بررسی بیان MicroRNA-21 در نمونه های پارافینه فیکس شده با فرمالین گاستریت مزمن، متاپلازی روده ای، دیسپلازی و آدنوکارسینوم معده

مراکز تحقیقاتی

سرطان یکی از علل اصلی مرگ در سراسر جهان و بدون توجه به سطح درآمد کشورهای مختلف است. به گونه ای که در کشورهای توسعه یافته و درحال توسعه به ترتیب اولین و دومین عامل مرگ می باشد. میزان مرگ و میر این بیماری بالغ بر 8/8 میلیون مرگ در سال 2015 بوده است(1-3). و طبق برآورد های سازمان بهداشت جهانی (WHO) انتظار می رود تعداد موارد جدید این بیماری در حدود دو دهه آینده در حدود 70 درصد افزایش یابد(3). آدنوکارسینوم معده شایعترین نوع بافت شناسی (95%) بدخیمی های نشات گرفته از معده است. علیرغم کاهش بروز آدنوکارسینوم معده در 50 سال گذشته در سطح جهان، این بیماری هنوز سومین علت مرگ و میر ناشی از سرطان پس از سرطان های ریه و کبد می باشد و بار سنگینی را به جوامع تحمیل کرده است(2, 4-6). پیش آگهی این نوع سرطان معمولا ضعیف است(7). به نحوی که در سال 2012، از حدود 951،000 نفر مبتلا به سرطان معده در سراسر جهان 723000 نفر در اثر این بیماری جان خود را از دست دادند(2). سرطان معده به عنوان یک بیماری چند عاملی و ناهمگن با ویژگی های مختلف بافت شناسی (فنوتیپی) و ژنوتیپی محسوب می شود. که به علت عوامل محیطی و ژنتیکی موازی هم ایجاد می گردد. در میان ریسک فاکتورهای زیست محیطی برای سرطان معده، عفونت با باکتری هلیکوباکتر پیلوری نقش عمده ای ایفا می کند. همچنین برخی گزارش ها حاکی از آن است که عواملی همچون عفونت با ویروس اپشتاین بار (EBV)، قرار گرفتن در معرض دیگر مواد سرطان زا، شیوه زندگی، الگوی تغذیه، نوع و محتوای مواد غذاهای مصرفی، میزان دسترسی و مصرف سبزیجات تازه، روش های نگهداری مواد غذایی، کم خونی فقر آهن، سیگار کشیدن و در نهایت  عوامل ژنتیکی از اهمیت ویژه ای برخوردار هستند(2, 6, 8-14). با این حال، بهبود استانداردهای زندگی و آموزش بهتر درمورد این عوامل خطر کمک عمده ای به کاهش بروز آدنوکارسینوم معده کرده است(15). عقیده برآن است که سرطان معده از طریق یک سری از ضایعات پیشرونده در مخاط معده آغاز می شود. این ضایعات سبب تغییرات ژنوتیپی و فنوتیپی در مخاط معده به صورت گاستریت مزمن، متاپلازی روده ای و دیسپلازی شده و نهایتا به آدنوکارسینوم معده منتهی می گردد(16-19).

کشف میکروریبونوکلئیک اسیدها (microRNA یا miRNA) فرصت های جدیدی برای درک پاتوفیزیولوژی و زیست شناسی مولکولی سرطان معده ایجاد کرده است. microRNA ها، RNA های 19-25 (به طور متوسط 22) نوکلئوتیدی غیرکدکننده ای هستند که دارای عملکردهای فیزیولوژیکی و پاتولوژیکی مختلفی می باشند. با توجه به عملکرد microRNA ها در اتصال به میکروریبونوکلئیک اسید پیام رسانِ (mRNA) هدف و جلوگیری از ترجمه mRNA این مولکول ها به عنوان تنظیم کننده های بیان ژن پس از رونویسی شناخته می شوند. microRNA ها در بسیاری از فرآیندهای بیولوژیکی مهم مانند توسعه، تمایز سلولی و پیام رسانی سلولی نقش دارند(20-23).

microRNA ها می تواند به عنوان ژن های سرکوبگر تومور و یا انکوژن ها نیز عمل کنند و در نتیجه رشد و پیشرفت سرطان را تعدیل نمایند(24-26). بر همین اساس اعتقاد بر این است که microRNA ها نقش مهمی در روند کارسینوژنز سرطان های مختلف ایفا کرده و نه تنها می توانند نقش کلیدی در تمام جنبه های روند سرطان زایی داشته باشند؛ بلکه به عنوان یک بیومارکر تشخیصی و یک هدف درمانی نیز تلقی می گردند(27-33). مطالعات اخیر نیز در مورد microRNA ها نشان داده است که بسیاری از microRNA ها به طور قابل توجهی در سرطان معده دچار dysregulation می شود(6, 34, 35).  گزارش ها حاکی از آن است که microRNA-21 نقش مهمی در پاتوژنز و پیشرفت سرطان معده داشته و سطوح بالاتری از این microRNA در بیماران مبتلا به سرطان معده دیده شده است. از همین رو microRNA-21 می تواند به عنوان یک بیومارکر بالقوه در تشخیص، تعیین پیش آگهی و درمان بیماران مورد استفاده قرار گیرد(36, 37).

مطالعات گوناگونی نشان داد که آدنوکارسینوم معده در نتیجه تغییرات ژنوتیپی و فنوتیپی در مخاط معده به صورت گاستریت مزمن، متاپلازی روده ای و دیسپلازی ایجاد می گردد(16, 17, 38-41).

مطالعه ای در سال 2012 افزایش بیان microRNA-21 را در متاپلازی روده ای گزارش کرد(42).

از سویی دیگر نتایج مطالعه Treece و همکاران وی، افزایش بیان microRNA-21 در سرطان معده در مقایسه با بافت مخاطی طبیعی را نشان داد(43).

مطالعه Zeng و همکارانش در سال 2013 از نظر تشخیص سرطان معده توسط microRNA-21، برای این مولکول حساسیت 5/66٪ (3/76٪ -0/55٪) و ویژگی 1/83٪ (4/91٪ -9/69٪) برآورد کرد این درحالیست که این مقادیر در مطالعه Ren و همکارانش در سال2017 برابر حساسیت 74/0 (79/0-69/0) و ویژگی 81/0(86/0-76/0) محاسبه شد(36, 44).

 نتایج چندین متاآنالیز نیز نشان داده است که microRNA-21 می تواند یک شاخص زیست شناختی مهم در پیش آگهی سرطان های مختلف باشد(45-47).

  با توجه به شیوع بالای سرطان معده در منطقه سیستان و بلوچستان، ایران و جهان؛ و از آنجایی که علیرغم بهبودی در درمان آندوسکوپی، جراحی و سیستمیک میزان بقای 5 ساله جهانی، همچنان نامطلوب (حدود 25 تا 30 درصد) است و با در نظر گرفتن این که در ایران روشی به عنوان غربالگری برای سرطان معده استفاده نمی شود و با در نظر داشتن هزینه های سرسام آور طول دوره درمان بیماران سرطانی، رنج و مشقتی که این بیماران متحمل می شوند و آمار کم موفقیت درمان این بیماران  ناشی از تشخیص دیر هنگام و آگاهی از بیماری در مراحل پیشرفته بیماری می باشد این در حالی است که بیماران مبتلا به سرطان معده در مراحل ابتدایی، پیش آگهی خوب قابل توجهی و میزان survival 5 ساله نزدیک به 90 درصد دارند. لذا مسلما نیاز مبرمی به انجام مطالعات گسترده ای در زمینه روش های تشخیصی زودهنگام این نوع سرطان احساس می شود. استفاده از روش های ساده تر با امکان کاربرد بالینی که به تشخیص زودهنگام و یا به موقع و تعیین پیش آگهی بیماری بیانجامد، باعث می شود که با غربالگری های اولیه کم هزینه تر  از پیشرفت بیماری های زمینه ای در جهت ابتلا به سرطان معده جلوگیری نموده و از صرف هزینه های درمانی هنگفت توسط بیماران و مراکز درمانی کاسته شود. به این ترتیب گامی در جهت انجام اقدامات پیشگیری و درمانی مناسب، تعدیل هزینه ها در روند درمان این بیماران و سلامت هرچه بیشتر جامعه  برداشته می شود. بر همین اساس در مطالعه حاضر میزان بیان microRNA-21 در بیماران مبتلا به گاستریت مزمن، متاپلازی روده ای، دیسپلازی و آدنوکارسینوم معده تعیین می شود.

نتایج حاصل می تواند MicroRNa-21 را به عنوان بیومارکری جهت تشخیص سرطان معده در مراحل اولیه شروع بیماری معرفی کند.

میزان بیان MicroRNA-21 در نمونه های پارافینه فیکس شده با فرمالین گاستریت مزمن، متاپلازی روده ای، دیسپلازی و آدنوکارسینوم معده در مقایسه با گروه کنترل متفاوت است.

تعیین میزان بیان MicroRNA-21 در نمونه های پارافینه فیکس شده با فرمالین گاستریت مزمن، متاپلازی روده ای، دیسپلازی و آدنوکارسینوم معده و مقایسه با گروه کنترل.

تعیین و مقایسه میزان بیان MicroRNA-21 در نمونه های گاستریت مزمن و گروه کنترل.

تعیین و مقایسه میزان بیان MicroRNA-21 در نمونه های پارافینه متاپلازی روده ای و گروه کنترل.

تعیین و مقایسه میزان بیان MicroRNA-21 در نمونه های پارافینه دیسپلازی معده و گروه کنترل.

تعیین و مقایسه میزان بیان MicroRNA-21 در نمونه های پارافینه آدنوکارسینوم معده و گروه کنترل.

موسسات آموزشی، پژوهشی و درمانی مراکز خدمات بهداشتی-درمانی، آزمایشگاه های تشخیص طبی و مراکز آموزشی تحقیقاتی پزشکی

دیسپلازی : رشد یا تکامل غیرطبیعی بافت یا اندام به صورت حضور سلول های غیر طبیعی در داخل بافت، که ممکن است یک مرحله قبل از ایجاد سرطان باشد.

متاپلازی : یک تغییر قابل برگشت است که در آن یک سلول بالغ (اپی تلیال یا مزانشیمال) جانشین سلول بالغ دیگری از همان نوع می شود.

واکنش زنجیره ای پلیمراز ترانس کریپتاز معکوس کمی (QRT-PCR)،(RT-PCR)quantification reverse transcription polymerase chain reaction :یکی از انواع روش های واکنش زنجیره ای پلیمراز است که برای شناسایی میزان بیان RNA استفاده می شود.

مورد-شاهدی

گروه مورد:

نمونه بیوپسی پارافینه فیکس شده با فرمالین بیماران مبتلا به گاستریت مزمن، متاپلازی روده ای، دیسپلازی و آدنوکارسینوم معده موجود در بخش پاتولوژی بیمارستان علی ابن ابیطالب (ع) زاهدان مربوط به 5 سال اخیرمورد بررسی قرار می گیرند. در مجموع 4 گروه همسان سازی شده از نظر سن و جنس شامل، گاستریت مزمن، متاپلازی روده ای، دیسپلازی و آدنوکارسینوم معده خواهیم داشت. 

معیار های خروج: نمونه های مربوط به افراد با سابقه اختلال ایمنی و نمونه های فاقد اطلاعات لازم از مطالعه خارج خواهند شد.

گروه شاهد:

لازم به ذکر است از قسمت های سالم دور از محل ضایعه بافتی یا نمونه های نرمال بافت معده که از نظر سن و جنس با نمونه های پاتولوژیک همسان سازی شده اند به عنوان گروه شاهد استفاده خواهد شد.

از بین نمونه های بیوپسی پارافینه فیکس شده با فرمالین بیماران مبتلا به گاستریت مزمن، متاپلازی روده ای، دیسپلازی و آدنوکارسینوم معده موجود در آرشیو بخش پاتولوژی بیمارستان علی ابن ابیطالب(ع) زاهدان مربوط به 5 سال اخیر با اطلاعات مورد نیاز ثبت شده در پرونده، مورد شناسایی و گروه بندی قرار گرفته اند انجام می شود. همچنین از قسمت های سالم دور از محل ضایعه بافتی یا نمونه های سالم بافت معده  به عنوان گروه شاهد استفاده خواهد شد. تمامی گروه ها از نظر سن و جنس همسان سازی خواهند شد. براساس مطالعات مشابه تعداد حداقل 20 نمونه در هر گروه وارد مطالعه خواهند شد(38, 39).

نمونه گیری آسان و در دسترس خواهد بود. همچنین از قسمت های سالم دور از محل ضایعه بافتی یا نمونه های سالم بافت معده به عنوان گروه شاهد استفاده خواهد شد. تمامی گروه ها از نظر سن و جنس همسان سازی می گردند.

برای استخراج MicroRNA از کیت (miRNeasy FFPE Kit (Qiagen, USA استفاده می شود. سپس  با استفاده از روش qRTPCR (Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR)  نتایج حاصل از بیان MicroRNA-21 در نمونه های FFPE و میزان آنها را در هریک از گروه های مورد مطالعه بررسی و مورد مقایسه قرار خواهد گرفت.

پس از جمع آوری نمونه های بیوپسی، برای چک کردن صحت تشخیص، تمام نمونه های بیوپسی مربوط به نمونه های بافت سالم معده دور از محل ضایعه بافتی، گاستریت مزمن، متاپلازی روده ای، دیسپلازی و آدنوکارسینوم معده، ابتدا توسط یک پاتولوژیست مجرب مورد بررسی مجدد قرار خواهد گرفت. پس از تایید تشخیص از نمونه های انتخابی مربوط به گروه های مطالعه برش های 10 میکرومتری تهیه می شود. پس از آماده سازی و پارافین زدایی نمونه ها، برای استخراج MicroRNA از کیت (miRNeasy FFPE Kit (Qiagen, USA طبق دستورالعمل شرکت سازنده کیت استفاده می شود. با استفاده ازدستگاه اسپکتروفوتومتر نسبت جذب نوری 280/260  اندازه گرفته و نمونه هایی که بهترین خلوص را دارند(2>280/260 OD >1.8 )در 80- درجه سانتیگراد جهت استفاده در فرایند  QRT-PCR فریز می شوند. برای تعیین میزان بیان  MicroRNA-21 از روش QRT-PCR (Quantification Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) یا واکنش زنجیره ای پلیمراز ترانس کریپتاز معکوس کمی استفاده خواهد شد. در این روش رونویسی معکوس (سنتز cDNA) توسط کیت رونویسی معکوس ساخت شرکت Qiagen آمریکا طبق دستورالعمل شرکت سازنده کیت انجام خواهد شد. تبدیل cDNA به DNA و انجام RT-PCR توسط کیت (QuantiFast SYBR® Green RT-PCR Kit) ساخت شرکت Qiagen آمریکا طبق دستورالعمل شرکت سازنده کیت در هریک از گروه های مورد مطالعه انجام خواهد شد و نهایتا مورد بررسی و مورد مقایسه قرار خواهد گرفت(48, 49).

برای تعیین وجود یا عدم وجود تفاوت معنی دار در میانگین دو گروه مستقل از آزمون t مستقل استفاده خواهیم کرد(Independent student t test). برای اثبات تبعیت داده ها از توزیع نرمال ابتدا آزمون کولموگروف-اسمیرونوف (one sample Kolmogorov–Smirnov test) انجام خواهد پذیرفت. آنالیز واریانس یک طرفه ANOVA و تست Tukeys posthoc برای مقایسه میانگین ها و تفاوت گروه های آزمایشی مورد استفاده قرار می گیرد. جهت مقایسه متغیرهای کمی از آزمون ANOVA و در صورت لزوم تست های نان پارامتریک استفاده خواهد شد.

 در نهایت نتایج به صورت Mean ± SD گزارش می شود. برای آنالیز تمام داده ها و انجام تست های آماری از نرم افزار SPSS ویرایش 20 بهره خواهیم برد. هنگامیکه 05/0P< شود تفاوت ها معنی دار فرض خواهند شد.  

از مقاطع بافتی مربوط به آرشیو بخش پاتولوژی بیمارستان امام علی ابن ابیطالب(ع) استفاده می شود. اطلاعات مستخرج از پرونده نیز بدون ذکر نام مورد استفاده قرار خواهد گرفت(حفظ محرمانگی). با رعایت کدهای 1، 2، 3، 5، 6، 7، 8، از راهنمای عمومی دفترچه راهنمای اخلاق پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی در جمهوری اسلامی.

1- پژوهشگر باید به این امر مهم توجه داشته باشد که بافت‌ها و اعضای مورد استفاده، دارای منشأ انسانی‌اند و کرامت انسانی اقتضا می‌کند که جمع‌آوری، نگه‌داری، استفاده و نابودسازی آن‌ها توأم با رعایت ملاحظات و شؤون مرتبط باشد.

2- از اجزای بدنی دارای منشأ انسانی باید تنها در پژوهش‌هایی استفاده شود که اهداف ارزشمندی را در راستای مبارزه با بیماری‌ها و ارتقای سلامت انسان‌ها دنبال می‌کنند.

3- تمامی پژوهش‌ها بر روی عضو و بافت انسانی، پیش از اجرا، باید مورد تأیید کمیته‌ی اخلاق در پژوهش مرتبط قرار گیرد. کمیته‌ی اخلاق در پژوهش حق دارد که در تمامی مراحل پژوهش بر آن نظارت داشته باشد. پژوهشگران باید در این زمینه با کمیته‌ی اخلاق در پژوهش همکاری کنند.

5- در مواردی که اخذ رضایت آگاهانه از دهنده‌ی نمونه‌ی ذخیره‌شده یا جانشین قانونی او امکان‌پذیر نباشد، به‌شرط وجود رضایت کلی اولیه بر استفاده‌ی پژوهشی، در صورت تأیید کمیته‌ی اخلاق در پژوهش می‌توان از آن نمونه برای پژوهش استفاده کرد. در چنین مواردی باید از نمونه‌هایی استفاده شود که به ‌نحو برگشت‌ناپذیر بی‌نام ‌شده باشد. ‌

6- تمامی اطلاعاتی که از صاحبان عضو یا بافت مورد پژوهش، جمع‌آوری و ثبت می‌شود، راز حرفه‌ای تلقی می‌‌شود؛ از این ‌رو، تمامی اصول و ملاحظات مربوط به رازداری و حفظ حریم شخصی، باید در مورد آن‌ها مراعات شود.

7- مرکز انجام دهنده‌ی پژوهش بر روی عضو و بافت باید مهارت و امکانات لازم برای حفظ رازداری را داشته باشد؛ در غیر این صورت، اطلاعات باید به شکل بی‌نام و غیرقابل ردیابی ثبت و ذخیره شود.

8- پژوهشگر باید از اعضاء و بافت‌هایی که به منظور پژوهش در اختیار او قرار می‌گیرد استفاده‌ی بهینه کرده، از هدر رفتن آن‌ها جلوگیری کند.

1. نقص اطلاعاتی بعضی پرونده ها که با بررسی تعداد بیشتر مواردی که دارای اطلاعات کامل باشند، انتخاب خواهد شد.

2. در صورتی که تعداد مورد نظر بدست نیامد محدوده زمانی مورد بررسی سالهای بیشتری خواهد شد.

3. مشکلات مربوط به تهیه مواد اولیه و تجهیزات آزمایشگاهی مورد نیاز که می توان زودترجهت سفارش و تهیه مواد مورد نیاز اقدام کرد و برای استفاده از برخی تجهیزات به آزمایشگاههای دیگر دانشگاه مراجعه کرد.

4. محدودیت منابع مالی پایان نامه که سعی خواهد شد از مواد گرنت های در دست اجرای استاد راهنما برای انجام این طرح کمک گرفته شود.

آدنوکارسینوم معده، متاپلازی روده ای، MicroRNA-21

Gastric adenocarcinoma; Intestinal metaplasia; MicroRNA-21

1.            Fidler MM, Gupta S, Soerjomataram I, Ferlay J, Steliarova-Foucher E, Bray F. Cancer incidence and mortality among young adults aged 20–39 years worldwide in 2012: a population-based study. The Lancet Oncology. 2017.

2.            Torre LA, Siegel RL, Ward EM, Jemal A. Global cancer incidence and mortality rates and trends—an update. Cancer Epidemiology and Prevention Biomarkers. 2016;25(1):16-27.

3.            WHO. Cancer 2017 [updated February 2017. Fact sheet]. Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/.

4.            Yamamoto H, Watanabe Y, Oikawa R, Morita R, Yoshida Y, Maehata T, et al. BARHL2 Methylation Using Gastric Wash DNA or Gastric Juice Exosomal DNA is a Useful Marker For Early Detection of Gastric Cancer in an H. pylori-Independent Manner. Clin Trans Gastroenterol. 2016;7:e184.

5.            Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M, et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International journal of cancer Journal international du cancer. 2015;136(5):E359-86.

6.            Rugge M, Fassan M, Graham DY. Epidemiology of gastric cancer.  Gastric Cancer: Springer; 2015. p. 23-34.

7.            Allemani C, Weir HK, Carreira H, Harewood R, Spika D, Wang X-S, et al. Global surveillance of cancer survival 1995–2009: analysis of individual data for 25 676 887 patients from 279 population-based registries in 67 countries (CONCORD-2). Lancet (London, England). 2015;385(9972):977-1010.

8.            Umesawa M, Iso H, Fujino Y, Kikuchi S, Tamakoshi A. Salty Food Preference and Intake and Risk of Gastric Cancer: The JACC Study. Journal of Epidemiology. 2016;26(2):92-7.

9.            Fang X, Wei J, He X, An P, Wang H, Jiang L, et al. Landscape of dietary factors associated with risk of gastric cancer: A systematic review and dose-response meta-analysis of prospective cohort studies. European Journal of Cancer. 2015;51(18):2820-32.

10.          Song P, Wu L, Guan W. Dietary Nitrates, Nitrites, and Nitrosamines Intake and the Risk of Gastric Cancer: A Meta-Analysis. Nutrients. 2015;7(12):9872-95.

11.          Sugano K, Tack J, Kuipers EJ, Graham DY, El-Omar EM, Miura S, et al. Kyoto global consensus report on Helicobacter pylori gastritis. Gut. 2015;64(9):1353-67.

12.          Wang Q, Chen Y, Wang X, Gong G, Li G, Li C. Consumption of fruit, but not vegetables, may reduce risk of gastric cancer: Results from a meta-analysis of cohort studies. European Journal of Cancer. 2014;50(8):1498-509.

13.          Zabaleta J. Multifactorial etiology of gastric cancer. Methods in molecular biology. 2012;863:411-35.

14.          Helicobacter, Cancer Collaborative G. Gastric cancer and Helicobacter pylori: a combined analysis of 12 case control studies nested within prospective cohorts. Gut. 2001;49(3):347-53.

15.          Lagergren J, Andersson G, Talback M, Drefahl S, Bihagen E, Harkonen J, et al. Marital status, education, and income in relation to the risk of esophageal and gastric cancer by histological type and site. Cancer. 2016;122(2):207-12.

16.          Wessler S, Krisch LM, Elmer DP, Aberger F. From inflammation to gastric cancer – the importance of Hedgehog/GLI signaling in Helicobacter pylori-induced chronic inflammatory and neoplastic diseases. Cell Communication and Signaling. 2017;15(1):15.

17.          Companioni O, Sanz-Anquela JM, Pardo ML, Puigdecanet E, Nonell L, García N, et al. Gene expression study and pathway analysis of histological subtypes of intestinal metaplasia that progress to gastric cancer. PloS one. 2017;12(4):e0176043.

18.          Ende AR, Higa JT, Singla A, Choi AY, Lee AB, Whang SG, et al. Mo1330 Gastric Intestinal Metaplasia, Dysplasia, and Gastric Cancer in a U.S. Tertiary Care Population &#x2013; Who&#x2019;s At Risk? Gastrointestinal endoscopy. 2016;83(5):AB459.

19.          Rugge M, Capelle LG, Cappellesso R, Nitti D, Kuipers EJ. Precancerous lesions in the stomach: from biology to clinical patient management. Best Practice & Research Clinical Gastroenterology. 2013;27(2):205-23.

20.          Svetoni F, De Paola E, La Rosa P, Mercatelli N, Caporossi D, Sette C, et al. Post-transcriptional regulation of FUS and EWS protein expression by miR-141 during neural differentiation. Human Molecular Genetics. 2017:ddx160.

21.          Iorio MV, Croce CM. MicroRNA dysregulation in cancer: diagnostics, monitoring and therapeutics. A comprehensive review. EMBO molecular medicine. 2017;9(6):852-.

22.          Catalanotto C, Cogoni C, Zardo G. MicroRNA in Control of Gene Expression: An Overview of Nuclear Functions. International journal of molecular sciences. 2016;17(10):1712.

23.          Hammond SM. An overview of microRNAs. Advanced drug delivery reviews. 2015;87:3-14.

24.          Karatas OF, Wang J, Shao L, Ozen M, Zhang Y, Creighton CJ, et al. miR-33a is a tumor suppressor microRNA that is decreased in prostate cancer. Oncotarget. 2017;8(36):60243.

25.          Zhou K, Liu M, Cao Y. New Insight into microRNA Functions in Cancer: Oncogene–microRNA–Tumor Suppressor Gene Network. Frontiers in Molecular Biosciences. 2017;4:46.

26.          Hahn SA, Zoellner H, Maghnouj A, Vangala DB. U2 small nuclear RNA as a biomarker in cancer. Biomarkers in Cancer. 2015:233-50.

27.          Mahmoudian-Sani M-R, Mehri-Ghahfarrokhi A, Shojaeian A, Asadi-Samani M, Luther T. The role of microRNAs in human cancers. Immunopathologia Persa. 2017;4(1).

28.          Feliciano A, Garcia-Mayea Y, Jubierre L, Mir C, Hummel M, Castellvi J, et al. miR-99a reveals two novel oncogenic proteins E2F2 and EMR2 and represses stemness in lung cancer. Cell Death Dis. 2017;8:e3141.

29.          James S, Aparna JS, Paul AM, Lankadasari MB, Mohammed S, Binu VS, et al. Cardamonin inhibits colonic neoplasia through modulation of MicroRNA expression. Scientific Reports. 2017;7(1):13945.

30.          Previdi MC, Carotenuto P, Zito D, Pandolfo R, Braconi C. Noncoding RNAs as novel biomarkers in pancreatic cancer: what do we know? Future Oncology. 2016;13(5):443-53.

31.          Peng Y, Croce CM. The role of MicroRNAs in human cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2016;1:15004.

32.          Hayes J, Peruzzi PP, Lawler S. MicroRNAs in cancer: biomarkers, functions and therapy. Trends in molecular medicine. 2014;20(8):460-9.

33.          Wang W, Luo Y-p. MicroRNAs in breast cancer: oncogene and tumor suppressors with clinical potential. Journal of Zhejiang University Science B. 2015;16(1):18-31.

34.          Xu L, Hou Y, Tu G, Chen Y, Du Y-e, Zhang H, et al. Nuclear Drosha enhances cell invasion via an EGFR-ERK1/2-MMP7 signaling pathway induced by dysregulated miRNA-622/197 and their targets LAMC2 and CD82 in gastric cancer. Cell death & disease. 2017;8(3):e2642.

35.          Wu WK, Cho CH, Lee CW, Fan D, Wu K, Yu J, et al. Dysregulation of cellular signaling in gastric cancer. Cancer Lett. 2010;295.

36.          Ren J, Kuang TH, Chen J, Yang JW, Liu YX. The diagnostic and prognostic values of microRNA-21 in patients with gastric cancer: a meta-analysis. European review for medical and pharmacological sciences. 2017;21(1):120-30.

37.          Wu J, Li G, Wang Z, Yao Y, Chen R, Pu X, et al. Circulating microRNA-21 is a potential diagnostic biomarker in gastric cancer. Disease markers. 2015;2015.

38.          Heidari Z, Mahmoudzadeh-Sagheb H, Narouei M. Quantitative changes of gastric mucosa during carcinogen-esis using stereological methods. JOURNAL OF BUON. 2017;22(4):905-10.

39.          Mahmoudzadeh Sagheb H, Heidari Z, Jahantigh M, Narouei M. Immunohistochemical Expression of p53 and Ki-67 Genes in Gastric Cancer and Precancerous Lesions in the Patients with Helicobacter pylori Infection. Gene Cell Tissue. 2016;3(4).

40.          Li D, Bautista MC, Jiang S-F, Daryani P, Brackett M, Armstrong MA, et al. Risks and predictors of gastric adenocarcinoma in patients with gastric intestinal metaplasia and dysplasia: a population-based study. The American journal of gastroenterology. 2016.

41.          Song H, Ekheden IG, Zheng Z, Ericsson J, Nyrén O, Ye W. Incidence of gastric cancer among patients with gastric precancerous lesions: observational cohort study in a low risk Western population. BMJ. 2015;351:h3867.

42.          Shiotani A, Murao T, Uedo N, Iishi H, Yamanaka Y, Kamada T, et al. Eradication of H. pylori did not improve abnormal sonic hedgehog expression in the high risk group for gastric cancer. Digestive diseases and sciences. 2012;57.

43.          Treece AL, Duncan DL, Tang W, Elmore S, Morgan DR, Dominguez RL, et al. Gastric adenocarcinoma microRNA profiles in fixed tissue and in plasma reveal cancer-associated and Epstein-Barr virus-related expression patterns. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 2016;96(6):661-71.

44.          Zeng Z, Wang J, Zhao L, Hu P, Zhang H, Tang X, et al. Potential Role of microRNA-21 in the Diagnosis of Gastric Cancer: A Meta-Analysis. PloS one. 2013;8(9):e73278.

45.          He X-Y, Liao Y-D, Guo X-Q, Wang R, Xiao Z-Y, Wang Y-G. Prognostic role of microRNA-21 expression in brain tumors: a meta-analysis. Molecular neurobiology. 2016;53(3):1856-61.

46.          Wang Y, Zhang Y, Pan C, Ma F, Zhang S. Prediction of poor prognosis in breast cancer patients based on microRNA-21 expression: a meta-analysis. PloS one. 2015;10(2):e0118647.

47.          Xie Y, Wu J. MicroRNA-21 as prognostic molecular signatures in oral cancer: a meta-analysis. International journal of clinical and experimental medicine. 2017;10(7):9848-56.

48.          Notghi P, Khorrami S, Vazini H. The Expression of MicroRNA-146a in Adenomatous Polyps and Colorectal Cancer. Journal of Mazandaran University of Medical Sciences. 2015;25(128):10-7.

49.          Savad S, Mehdipor P, Shirdast H, Nekoohesh L, Shirkoohi R, Nikoui V, et al. MiR-520d expression analysis in breast cancer. Tehran University Medical Journal. 2013;71(2):90-5.