اثر درمان فاز 1 پریودنتال بر نسبتRANKL به OPG بزاق در پریودنتیت مزمن شدید

در جلوگیری از پیشرفت بیماری پریودنتال و از دست رفتن دندان از طریق کاهش تخریب استخوان و حذف عواملی که سرآغاز تحلیل استخوان اند.

بیماری پریودنتال یکی از شایع ترین عفونت های باکتریایی مزمن انسانی است که بافت های حمایت کننده دندان را درگیر می کند و از علل اصلی از دست رفتن دندان در بزرگسالان است (1).

این بیماری باعث تخریب پیشرونده یPDL و استخوان آلوئل همراه با تشکیل پاکت یا تحلیل لثه و یا هر دو می شود( 2و3).  تخریب استخوان آلوئولار علت اصلی از دست رفتن دندانها به حساب می آید . ارتفاع استخوان آلوئول توسط تحلیل و تشکیل استخوان و تعادل بین این دو فرآیند است که به طور دایم ثابت نگه داشته می شود(4). تحلیل استخوان آلوئول ثبات بلند مدت سیستم دندانی را به مخاطره می اندازد و در نگهداری دندانها ایجاد اختلال می نماید. این مسأله دندانپزشکان را برای تشخیص زود هنگام این سیر تخریبی و حذف عواملی که سرآغاز تحلیل استخوان می باشد برانگیخته است(5).

بیماری پریودنتال دارای دو جز مجزا اما در ارتباط با هم می باشد: باکتری ها و مدیاتور های التهابی میزبان. پاتوژن های پریودنتال هم به صورت مستقیم باعث تولید مولکول های فعال زیستی می شوند که روی بافت میزبان اثر می گذارند و هم  باعث تحریک تولید مدیاتورهای التهابی میزبان می شوند که منجر به تخریب بافت و استخوان می شود (6).

عدم تعادل بین پلاک میکروبی و سیستم ایمنی میزبان باعث تولید زیاد سایتوکاین های التهابی و تخریب بعدی ساختار استخوان می شود. تخریب استخوان حمایت کننده دندان نشانه اصلی پریودنتیت است. استئوکلاست ها سلول های اصلی تخریب استخوان اند(7). مکانیسم اصلی در فعالیت استئوکلاست ها مربوط به اثر متقابل فاکتورهای نکروز دهنده توموری  (TNF)یعنی RANKL ,RANK, OPG می باشد(8).

(Receptor Activator for Nuclear Factor Kappa B Ligand) RANKL مستقیما به RANK  روی سطح پری استئوکلاست ها متصل می شود و باعث تمایز این سلول ها و فعالیت استئوکلاست بالغ می شود(7). در نقطه مقابل استئوپروتگرین(OPG) پروتئینی است که به وسیله اتصال به لیگاند فعال کننده گیرنده هسته ای RANK موجود بر روی استئوکلاست ها از اتصال RANKL به گیرنده مربوطه ممانعت به عمل می آورد و باعث تغییر در فعالیت های سلولی استئوکلاست ها و به دنبال آن ممانعت استئوکلاست ها از تخریب استخوان می گردد و لذا کاهش آن سبب پیشرفت بیماری پریودنتال می گردد (9). در بیماری پریودنتال نسبت RANKL به OPG افزایش می یابد (10).

بزاق منبع بسیار خوبی بوده و به آسانی جمع‏آوری می‏شود و حاوی نشانگرهای موضعی و سیستیک و همچنین آنزیم‏ها و محصولات آنزیمی و ایمونولوژیک متفاوتی می‏باشد. این بیومارکرها بسیار گسترده بوده و در مقالات بر نقش آنها با بیماری پریودنتال تاکید شده است و لذا به نظر می‏رسد که با تنظیم این بیومارکرها بتوان راه حل قابل قبولی را برای حل مشکلات پریودنتال فـراهم ساخت. یکی از ایـن بیومارکـرها اسـتئوپروتگرین (OPG) می‏باشد. تحقیقات مختلف نتایج متفاوتی را در زمینه تأثیر استئوپروتگرین بر فرایند التهابی و بیماری پریودنتال ذکر کرده‏اند.(9)

Hassan و همکاران (2015) اثر جراحی پریودنتال را بر مایع شیار لثه ایی، بزاق و بافت لثه در دو گروه افراد سالم و افراد مبتلا به پریودنتیت مزمن در قبل از جراحی، سه و 6 ماه پس از جراحی نشان دادند. نتایج نشان داد که میزان OPG در بزاق و مایع شیار لثه ایی به طور قابل توجهی در گروه شاهد بالاتر از افراد بیمار در ابتدا بود. در گروه بیمار، سطح OPG در مایع شیار لثه ایی، نمونه بزاق، و لثه نشان داد که افزایش قابل توجهی در 3 و 6 ماه پس از جراحی در مقایسه با مقدار پایه وجود داشت(8).

Bostanci و همکاران (2011) تغییرات RANKL،  OPG و نسبت آنها را در مایع شیار لثه بیماران مبتلا به پریودنتیت پس از درمان پریودنتال غیر جراحی بررسی کردند و نشان دادند که با وجود بهبود علائم بالینی نسبت RANKL / OPG  بدون تغییر باقی ماند(10).

Miller و همکاران (2006) در مطالعه ایی که بر روی بزاق بیماران پریودنتیت مزمن متوسط تا شدید به روش الیزا انجام دادند نشان دادند که ارتباطی بین OPG و شاخص‏های پریودنتال وجود نداشت .(11)

با توجه به نتایج متناقض در مطالعات و از آن جایی که پریودنتیت مزمن شایع‏ترین نوع پریودنتیت بوده و نمونه‏های جنرالیزه آن به راحتی در دسترس می‏باشد، لذا این مطالعه بر روی این بیماران و جهت بررسی بیشتر ارتباط بین نسبت RANKL به OPG بزاق و بیماری پریودنتیت صورت خواهدگرفت.

انجام درمان فاز 1 پریودنتال و فالوآپ بیماران

نسبتRANKL به OPG بزاق در افراد سالم و افراد مبتلا به بیماری پریودنتیت قبل از درمان متفاوت است.

نسبتRANKL به OPG بزاق در افراد سالم با افراد مبتلا به بیماری پریودنتیت 4 هفته بعد از درمان بیماری پریودنتال متفاوت است.

تعیین اثر درمان فاز 1 پریودنتال بر نسبتRANKL به OPG بزاق در پریودنتیت مزمن شدید

1. تعیین نسبتRANKL به OPG بزاق در افراد سالم
2. تعیین نسبتRANKL به OPG بزاق در بیماران پریودنتال قبل از درمان
3. تعیین نسبتRANKL به OPG بزاق در بیماران پریودنتال 4 هفته بعد از درمان
4. مقایسه نسبتRANKL به OPG بزاق در بیماران پریودنتال قبل از درمان و 4 هفته بعد از درمان
5. مقایسه نسبتRANKL به OPG بزاق در افراد سالم و بیماران پریودنتال

 سازمانها و مراکز بهداشتی و درمانی

استئوپروتگرین: استئوپروتگرین یکی از اعضای خانواده ی فاکتور نکروز توموری-الفا TNF-α (Tumor necrosis factor alpha) است که بوسیله ی استئوبلاست ها، سلول های بنیادی مزانشیمال، سلول های اندوتلیال، سلول های چربی، سلول های مزانشیمال مغز استخوان تولید می شود. این پروتئین، از طریق گیرنده هایی، در نهایت به کاهش تولید و تمایز استئوکلاست ها و در نتیجه، به کاهش بازجذب استخوانی منجر می گردد(12).

RANKL (Receptor Activator for Nuclear Factor K B Ligand) :مولکولی است که در متابولیسم استخوان بسیار حائز اهمیت است . این مولکول طبیعی و لازم بر روی سطح استئوبلاست ها وجود داشته و باعث فعال شدن استئوکلاست ها می شود (16).

بیماری پریودنتال: یک بیماری التهابی بافت های پشتیبانی کننده ی دندان است که توسط ریزجانداران خاص ایجاد شده و به تخریب پیشرونده ی PDLو استخوان آلوئول همراه با تشکیل پاکت یا فرسودگی لثه و یا هر دو می انجامد (13).

مطالعه طولی (کوهورت)

بیماران مراجعه کننده به بخش پریودونتولوژی دانشکده دندانپزشکی زاهدان، پس از معاینه و تائید متخصص مربوطه،برای آنها چارت پریودنتال(ضمیمه شماره 1) پر می گردد. در صورت تشخیص پریودنتیت مزمن شدید،وارد مطالعه می شوند.

افراد سالم از بین همراهان مراجعه کنندگان انتخاب خواهند شد. از این افراد شرح حال اخذ شده و پس از معاینه بالینی وارد مطالعه می شوند. افراد گروه سالم از نظر بالینی نباید هیچگونه علامت دال بر التهاب لثه داشته و شاخص پلاک آنها  10%و PD مساوی یا کمتر از 3 میلی متر داشته باشند(18).

معیار های ورود در گروه بیمار

1. بیماران پریودنتیت شدید مزمن با CAL مساوی یا بیشتر از 5 میلی متر
2. از لحاظ سیستمیک سالم
3. عدم مصرف دارو یا آنتی بیوتیک در 3 ماه گذشته
4. عدم دریافت درمان پریودنتال در یک سال گذشته(8)

معیار های خروج گروه بیمار

1. بارداری
2. بیمارانی با کمتر از 22 دندان دائمی
3. افراد سیگاری (8)

معیار های ورود در گروه کنترل

1. نداشتن التهاب لثه
2. شاخص پلاک 10 درصد
3. PD مساوی یا کمتر از 3 میلی متر (18)

با استفاده از فرمول

n = (Z_1-α/2 + Z_1-β)² ×(s₁² +s₂²) / (μ₁ – μ₂)²

و در نظر گرفتن 0.05 α= و0.2 =β و اطلاعات بدست آمده از مطالعات قبلی(8) 15 نفر بیمار و 15نفر شاهد بررسی خواهند شد.

آسان و در دست. بیماران مراجعه کننده به بخش پریودونتولوژی دانشکده دندانپزشکی زاهدان، پس از معاینه و تائید متخصص مربوطه،برای آنها چارت پریودنتال(ضمیمه شماره 1) پر می گردد. در صورت تشخیص پریودنتیت مزمن شدید،وارد مطالعه می شوند.

افراد سالم از بین همراهان مراجعه کنندگان انتخاب خواهند شد. از این افراد شرح حال اخذ شده و پس از معاینه بالینی وارد مطالعه می شوند. افراد گروه سالم از نظر بالینی نباید هیچگونه علامت دال بر التهاب لثه داشته و شاخص پلاک آنها  10%و PD مساوی یا کمتر از 3 میلی متر داشته باشند(18).

اطلاعات افراد شرکت کننده شامل سن و جنس در فرم اطلاعاتی ثبت می شود (ضمیمه شماره 2).

پس از پر کردن چارت پریودنتال(ضمیمه شماره 1) ،تأیید تشخیص بالینی بیماری انجام خواهد شد.

نمونه بزاق از هر 2 گروه جمع آوری شده و آزمایشات بر روی آنها صورت خواهد گرفت.

در این مطالعه طولی(کوهورت) 15 بیمار مبتلا به پریودنتیت و 15 فرد سالم مورد بررسی قرار خواهند گرفت. ابتدا در مورد طرح تحقیقاتی یاد شده به شرکت کنندگان هر دو گروه  توضیح داده شده و از آنها رضایت نامه ی کتبی دریافت خواهد گردید.

گروه بیمار: بیماران بر اساس اندازه گیری های عمق پروبینگ توسط پروب ویلیامز و سطح چسبندگی کلینیکی و علائم بالینی التهاب، وجود بیماری پریودنتیت درآنها تشخیص داده خواهد شد. بیمارانی که دارای CAL≥5mm ، وجود تحلیل استخوان در رادیوگرافی در حداقل 5 دندان در حداقل 2 کوادرانت، وجود علائم التهاب لثه شامل خونریزی حین پروبینگ و تغییر رنگ لثه به عنوان بیمار مبتلا به پریودنتیت شدید در نظر گرفته خواهد شد. (8)

گروه کنترل: افراد سالم از نظر پریودونتال که دارای عمق پروبینگ کمتر از 3 میلی متر در تمامی دندان ها،  PI=10%بودند و از نظر بالینی علائم التهاب لثه وجود نداشت وارد مطالعه خواهند شد. (18)

نمونه بزاق جهت اندازه گیری سطح استئوپروتگرین از افراد دو گروه، در جلسه اول و 4 هفته پس از درمان SRP جمع آوری خواهد شد. 

سپس افراد گروه بیمار تحت درمان فاز یک پریودنتال قرار خواهند گرفت. به همین منظور تمامی بیماران تحت درمان جرم گیری به همراه صاف کردن سطح ریشه و بروساژ قرار خواهند گرفت.  که بدین منظور از وسایل دستی، اولتراسونیک و رابر کپ به همراه خمیر پروفیلاکسی استفاده خواهد شد.

جمع آوری بزاق: بهترین روش گرد آوری بزاق روش غیر تحریکی است، چون در روش تحریکی ممکن است عناصری در بزاق ترشح شود که ترکیب کیفی آن تغییر یابد(13).

بزاق غیرتحریکی به روش spitting  جمع آوری میگردد. به این ترتیب که از شرکت کنندگان خواسته می شود 90 دقیقه قبل از نمونه گیری از خوردن، آشامیدن و مسواک زدن بپرهیزند. همه نمونه ها بین ساعت 9 تا 11 صبح جمع آوری خواهد شد. هنگام جمع آوری نمونه ها فرد در حالت نشسته بوده و کمی به سمت جلو خم شده و بزاق خود را در مدت 10 دقیقه و در هر دقیقه 1-2 بار در لوله آزمایش (گاما کانتر) که از قبل استریل شده، خالی می کند.(17) بزاق به میزان 3 میلی لیتر از هر فرد گردآوری می شود(13). این روش، گردآوری بزاق غیرتحریکی نامیده میشود که روش قابل اعتمادی برای آزمایش محتویات بزاق است (14).

بزاق تهیه شده در دمای در دمای 70- درجه نگهداری خواهد شد تا زمانی که تست ELISA انجام گیرد.

اندازه گیری OPG و RANKL به روش الایزا:

برای اندازه گیری سطح بزاقی OPG و RANK از روش ELISA استفاده خواهد شد.

در مرحله آنالیز آزمایشگاهی ابتدا نمونه های بزاق بعد از رسیدن به دمای اتاق به مدت چهار دقیقه با دور شش هزار برای رسوب دادن ترکیبات موجود در بزاق که نتیجه آزمایش را مخدوش می کنند، سانتریفوژ می شوند. سپس نمونه ها و استانداردها در چاهکهایی که قبلا با انتی بادی های OPG و RANK در کیت های مربوطه پوشیده شده اند ، توزیع می گردد. مراحل کار طبق دستورالعمل کیت انجام خواهد شد و نهایتا میزان جذب شده در هر چاه در طول موج450 نانومتر خوانده خواهد شد و با توجه به آن غلظت OPG و RANK تعیین می گردد (16).

مقایسه و متغیرهای مورد مطالعه توسط نرم افزار SPSS20  مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار خواهد گرفت.  جهت مقایسه گروهها از آزمون تی تست و تی جفت استفاده خواهد شد.

جدول مقایسه نسبتRANKL به OPG در افراد سالم و بیمار قبل و بعد از درمان

راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی در جمهوری اسلامی ایران، راهنمای عمومی: کدهای 1، 2، 3، 4، 5، 6، 7، 8، 9 و11.

راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی در جمهوری اسلامی ایران، فصل 4 (زیست بانک ها): کدهای 1، 2، 3 و 4.

راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی در جمهوری اسلامی ایران کد های 1، 2، 3، 4، 5، 6، 7، 8، 10، 11، 12، 13، 14، 15، 16، 17، 18، 19، 25، 27، 28، 29، 30، 31

-عدم رضایت فرد برای شرکت در مطالعه

راه حل:توضیح اینکه نمونه گیری در شرایط استاندارد و با رعایت کامل اصول بهداشتی صورت میگیرد. بیمار برای طرح تحقیقاتی هزینه ای پرداخت نخواهد کرد.نتایج آزمایشها و روشهای به کار رفته به اطلاع شما خواهد رسید.نتایج کاملا محرمانه و صرفا جهت مقاصد پژوهشی به کار خواهد رفت و هویت شما محرمانه خواهد ماند.

Periodontal, RANKL to OPG ratio, Treatment

1. Su F, Liu s, Ma J, Wang D, Ling-E L, Liu H. Enhancement of periodontal tissue regeneration by transplantation of osteoprotegerin-engineered periodontal ligament stem cells. Stem Cell Research & Therapy ,2015; 6:22
2. Shum I, Leung PC, Kwok A, Corbet EF, Orwoll ES, Phipps KR, et al. Periodontal conditions in elderly men with and without osteoporosis or osteopenia. J Periodontol 2010;81:1396–1402
3. Payne WA, Page RC, Ogilvie AL, Hall WB. Histopathological features of the initial and early stages of experimental gingivitis in man. J Periodontal Res, 1975; 10: 51-64.
4. Carranza FA, Newman MG. Takei HH. Clinical periodontology. 10th ed. Philadelphia: W.B. Saunders; 2006, 454-467.
5. Schwartz Z, Goultshin J, Dean DD, Boyan BD. Mechanisms of alveolar bone destruction in periodontitis. Periodontol 2000 1;14:158–172
6. Abdelhamid A.I. Effect of Periodontal Therapy Using Minocycline Gel On Gingival Crevicular Fluid Osteoprotegerin In Chronic Periodontitis. J Am Sci 2012;8(7):821-829
7. Sarlati F, Sattari M, Razzaghi Sh, Nasiri M. Receptor activator of nuclear factor kappa B ligand and osteoprotegerin levels in gingival Crevicular fluid. Dental Research Journal 2012
8. Sandy H.S.Hassan, Mahmoud I. El-Refai, Noha A. Ghallab, Rehab Fawzy Kasem, and Olfat G. Shaker. Effect of Periodontal Surgery on Osteoprotegerin Levels in Gingival Crevicular Fluid, Saliva, and Gingival Tissues of Chronic Periodontitis Patients. Hindawi Publishing Corporation Disease Markers 2015; Article ID 341259.
9. Jahangirneghad M, Yousefimanesh H, Vesali M. Evaluation of Osteoprotegrin Concentration in the Saliva of patients with Generalized Moderate Chronic Periodontitis. J Mash Dent Sch 2013; 36(4): 279-84.
10. Bostanci N, Saygan B, Emingil G, Atilla G, Belibasakis G N. Effect of periodontal treatment on RANKL and OPG levels and relative ratio in gingival Crevicular fluid. Journal of Clinical Periodontology.2011; 38(5):428-433.
11. Miller CS, King CP JR, Langub MC, Kryscio RJ, Thomas MV. Salivary biomarkres of existing periodontal disease: A cross-sectional study. J Am Dent 2006; 137(3): 322-9.
12. Witasp A, Carrero JJ, Hammarqvist F, Qureshi AR, Heimburger O, Schalling M, et al. Expression of osteoprotegerin in human fat tissue; implications for chronic kidney disease. Eur J Clin Invest 2011; 41(5): 498-506.
13. Newman MG, Takei HH, Carranza AF. Clinical Periodontology. 9th ed., W.B. Saunders Co.; Philadelphia: 2006. p. 104-109, 498-500, 506-511.
14. Bretz WA, Loesche WJ, Chen YM, Schork MA, Dominguez BL, Grossman N. Minor salivary gland secretion in the elderly. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2000; 89: 696-701.
15. Glick M, Greenberg M. Burket’s oral medicine, diagnosis and treatment. 11th ed., Hamilton: BC Decker Inc; 2008. p. 206-217.
16. Ghasemi M, Sattari M, Khamseh M E, Kavoli S. Relationship of salivary RANKL and OPG with periodontal disease in type 1 diabetic patients. The Journal of Islamic Dental Association of IRAN (JIDA) . 2011; 23 (2) :95-103
17. Agha-Hosseini F, Mirzaii-Dizgah I, Moghadda P, Akrad Z. Stimulated whole salivary flow rate and composition in menopausal women with oral dryness feeling. Oral disease 2007; 13(3): 320-3
18. Sadeghi R ,Nazari Moghaddam K ,Jooyandeh J. Clinical evaluation of endodontic     therapy on periodontal tissue healing in chronic advanced periodontitis. Journal of dentistry. Tehran University of medical sciences(Vol. 17; No3;2004)

در این تحقیق نمونه بزاق در دو مرحله قبل ازدرمان و 4 هفته پس از درمان از بیماران دو گروه دریافت خواهد شد . بیماران پریودنتیت تحت درمان غیر جراحی قرار خواهند گرفت.  نمونه گیری از شما تحت شرایط استاندارد و با رعایت کامل اصول بهداشتی صورت می گیرد آسیبی متوجه شما نخواهد بود.

درمان بیماران پریودنتیت

ندارد.

هزینه های مربوط به انجام طرح تحقیقاتی به عهده مجری طرح خواهد بود و بیمار هزینه ای پرداخت نخواهد کرد.

نتایج آزمایشها و روشهای به کار رفته به اطلاع شما خواهد رسید و این نتایج بصورت کاملاً محرمانه و صرفاً جهت مقاصد پژوهش به کار خواهد رفت و هویت بیماری شمادر چارچوب قانون و جامعه و خانواده محرمانه خواهد ماند.

-

شرکت شما در مطالعه کاملاً اختیاری است و آزاد خواهید بود که از شرکت در مطالعه امتناع نموده یا هر زمان که مایل باشید بدون آنکه تغییری در نحوه رفتار پزشک درمانگر یا نحوه درمان و مراقبت از بیماری اینجانب ایجاد شود از پژوهش مذکور خارج شوید.

با توجه به اطلاعات موجود در این فرم و توضیحات حضوری مجری یا همکاران طرح موافقت خود را با شرکت در این مطالعه اعلان می نمایم. یک نسخه از این فرم به من داده شده و فرصت خواندن آن را داشته ام.

 ضمیمه شماره 2:پرسشنامه

کد فرد شرکت کننده: ............................

سالم* بیمار*

نمونه مورد مطالعه:

بزاق* خون* بافت*

سن: .................... سال

جنس:

مؤنث* مذکر*

نسبتRANKL به OPG قبل از درمان............................................

نسبتRANKL به OPG بعد از درمان..............................................