تعیین ژنوتیپ های A و B ژیاردیا دئودنالیس باروش PCR-RFLP در بین بیماران مراجعه کننده به مراکز درمانی شهرستان زاهدان

استان سیستان و بلوچستان و بخصوص مناطقه سیستان (شهرستان زابل و زهک)

ژیاردیازیس، بوسیله انگل ژیاردیا دئودنالیس که یک تک یاخته تاژکدار روده ای است، ایجاد می شود. این تک یاخته در بخش های ابتدایی روده باریک میزبانان مهره دار نظیر انسان و حیوانات اهلی و وحشی یافت می شود (1). بر اساس تفاوت در خصوصیات مورفولوژی و میزبان اختصاصی چندگونه ژیاردیا توصیف شده است که شامل ژیاردیا دئودنالیس، ژیاردیا موریس، ژیاردیا آژیلیس، ژیاردیا آردئا، ژیاردیا پسیتاسی، ژیاردیا میکروتی هستند. در بین آن ها ژیاردیا دئودنالیس (مترادف ژیاردیا اینتستینالیس، ژیاردیا لامبلیا) تنها گونه ای است که در انسان یافت می شود (10). این انگل در چرخه زندگی خود دو شکل دارد، یکی فرم ترو فوزوئیت تاژ ک دار که در قسمت فوقانی روده باریک زندگی می کند و مسئول ایجاد علایم بالینی می باشد و فرم دیگر کیست های دو و چهار هسته ای می باشد که همراه مدفوع میزبان دفع شده و درمحیط هفته ها باقی می مانند. انتقال این بیماری از شخص به شخص یا از طریق مصرف آب و غذای آلوده صورت می گیرد. این تک یاخته از تمام نقاط جهان گزارش شده اما در مناطق گرمسیر و نقاطی که امکانات بهداشتی کم و جمعیت زیاد است شیوع بیش تری دارد (5) این انگل انتشار جهانی داشته و بیشترین شیوع آن در مناطق گرمسیر و نیمه گرمسیر بویژه در شرایط بهداشتی ضعیف و تراکم بالای جمعیت می باشد (1). در آسیا، افریقا و امریکای لاتین در حدود 200 میلیون نفر مبتلا به ژیاردیازیس می باشند، و سالانه 500 هزار مورد جدید گزارش می شود (2). شیوع ژیاردیازیس در بخش های مختلف ایران 5 تا 25 درصد بوده و شیوع این بیماری در مناطق روستایی استان سیستان و بلوچستان 2/6 درصد گزارش شده است (3،4). علائم بالینی متنوع بوده و از عفونت های بدون علائم تا اسهال مزمن متغیر است (5). موارد علامت دار معمولا همراه با ضعف، کاهش وزن، اسهال آبکی، مدفوع بد بو، اسهال چرب یا استئاتوره ، کرامپ شکمی، نفخ شکم، آروغ زدن، تهوع، استفراغ و سندرم سوءجذب می باشد (5،6). در مورد ریسک فاکتور های ژیاردیازیس اطلاعات اندکی وجود دارد و شامل وضعیت سیستم ایمنی ، سن ، جنس ، شرایط محیطی ، شرایط اجتماعی اقتصادی ، شغل ، شرایط تغذیه ای و اخیرا انواع اسمبلیج ها می باشد (6،7). از سوی دیگر، انتقال عفونت ژیاردیا در ایران احتمالاً از هر دو راه انسان به انسان و حیوان به انسان انجام می شود و احتمال زئونوز بودن ژیاردیا لامبلیا نیز درایران مطرح است. لذا انجام مطالعات جامع روی ایزوله های انسانی و حیوانات مختلف در نقاط مختلف کشور بویژه نقاطی که تحقیقی درآ ن ها صورت نگرفته ضروری به نظر می رسد. مطالعات مولکولی نشان می دهد که ژیاردیا لامبلیا یک گونه کمپلکس است و شامل حداقل 8 اسمبلیج اصلی A تا H می باشد (7،9). بر اساس اطلاعات موجود، اسمبلیج A و B در انسان گزارش شده است. اسمبلیج A به دو زیر گروه I و II تقسیم می شود (12-9، 7). اسمبلیج B نیز به دو زیر گروه III و IV تقسیم می شود. تا کنون فقط AII و BIV در انسان گزارش شده اند (12-9، 7).

نتایج این تحقیق  می تواند راهنمای راه درمان  و تشخیص بیماری انگلی در استان سیستان و بلوچستان (شهرستان زابل و زهک) برای دانشگاههای علوم پزشکی باشد

.

1. توزیع سنی و جنسی مبتلایان به ژیاردیا دئودنالیس در بیماران مورد مطالعه چگونه است؟
2. توزیع فراوانی ژنوتیپ های انگل ژیاردیا دئودنالیس در بیماران مورد مطالعه چگونه است؟
3. توزیع فراوانی ژنوتیپ های انگل ژیاردیا دئودنالیس بر حسب سن و جنس در کودکان مورد مطالعه چگونه است؟

تعیین ژنوتیپ های A و B   ژیاردیا دئودنالیس باروش PCR-RFLدر بین بیماران مراجعه کننده به مراکز درمانی شهرستان زاهدان

1. تعیین توزیع سنی و جنسی مبتلایان به ژیاردیا دئودنالیس در بیماران مورد مطالعه
2. تعیین توزیع فراوانی ژنوتیپ های انگل ژیاردیا دئودنالیس در بیماران مورد مطالعه
3. تعیین توزیع فراوانی ژنوتیپ های انگل ژیاردیا دئودنالیس بر حسب سن و جنس در کودکان مورد مطالعه

1. ​​​دانشگاه علوم پزشکی زاهدان

ژیاردیا: گونه ای از تک یاخته تاژکدار عامل بیماری ژیاردیازیس

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR): روش ملکولی برای تعیین ژنوتایپ و تحت ژنوتایپ انگل

ژن گلوتامات دهیدروژناز (gdh): ژن کاربردی با پلی مورفیسم گسترده برای تعیین ژنوتیپ های انگل

این مطالعه از نوع توصیفی  می باشد.

کلیه افراد مراجعه کننده به آزمایشگاه های مراکز بهداشتی درمانی شهرستان های زاهدان در سال 1396 که به روش روتین و در سه نوبت آزمایش مدفوع آنها مثبت تشخیص داده شده اند.

مراجعین به آزمایشگاه های تشخیص طبی زاهدان که بر طبق برآورد اماری با استفاده از فرمول

(ضریب دقت :d = 0.1 ؛ تعداد نمونه n = ؛ α = 0.05)

با توجه به مطالعات قبلی که توزیع ژنوتیپ A را 67% و ژنوتیپ B را 33% براورد کرده است(28-27) ، لذا با استفاده از فرمول زیر و در نظر گرفتن d = 0.1 و α = 0.05 تعداد 85 نمونه بیمار مبتلا به ژیاردیوزیس انتخاب شده و مورد مطالعه قرار خواهد گرفت.

روش نمونه گیری غیر احتمالی در دسترس می باشد و کلیه مراجعینی که به مراکز بهداشتی و درمانی شهرستان زاهدان مراجعه نموده و شرایط ورود به مطالعه را داشته باشد وارد مطالعه می شوند. و مورد آزمایش مستقیم ( در سه نوبت آزمایش مدفوع ) و روش خالص سازی شیب غلظت سوکروز قرار می گیرند..

جمع آوری نمونه ها به روش مستقیم و روتین و در سه نوبت جمع آوری و آزمایش مدفوع انجام خواهد پذیرفت.

الف) هماهنگی با معاونت محترم پژوهشی و کسب مجوز رسمی از ایشان جهت انجام نمونه گیری از مراکز بهداشتی و درمانی شهر زاهدان

ب) ثبت مشخصات مربوط به هر نمونه

پ) جمع آوری نمونه بصورت روزانه

ت) تغلیظ نمونه ها به روش شناورسازی تغلیظ گرادیان سوکروز (25) تهیه گسترش و رنگ آمیزی ید لوگل و بررسی میکروسکوپی از نظر وجود کیست های ژیاردیا (بررسی روزانه).

ث) نگهداری تمام نمونه ها با مقدار کمی آب مقطر در میکرو تیوپ های 1/5میلی لیتری ودر دمای ۲۰- درجه تا زمان انجام PCR

ج) استخراج DNA با استفاده از کیت استخراج (AccuPrep® stool DNA extraction kit Bioneer, Daejeon, South Korea) به شرح زیر انجام خواهد گرفت.

الف) پیش از استفاده از کیت استخراج دی ان ای، نمونه های حاوی کیست طی ده سیکل (هر بار به مدت 5 دقیقه ذوب و انجماد) پروسه شکست مکانیکی^[1] روی آنها انجام گرفت. جهت انجماد از نیتروژن مایع و برای ذوب از دمای جوش ظرف آب در حال جوش^[2] استفاده گردید. نمونه ها در داخل کرایوتیوب های درب پیچ دار 5/1 میلی لیتر قرار گرفته بودند تا حین تغییرات دمایی نمونه ها از میکروتیوب خارج نشوند (25).

ب) برای این منظور از کیت استخراج دی ان ای و طبق دستورالعمل شرکت سازنده کیت[3] استفاده خواهد شد.

1) 20 میکرولیتر پروتئیناز K به میکروتیوب 1/5 میلی لیتر اضافه نموده.

2) حدود 200 میکرولیتر از نمونه تخلیص شده برداشته و به داخل این میکروتیوب اضافه می نماییم.

3) به این میکروتیوب 200 میکرولیتر بافر لیز کننده[4] اضافه نموده و به مدت 30 ثانیه به آرامی ورتکس نموده تا به خوبی مخلوط شوند.

4) انکوباسیون بصورت اورنایت[5] در دمای °C 60 انجام خواهدگرفت.

5) پس از این مدت، سانتریفیوژ لوله ها به مدت 5 دقیقه در 12000 g انجام گرفته و سوپرناتانت به لوله جدید منتقل خواهد شد.

6) به لوله حاوی سوپرناتانت، 200 میکرولیتر بافر متصل شونده[6] اضافه خواهد شد.

7) انکوباسیون به مدت 10 دقیقه در دمای °C 60 انجام خواهد شد.

8) افزودن 100 میکرولیتر الکل اتانول مطلق یا ایزوپروپانول به لوله و ورتکس سبک به مدت 5 ثانیه انجام خواهد شد.

9) انتقال مایع داخل لوله به ستون های فیلتر دار[7] و قرار دادن آن در میکروتیوب 2 میلی لیتر و سانتریفیوژ به مدت یک دقیقه در 8000 g انجام خواهدگرفت.

10) ستون بیندینگ به میکروتیوب 2 میلی لیتر دیگر منتقل شده و 500 میکرولیتر بافر شستشوی یک[8] اضافه نموده و به مدت یک دقیقه در 8000 g سانتریفیوز خواهدگردید.

11) ستون بیندینگ به میکروتیوب 2 میلی لیتر دیگر منتقل شده و 500 میکرولیتر بافر شستشوی دو[9] اضافه نموده و به مدت یک دقیقه در 8000 g سانتریفیوژ خواهدگردید.

12) ستون بیندینگ را به 5/1 میلی لیتر منتقل کرده و 100-200 میکرولیتر بافر الیوشن[10] اضافه نموده و به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق باقی خواهدماند. الیوشن بافر قبلا تا دمای 70 درجه سانتیگراد باید گرم شده باشد.

13) سپس به مدت یک دقیقه در 13000 g سانتریفیوژ نموده و نمونه ها تا شروع بررسی های ملکولی در دمای °C 20- نگهداری خواهند شد

دی ان ای (DNA) استخراج شده تا زمان انجام واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR) در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری خواهد شد.

چ) طی واکنش زنجیره ای مراز طی دو مرحله سمی نستد پی سی آر (Semi-nested PCR) ژن gdh ایزوله های ژیاردیا تکثیر خواهد شد. ابتدا یک قطعه ۴۵۸ جفت بازی ژن گلوتامات دهیدروژناز با استفاده از پرایمرهای اکسترنال فوروارد (GDHeF) و اکسترنال ریورز (GDHeR) تکثیر و سپس با استفاده از پرایمرهای و اینترنال فوروارد (GDHiF) و اکسترنال ریورز (GDHeR) قطعه 432 جفت بازی تکثیر خواهد شد.

GDHeF: 5'-TCA ACG TYA AYC GYG GYT TCC GT-3'

GDHiF: 5'-CAG TAC AAC TCY GCT CTC GG-3'

GDHeR: 5'-GTT RTC CTT GCA CAT CTC C-3'

موقعیت پرایمرهای فوق بروی سکانس ژن ثبت شده در بانک ژنی (GenBank: L40510)

1 atcttccgcg tgccctggat ggatgacgct ggacgcatca acgtcaaccg cggcttccgt

61 gtccagtaca actctgctct cggcccctac aagggtggcc tccgcttcca cccctctgtc

121 aatctttcga ttctcaagtt cctcggtttc gagcagatcc tgaagaactc cctcaccacg

181 ctcccgatgg gcggcggcaa gggcggctcc gactttgacc caaagggcaa gtccgacaac

241 gaggtcatgc gcttctgcca gtccttcatg accgagctcc agaggcacgt cggcgccgac

301 actgacgttc ctgccggcga catcggcgtc ggcgcccgcg agatcgggta cctgtacgga

361 cagtacaagc gcctgaggaa cgagttcaca ggcgtcctca caggcaagaa cgtcaagtgg

421 ggcgggtcct tcatcaggcc ggaggctacg ggctatggcg ctgtctactt cctggaggag

481 atgtgcaagg acaacaacac tgtgatcagg ggtaagaacg tcctcctttc tggctccggc

541 aacgttgccc agtttgcttg cgagaagctc attcagcttg gcgcaaaggt cctcaccttc

601 tcagactcca acgggaccat tgtcgacaag gatgggttca acgaggagaa gctggctcac

661 ctcatgtacc tcaagaacga gaagcgcggg

شرایط انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز قبلا شرح داده شده است (26).

یک نمونه بعنوان کنترل مثبت و آب مقطر به عنوان کنترل منفی استفاده خواهد گردید.

ح) برش آنزیمی برای تعیین ژنوتایپ ها با آنزیم های محدودالاثر (RFLP)، که برای این منظور از آنزیم های RsaI و BspL I (Nla IV) استفاده خواهد شد (جدول 1). شرایط انجام واکنش قبلا شرح داده شده است (26). آنزیم BspL I جهت افتراق اسمبلاژهای A و B و ساب اسمبلاژهای A-I و A-II بکار می رود. آنزیم Rsa I افتراق ساب اسمبلاژهای B-III و B-IV بکار می رود.

همچنین به منظور تایید نتایج RFLP برخی محصولات PCR ثانویه تعین توالی خواهد شد.

جدول 1-الگوی برش آنزیمی

Rsa I

5´-GT↓AC-3´

5´-AC↑GT-3´

BspL I

5GGN↓NCC3

5CCN↑NGG3

سپس محصولات مذکور روی ژل پلی آکریل آمید برده  و الکتروفورز انجام می شود.

ندارد

  دفتر چه راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش‌های علوم پزشکی  دارای آزمودنی انسانی  در جمهوری اسلامی ایران

کد 1- هدف اصلی هر پژوهش ‌باید ارتقای سلامت انسان‌ها توأم با رعایت کرامت و حقوق ایشان باشد.

کد 13- کسب رضایت آگاهانه و آزادانه در هر پژوهشی که بر روی آزمودنی انسانی اجرا می‌شود، الزامی است. این رضایت باید به شکل کتبی باشد. در مواردی که اخذ رضایت آگاهانه‌ی کتبی غیر ممکن یا قابل صرف‌نظر باشد، باید موضوع با ذکر دلایل به کمیته‌ی اخلاق منتقل شود. در صورت تأیید کمیته‌ی اخلاق، اخذ رضایت کتبی قابل تعویق یا تبدیل به رضایت شفاهی یا ضمنی خواهد بود.

کد 18- در پژوهش‌هایی که از مواد بدنی (شامل بافت‌ها و مایعات بدن انسان)  یا داده‌هایی استفاده می‌شود که هویت صاحبان آن‌ها معلوم یا قابل کشف و ردیابی است، باید برای جمع‌آوری، تحلیل، ذخیره‎سازی و /یا استفاده‌ی مجدد از آن‌ها رضایت آگاهانه گرفته شود. در مواردی که اخذ رضایت غیرممکن باشد یا اعتبار پژوهش را خدشه‌دار کند، می‌توان در صورت بررسی مورد و تصویب کمیته‌ی اخلاق ، از داده‌ها یا مواد بدنی ذخیره شده، بدون اخذ رضایت آگاهانه استفاده کرد.

کد 25- پژوهشگر مسؤول رعایت اصل رازداری و حفظ اسرار آزمودنی‌ها و اتخاذ تدابیر مناسب برای جلوگیری از انتشار آن است. هم‌چنین، پژوهشگر موظف است که از رعایت حریم خصوصی آزمودنی‌ها در طول پژوهش اطمینان حاصل کند. هرگونه انتشار داده‌ها یا اطلاعات به‌دست آمده از بیماران باید بر اساس رضایت آگاهانه انجام گیرد.

کد 27- در پایان پژوهش، هر فردی که به‌عنوان آزمودنی به آن مطالعه وارد شده است، این حق را دارد که درباره‌ی نتایج مطالعه آگاه شود و از مداخلات یا روش‌هایی که سودمندی‌شان در آن مطالعه نشان داده شده است، بهره‌مند شود.

• عدم همکاری بیمار

راه حل : توضیح دادن در مورد منافع این طرح و این که هیچ ضرری متوجه آنان نخواهد شد و اطلاعات آنها به طور محرمانه باقی خواهد ماند و نامشان به هیچ عنوان فاش نخواهد شد.

Giardia duodenalis, Glutamate dehydrogenase (gdh), PCR-RFLP, Zabol

1. Lalle M, Pozio ME, Capelli G, Bruschi F,Crotti D, Caccio SM. Genetic heterogeneity identification of potentially zoonotic subgenotypes. Int J Parasitol .2005.
2. WHO. The World Health Report. Protozoan parasite (cryptosporidium, giardia, cyclospora).1996.
3. Meyer EA. Preface and Editor’s note.Giardiasis. In: Meyer EA: pv, Elsevier.1990.
4. Thompson RCA, Hopkins RM, Homan WL.Nomenclature and genetic groupings of Giardia infecting mammals. Parasitol Today.2000.
5. Topley and Wilson’s. Parasitology. In:Wakelin D, Gillespie SH, Despommier DD,Editors. Microbiology and Microbial Infection.10th ed. London: Arnold press.2005.
6. WHO. The world health report. Fighting disease fostering development. World Health Organization, Geneva. 1996.
7. Aucott J. Nelson text book of pediatrics 14 st ed. Philadelphia: WB Sanunders publisher.1996.
8. Prucca CG, Slavin I, Quiroga R, et al. Antigenic variation in Giardia lambliais regulated by RNA nterference. 2008.
9. Koot BG, ten Kate FJ, Juffrie M, Rosalina I,Taminiau JJ, Benninga MA. Does Giardia lambliacause villous atrophy in children? Aretrospective cohort study of the histological abnormalities in giar-diasis. 2009.
10. Adam RD. Biology of Giardia lamblia. 2001.
11. Monis PT, Mayrhofer G, Andrews RH,Homan WL, Limper L, Ey PL. Molecular geneticanalysis of Giardia intestinalis isolates at the glutamate dehydrogenase locus.Parasitol .1996.
12. Siqi LU, Jianfan W, Jihong L, Fengyun W.DNA sequence analysis of the triosephosphate isomerase gene from isolates of Giardia lamblia.2002.
13. Sulaiman IM, Fayer R, Bern C, Gilman RH,Trout JM, Schantz PM, et al. Triosephosphate isomerase gene characterization and potential zoonotic transmissionof Giardia duodenalis.2003.
14. Thompson RC, Monis PT. Variation in Giardia implication for taxonomy andepidemiology. 2004.
15. Thompson RCA , Meloni BP. Molecular variation in Giardia.1993.

16. EB Kia, M Hosseini, MR Nilforoushan, AR Meamar, M Rezaeian. Study of intestinal protozoan Parasites in Rural Inhabitants of Mazandaran Province, Northern Iran.2008.

17. Sadjjadi SM, Massoud J. Prevalence pattern of Giardia lamblia in the rural areas in the north of Iran. In: Thompson RCA, Reynoldson JA, Lymbery AJ (eds), Giardia from Molecules to Diseases. 1994.
18. Sharifi I, Keshavarz H. The prevalence of intestinal in 1 to 11 year old children in Kerman.1993.
19. Taherkhani H. Prevalence of intestinal parasites in mentally disabled students in Hamadan in 2000. 2002.
20. Molawi G, Mir Ahmadi H, Rezaeian M,Beigom Kia E. Excerpts from Persian medical literature. The prevalence of intestinal parasites in tribal parts of Khuzestan province. 2009.
21. Arbabi M, Doroudgar A, Hoshyar H, Asadi MA. Evaluation of Giardia and Sarcocystis contamination in dog-related animals in Kashan region during the years 1999-2001 Feyz J. 2001.
22. Ranjbar Bahadori Sh, et al. Study of prevalence intestinal parasites in Ghaemshahr.2004.
23. Babaei Z, Oormazdi H, Akhlaghi L, et al.Molecular characterization of the Iranian isolates of Giardia lamblia: application of the glutamate dehydrogenase gene.2008
24. Etemadi S, Zia-Ali N, Babai Z, Fasihi-Harandi M, Zia-Ali A, Salari Z, et al. The Correlation between clinical signs and genotypes of giardia duodenalis isolated from patients with giardiasis in Kerman City.2011.
25. Nahavandi K, Fallah E, Asgharzadeh M,Mirsamadi N, Mahdavipour B. Glutamate dehydrogenase and triosephosphate-isomerase coding genes for detection and genetic characterization of giardia lamblia in human feces by PCR and PCR-RFLP. 2011.
26. Read CM, Monis PT, Thompson RC ,Discrimination of all genotypes of Giardia duodenalis at the glutamate dehydrogenase locus using PCR-RFLP. 2004.
27. Pestechian E.S, Rafiei A, Samarbaf-Zadeh AR, Shayesteh AA, Shamsizadeh A, Pourmahdi Borujeni A . Genotype analysis of Giardia lamblia isolated from children in Ahvaz, South West of Iran. Jundishapur J Microbiol.2014.
28. Roointan N, Rasekh H, Rostami-Nejad M, Yousofi H. Molecular identification of Giardia lamblia; is there any correlation between diarrhea and genotyping in Iranian population? Gastroenterol Hepatol Bed Bench. 2013.

تعیین ژنوتیپ های A و B ژیاردیا دئودنالیس باروش PCR-RFLP در بین بیماران مراجعه کننده به مراکز درمانی شهرستان زاهدان

در این مطالعه خونگیری وجود ندارد و از نمونه مدفوع بیماران مبتلا به ژیاردیا استفاده خواهد شد

تعیین ژنوتایپ انگل ژیاردیا  و اسمبلیج آن می تواند در تکمیل اطلاعات اپیدمیولوژیک و فیلوژنیک بیماری مفید و موثر باشد.

نمونه گیری از بیماران هیج عارضه جانبی به دنبال نخواهد داشت

ندارد

 گرفتن نمونه هیج گونه هزینه ایی برای بیماران نخواهد داشت

ندارد

اطلاعات بیماران در طول مطالعه و پس از آن به صورات محرمانه باقی خواهند ماند

به  تمامی سوالات بیماران که در ارتباط با کار تحقیقاتی هستند پاسخ داده می شود.

بیماران حق پذیرفتن و با انصراف از شرکت در مطالعه را خواهند داشت

به صورت کتبی از بیماران رضایت گرفته خواهد شد

فرم اطلاعاتی پایان نامه تحقیقاتی تعیین ژنوتیپ های A و B ژیاردیا دئودنالیس باروش PCR-RFLP در بین بیماران مراجعه کننده به مراکز درمانی شهرستان زاهدان