozeh, as revealed by polyphasic culturing and culture-independent approaches. Dairy Sci Technol. 2012;92(1):75-90.

 Zhang H , Li N , Li K , Li P .2014. Protective effect of Urtica dioica methanol extract against experimentally induced urinary calculi in rats.  ;10(6):3157-62. doi: 10.3892/mmr.2014.2610

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

 .