مقایسه تکنیک های الایزا و RDT در غربالگری و بررسی فراوانی عفونت افراد ایرانی بدون علامت به پلاسمودیوم ویواکس با تکنیک های LAMP و Nested – PCR در مناطق پر خطر استان سیستان و بلوچستان در سال 1398- 1397

مالاریا مهمترین بیماری عفونی خونی است که توسط تک یاخت هایی از جنس پلاسمودیوم ایجاد می شود، از نظر بهداشتی و درمانی از اهمیت جهانی برخوردار است، بعد از سل و ایدز سومین بیماری عفونی مهم و یکی از هشت بیماری مطرح شده در برنامه های سازمان بهداشت جهانی تحت عنوان پژوهش بیماریهای گرمسیری می‌باشد (1). مالاریا بیش از 40% جمعیت جهان را تهدید می کند. حدود 97 کشور در دنیا جز مناطق اندمیک مالاریا محسوب می شوند که عمدتا' در مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری جهان قرار دارند.تعداد افراد در معرض خطر در حدود 2/3 میلیارد نفر برآورد شده است. طبق آمار ارائه شده سازمان بهداشت جهانی در سال 2015، 214 میلیون مورد در سال گزارش شده که از این میان 438 هزار مرگ به ثبت رسیده است که اکثر آنها مربوط به کودکان زیر 5 سال می باشد (2).

ایران با قرار گرفتن در منطقه معتدل شمالی، 40 -25 درجه عرض شمالی و 64 – 44 درجه طول شرقی و شرق مدیترانه با داشتن آب و هوای متنوع در منطقه اندمیک نقشه جهانی گسترش مالاریا قرار دارد استان سیستان و بلوچستان از مناطق مالاریاخیز کشور بوده و این بیماری سال ها به صورت هیپراندمیک در بخش های مختلف آن وجود داشته است. مناسب بودن شرایط آب و هوایی و رطوبت در تمام طول سال جهت فعالیت ناقلین و هم جواری با کشورهای پاکستان و افغانستان و همچنین با استان هرمزگان که یکی دیگر از مهمترین کانون مالاریای کشور است از جمله عوامل تاثیرگذار بر وضعیت مالاریا در این استان است به طوری که 90% موارد شناسایی شده در ایران متعلق به استان می باشد. در طی سال های اخیر با اجرای برنامه کنترلی در زمینه مالاریا، بروز موارد سالیانه این بیماری از 11460 مورد در سال 87 به 799 در سال 94 رسیده است ( 2،3،4).

تأثیر مالاریا از یک طرف بر روی وضعیت سلامت و بهداشت جامعه و از طرف دیگر اثرات اجتماعی و اقتصادی آن بر روی توسعه کشورها، باعث شده تا این بیماری در کانون توجه سازمان های بین المللی قرار گیرد و برنامه ای جامع برای اجرای کنترل مالاریا در سطح وسیع و بصورت پیشرونده (کشور به کشور) ، حذف منطقه ای و در نهایت ریشه کنی جهانی آن تدوین شود به دنبال موفقیت های که کشور ایران طی سال های اخیر در کاهش موارد مالاریا بدست آورد، مسئولین اداره مالاریای وزارت بهداشت اقدام به تهیه برنامه چشم انداز مالاریا در جمهوری اسلامی ایران در افق 1404 نمودند که به عنوان یک پروژه ملی به تصویب دولت رسید و وزارت بهداشت موظف شد با بکار گیری تمامی پتانسیل های موجود در سطح کشور تا سال 1404 کشور را به مرحله حذف بیماری مالاریا برساند (1،3،4). حذف بیماری مالاریا از اهداف مشترک سازمان جهانی بهداشت و نظام سلامت در ایران است. هدف نهایی برنامه حذف مالاریا قطع انتقال محلی و به صفر رساندن موارد اتوکتونئوس مالاریا می باشد، یکی از بزرگترین چالش های برنامه حذف مالاریا موارد کم انگل و بدون علامت است که به روش های روتین تشخیص مالاریا ( میکروسکوپی و RDT ) قابل شناسایی نیست (5،6،7).

اکثر موارد مالاریای وارده ایران از کشورهای پاکستان و افغانستان می باشند که به علت آندمیک بودن بیماری در این کشورها احتمال وجود حاملین بدون علامت دربین اتباع این کشورها زیاد است، این افراد به دلیل عدم بروز علائم کلینیکی اغلب تحت درمان قرار نمی گیرند لذا مخزن مناسبی برای آلوده کردن پشه های آنوفل در منطقه می شوند (8،9).

روش روتین تشخیص مالاریا روش میکروسکوپی و RDT است اما این روش ها با وجود ساده و ارزان بودن حساسیت کمی در تشخیص موارد بدون علامت دارند. لذا برای تشخیص موارد بدون علامت استفاده از روشهای مولکولی با حساسیت و ویژگی بالا مانند PCR,LAMP ضروری است (13-10).

ما در این طرح با راه اندازی و Set up روش الایزا با استفاده از آنتی ژن نوترکیب بومی کشور ((PvMSP-42 kDa در مقایسه با کیت های وارداتی RDT به عنوان روش روتین غربالگری اقدام به کشف موارد سرم مثبت در مناطق مالاریا خیز نموده و متعاقب آن با استفاده از روش های ملکولی LAMP و Nested-PCR (به عنوان روش روتین استاندارد) درمقایسه با روش میکروسکوپی به عنوان روش استاندارد طلائی ، بصورت هدفمند به دنبال کشف موارد کم انگل و بدون علامت در ساکنین مناطق پر خطر استان (سرباز، سراوان و ایرانشهر) خواهیم بود.

بررسی متون:

منابع داخلی:

میرشکاری و همکاران در سال 1395 در یک مطالعه ایی که روی افراد بومی و مهاجرین افغانی و پاکستانی انجام شد نشان دادند که در افراد بومی هیج موارد مثبتی یافت نشد در مهاجرین افغانی یک مورد مثبت و در مهاجرین پاکستانی نیز یک مورد مثبت یافت شد (8).

ترکی و همکاران در سال 1394 در یک مطالعه با عنوان تاثیر روش Nested-PCR در تشخیص موارد بدون علامت در برنامه حدف مالاریا در مناطق اندمیک ایران انجام شد نشان دادند که با روش میکروسکوپی هیچ موارد مثبتی یافت نشد ولی به روش Nesetd-PCR 5/1 % موارد مثبت گزارش شد (11).

شهبازی و همکاران در سال 1393 در یک مطالعه ایی که روی 240 نفر از کسانی که سابقه ابتلا به مالاریا با پلاسمودیوم ویواکس داشتند و یک سال قبل درمان شده بودند در منطقه رودان ، میناب و بشاگرد انجام دادند نشان دادند که در بررسی میکروسکوپی همه موارد منفی ولی با روش Nesetd-PCR دو مورد مثبت گزارش شد (12).

در مطالعه ایی که توسط ترکی و همکاران در سال 1391 با عنوان حضور عفونت بدون علامت مالاریا در منطقه بشاگرد استان هرمزگان روی 500 نمونه خون انجام شد نشان دادند که هیچ مورد مثبتی در افراد بدون علامت مورد مطالعه یافت نشد. به طور کل 1% از جمعیت مورد مطالعه آنتی بادی ضد آنتی ژن اختصاصی P.VMSP-119 داشتند. هرچند تنها 2/. % از افراد نسبت به آنتی ژن نوترکیب P.FMSP-119 سروپوزیتیو بودند (14).

ذوقی و همکاران در سال 1391 طی پژوهشی که در استان های هرمزگان و کرمان انجام دادند، نشان دادند که در شهرستان بشاگرد و قلعه گنج ذخیره انگلی بدون علامت وجود ندارد و برنامه حذف مالاریا در این مناطق بخوبی در حال اجراء است. آنتی بادی ضد آنتی ژن های پلاسمودیوم ویواکس و پلاسمودیوم فالسیپاروم به ترتیب 1% و 2/0% گزارش شد (15).

ناطق پور و همکاران در سال 1390طی مطالعه ای در منطقه ایرانشهر سیستان و بلوچستان با استفاده از روش میکروسکوپی به بررسی موارد بدون علامت مالاریا در 446 مهاجرافغانی و 496 فرد بومی منطقه پرداختند. میزان عفونت بدون علامت در این افراد به ترتیب 6/1% و 0.6% گزارش گردید (9).

منابع خارجی:

Kim A Lindblade و همکاران طی یک مطالعه مروری در سال 2013 اعلام نمودند که مالاریای بدون علامت مهمترین چالش برنامه های کنترل و حذف مالاریا در مناطق مالاریا خیز جهان است (7).

در مطالعه ایی که توسط Maradiga و همکاران در سال 2016 با عنوان عفونت بدون علامت مالاریا در مناطق اندمیک هندوراس روی 1899 نمونه خون به روش میکروسکوپی و مولکولی انجام شد نشان دادند که روش مولکولی حساس تر از روش میکروسکوپی برای تشخیص عفونت بدون علامت می باشد (10).

در مطالعه ایی که توسط Baum, E., et al. در سال 2016 در تایلند انجام شد، موارد کم انگل و بدون علامت مالاریا را یک چالش بزرگ در برنامه حذف مالاریا معرفی کردند (16).

Clarissa M.moreira و همکاران در سال 2015 در یک مطالعه مروری با عنوان بررسی نظامند عفونت کم انگل پلاسمودیوم ویواکس که روی 874 مطالعه در این زمینه انجام شد عنوان کردند که شیوع عفونت پلاسمودیوم ویواکس اندازه گیری شده به وسیلهPCR به طور پیوسته بالاتر از شیوع آن به روش میکروسکوپی می باشد. میانگین شیوع عفونت تشخیص داده شده به روش میکروسکوپی 67% کمتر از شیوع آن توسط PCR است (17).

مطالعات زیادی در منطقه آمازون امریکای جنوبی نشان داده که یکی از چالشهای مهم در برنامه کنترل مالاریا موارد بدون علامت هستند.در این بررسی ها نشان داده شده که با کمک PCR می توان بین 20.4 تا 49.5 درصد موارد بدون علامت را شناسایی کرد در حالیکه با کمک روش میکروسکوپی بین 4.2 تا 38.5 در صد موارد بدون علامت قابل شناسایی هستند (13،18).

مطالعه ای در یمن در سال 2007 انجام شده که نشان از شیوع بالای مالاریای بدون علامت در این منطقه است (19).

تحقیق دیگری که در پارک ملی Jaú در بخشهای میانی رودخانه Negro انجام شده نشان داد که 72.4 درصد موارد مثبت آزمایشگاهی در ابتدا بدون علامت بودند که بعد از 30 روز پیگیری به 3/31 درصد و 25 درصد تا 150 روز بعد هم بدون علامت بودند. در این بررسی 66 درصد موارد مثبت فقط با کمک روش PCR تشخیص داده شدند (20).

در تحقیق Suárez-Mutis et al 4/20 درصد جمعیتی که درگیر کارهای سخت در منطقه وسط و بالای رودخانه Negro کار می کردند مبتلا به مالاریای بدون علامت بودند (21).

در مطالعه مقطعی که توسط Marcano et al. در2 منطقه از Yanomami در مرز ونوزئولا و برزیل انجام شد مشاهده شد که در مرز ونزئولا به علت پایداری در انتقال مالاریا سطح ایمنی افراد بالاتر است لذا 5/38 درصد موارد بدون علامت بودند ولی در مرز برزیل فقط 9/4 درصد بدون علامت هستند (22).

در تحقیق Roshanravan et al. 6/17 درصد کسانی که در کنار حاشیه رودخانه آمازون زندگی می کردند و 6/21 درصد جمعیت بومی بخش کلمبیایی آمازون مبتلا به مالاریای بدون علامت بودند (23).

بررسی ها ی مختلف نشان دادند که ارتباطی بین فاکتورهای ژنتیکی فرد میزبان با حساسیت و یا مقاومت نسبت به مالاریای شدید وجود دارد. با این حال اطلاعات اندکی در خصوص ارتباط این فاکتورها با مالاریای بدون علامت وجود دارد. در بررسی که توسط LANDRY-ERIK MOMBO و همکارانش در بین دانش آموزان کشور گابن انجام دادند مشخص شد که دختران هتروزگوت از نظر G6PD نسبت به گروههای سالم ملاریای بدون علامت به طور معنی داری شیوع کمتری دارد(P=0.03) البته تحقیقات نشان داده این گروه از افراد در برابر تمامی انواع مالاریای فالسیپاروم مقاومت بیشتری دارند (24).

بررسی ها نشان داده که در مناطقی که اندمیسیته پایداری دارند گرچه جمعیت منطقه در معرض هزاران گزش های آلوده قرار می گیرند ولی به علت ایمنی اکتسابی که دارند اپیدمی در منطقه رخ نمی دهد ولی در مناطق با شیوع ناپایدار گرچه میزان گزش آلوده اندک است ولی به دلیل نبود ایمنی اکتسابی منطقه درگیر اپیدمی میشود (25).

در مطالعه ی Alves et al. نشان داده شد که حساسیت روش PCR در تشخیص مالاریا 6 تا 7 برابر روش میکروسکوپی می باشد. از طرفی میزان شیوع موارد بدون علامت در منطقه اطراف رودخانه Madeira 4 تا 5 برابر افراد علامت دار بود ( بین 6.4 درصد تا 31.7 درصد) و در منطقه اطراف رودخانه Ji-Paraná به طور متوسط 49.5 درصد بود. مالاریا در این مناطق بیشتر افراد جوانتر را درگیر کرده بود ولی عفونت بدون علامت در بین افراد مسن تر دیده میشود. همچنین موارد بدون علامت در بین افراد یکه برای مدت طولانی تری در منطقه زندگی کرده بودند( 25.5 سال در کنار رودخانه Portochulo و 18 سال در کنار رودخانه Ji-Paraná شیوع بیشتری داشت (26).

در مطالعه ای که در سال 1996 توسط Fontes انجام شد میزان شیوع موارد بدون علامت مالاریا 7.2 درصد گزارش شد.در مطالعه ی بعدی ایشان در سال 2003 با استفاده از روش PCR میزان شیوع موارد بدون علامت مالاریا 27.3 درصد گزارش شد (27).

در مناطق هایپراندمیک از نظر مالاریا از 15-14 سالگی به بعد به میزان قابل توجهی از میزان پارازیتمی کاسته می شود بطوریکه با روش میکروسکوپی قابل تشخیص نیست و فقط روشهای مولکولی قابلیت تشخیص دارند (28،29).

در آمریکا گزارشات در زمینه مالاریای بدون علامت نسبتا جدید هستند. در برزیل در گزارش Andrade et al. نشان داد که 70 درصد موارد مالاریای بدون علامت در بین معدن کاران می باشد (30).

رابرت کخ اولین کسی بود که در سال 1900 مالاریای بدون علامت را در منطقه گینه نو تشخیص داد (31).

نتایج تحقیق در مرحله اول جهت آشکار سازی اپیدمی بیماری در بین افراد بدون علامت در خصوص تصمیتات ماخوذه از جانب مراکز بهداشتی و درمانی در راستای بحث درمان این افراد(از بین بردن مخازن مخفی) مطرح میشود.

کاربرد آن در خصوص نحوه تصمیمگیری روشهای پیشگیری و درمان بیماری در منطقه مطرح میشود.

نتایج مذکور میتواند دریچه ای جدید در خصوص نوع نگرش محقیقین در زمینه کنترل و درمان این بیماری مطرح باشد.

1. فراوانی افراد آلوده بدون علامت در مناطق مالاریا خیز سریاز، سراوان و ایرانشهر چقدر است ؟
2. آیا کارآیی روش‌ مولکولی LAMP در تشخیص مالاریای بدون علامت بیش از روش Nested- PCR است ؟
3. آیا میزان مالاریای بدون علامت در افراد با سن بالاتر بیشتر است ؟
4. کارآیی روش الایزا با استفاده از آنتی ژن نوترکیب بومی Pvmsp-42kDa در مقایسه با کیت های وارداتی RDT در تشخیص موارد سرم مثبت مالاریا چقدر است؟

مقایسه تکنیک های الایزا و RDT در غربالگری افراد ایرانی بدون علامت پلاسمودیوم ویواکس و بررسی فراوانی آلودگی به این انگل در افراد مذکور با استفاده از تکنیک های LAMP و Nested – PCR در مقایسه با روش استاندارد میکروسکوپی در مناطق پر خطر استان سیستان و بلوچستان در سال 1398-1397

1. تشخیص موارد سرم مثبت مالاریا در روش الایزا با استفاده از آنتی ژن نوترکیب بومی Pvmsp-42kDa در مقایسه با کیت های وارداتی RDT در در جامعه مورد مطالعه
2. تعیین میزان آلودگی در افراد بدون علامت مالاریا در جامعه مورد مطالعه به تفکیک روش های مولکولی LAMP و Nested- PCR
3. تعیین میزان آلودگی در افراد بدون علامت مالاریا در جامعه مورد مطالعه به تفکیک روش میکروسکوپی به عنوان استاندارد طلائی
4. تعیین میزان آلودگی در افراد بدون علامت مالاریا در جامعه مورد مطالعه به تفکیک جنس
5. تعیین میزان آلودگی در افراد بدون علامت مالاریا در جامعه مورد مطالعه به تفکیک سن

کاربرد این نتایج میتواند در زمینه کارآزمودن انواع تست های رایج و یا راه اندازی تست ها و آزمون های جدید در تشخیص این نوع موارد باشد.

1. استفاده از نتایج تحقیق به منظور فراهم آوردن اطلاعات پایه ایی جهت اجرای بهینه برنامه حذف مالاریا در استانسستان و بلوچستان
2. استفاده از نتایج تحقیق در شناسایی و درمان بیماران فاقد علائم بیماری

پلاسمودیوم ویواکس:

تک یاخته انگلی داخل سلولی از شاخه آپیکمپلکساوخانواده پلاسمودیده که قادر به ایجاد مالاریای سه –یک خوش خیم درانسان میباشد

2-پلاسمودیوم فالسیپاروم:تک یاخته انگلی داخل سلولی از شاخه آپیکمپلکسا وخانواده پلاسمودیده که قادر به ایجاد مالاریای سه –یک بدخیم در انسان میباشد

اسپوروزاییت:

فرم فعال وعفونت زای انگل برای انسان که از پشه به انسان منتقل میگردد.

مروزوئیت:

فرم حاصل از تکثیر غیر جنسی انگل در بدن میزبان واسط(انسان) که به دو فرم داخل گلوبولی و خارج گلبولی انجام میشود.

شیزوگونی:

تکثیر غیر جنسی انگل در بدن میزبان واسط که به دو شکل شیزوگونی خونی وشیزوگونی نسجی (کبدی) است

روش میکروسکوپی در تشخیص مالاریا:

Gold standard تشخیص مالاریا که لام تهیه شده ورنگ آمیزی شده به روش گیمسا از خون محیطی بیمار توسط میکروسکوپ بررسی میشود.

رینگ:

فرم حاصل از رها شدن مروزوئیت کبدی در داخل خون که وارد گلبول قرمز شده به فرم گرد در میاید که دارای یک هسته ویک واکوئل غذایی است که توسط سیتوپلاسم احاطه شده است.

1تروفوزوئیت:

فرم حاصل از رشد انگل در گلبول قرمزکه به3 فرم :تروفوزوئیت جوان،در حال رشدوپیر دیده میشود

تکثیر هم دما به واسطه لوپ (LAMP) : یکی از روشهای جدید تکثیر اسیدهای نوکلئیک که DNA را با حساسیت و ویژگی بالا با استفاده از 4 الی 6 پرایمر اختصاصی تحت شرایط دمایی یکسان (°65) در مدت زمان یک ساعت تکثیر می کند

واکنش زنجیره پلی مراز آشیانه ای (Nested-PCR): واکنش زنجیره پلی مراز آشیانه ای روش تغییر یافته ای از واکنش زنجیره پلی مراز است که برای کاهش آلودگی محصولات حاصله از تکثیر جایگاه های اتصال پرایمرغیر منتظره ابداع گردیده است. در این روش دو دسته پرایمر در دو مرحله متوالی واکنش زنجیره پلی مراز مورد استفاده قرارمی گیرد که دومین سری پرایمر جهت تکثیر یک هدف ثانویه در داخل اولین محصول بکار می رود .

الایزا (ELISA) : یک تکنیک ایمونوآنزیمی بیوشیمیایی است که بر پایه اندازه گیری کمپلکس رنگی آنتی‌ژن و آنتی‌بادی استوار است.

RDT:

Rapid Diagnostic Test یا RDT یک روش تشخیصی سریع مالاریا با استفاده از نواری از جنس نیتروسلولز و بر اساس ایمنوکروماتوگرافی می باشد.

توصیفی - مقطعی

افرادی که در بازه زمانی یک سال از فروردین 1397 تا فروردین 1398 به مراکز بهداشتی و درمانی واقع در شهرستان های سرباز، سراوان و ایرانشهر جهت انجام آزمایشات روتین خونی(CBC, ESR, PT,PTT) مراجعه مینمایند و هیچگونه علایم روتین و تیپیک مالاریا را نداشته باشند که از آنها گسترش خونی تهیه میشود.

معیار های خروج از مطالعه:

• افرادی که برای نمونه گیری انتخاب می شوند مهاجرین غیرایرانی نمی باشند.
• این افراد فاقد علائم اختصاصی و پاروکسیسم مالاریا (لرز- تب – تعریق و بزرگی طحال ) در 6 ماه اخیر می باشند.
• افرادی که دارو ضد مالاریا مصرف کرده باشند وارد مطالعه نمی شوند.
• افرادی که سن بالاتر از 60 سال داشته باشند.
• عدم رضایت کامل بیمار

با در نظر گرفتن مطالعات قبلی در ایران (ناطق پور، ترکی، ذاکری و رشید پور که در بررسی متون ذکر گردیده است)،حداکثر شیوع 10 درصد برای این نوع مالاریا( وشیوع 90% برای مالاریای ویواکس نسبت به فالسیپاروم)، اختلاف قابل قبول 2/5 درصد در براورد شیوع و همچنین خطای 5 درصد، حجم نمونه تقریبا برابر با 560 نفر خواهد بود که ما از 600 نفر نمونه گیری خواهیم کرد. برای نمونه گیری از سه منطقه مختلف مورد بررسی، از روش نمونه گیری طبقه‌ای نسبتی متناسب با حجم هر طبقه استفاده می‌کنیم. به این ترتیب که با توجه به تعداد افرادی که در هر منطقه جغرافیایی ساکن هستند، به همان نسبت از آن منطقه، تعداد افراد را در نمونه انتخاب می‌کنیم. درون هر طبقه نیز به روش نمونه گیری تصادفی، نمونه برداری می‌کنیم ، بدین صورت که ابتدا لیستی از خانوارها را از طریق مراکز بهداشتی درمانی تهیه کرده، سپس از لیست خانوارها انتخاب شده و از هر خانوار یک نفر به طور تصادفی انتخاب می‌شود، همچنین در صورت حاضر نبودن شخص در منزل، فرد دیگری از همان منزل به طور تصادف انتخاب می‌گردد.

نمونه گیری بصورت سرشماری و تمام افراد با شرایط ورود از اسفند 1396 تا خردادماه 1398 جمع آوری خواهد شد. در این طرح از افراد مورد نظر تست RDT (کیت وارداتی از کشور هند)، لام میکروسکوپی و نمونه خون (3 سی سی ) جهت تست Nested PCR و LAMP گرفته می شود. لام ها به روش میکروسکوپی بررسی می شوند و تستهای مولکولی Nested PCR و LAMP در آزمایشگاه مولکولی انگل شناسی زاهدان انجام خواهد شد. پاسخ آزمایش ها و مشخصات دموگرافیک مهاجرین در پرسشنامه (پیوست ضمیمه) ثبت خواهند شد.

پرسش نامه

در ابتدا به افراد در مورد طرح توضیح داده خواهد شد و بعد از کسب اجازه از آنها، افراد سنین مختلف (چهار تا شصت سال) از هر دو جنس می توانند وارد مطالعه شوند سپس افراد مصاحبه شده و اطلاعات آنها ثبت می شود. در مرحله بعدی گسترش ضخیم و نازک گرفته می شود و بطور همزمان تست RDT انجام می شود، cc3 خون جهت انجام تست , مولکولی تهیه خواهد شد. نمونه های خون سانتریفوژ شده، خون تام و سرم پس از جداسازی در شرایطC 20- نگهداری و به آزمایشگاه گروه انگل شناسی انتقال داده خواهد شد.

روش میکروسکوپی:

گسترش خون بصورت ضخیم ونازک از انگشت سبابه هر فرد گرفته شده وپس از رنگ آمیزی با گیمسا ، آزمایش می شوند، هر نمونه باید 200- 100 فیلد آن بدقت مورد بررسی قرار گیرد و نتیجه بصورت مثبت یا منفی گزارش شود در صورت مثبت بودن شمارش میزان انگل (پارازیتمی) با ذکر مرحله انگل لازم وضروری است.

روش RDT:

5 میکرولیتر خون بوسیله میکروپیپت مخصوص به چاهک نمونه خون در کیت اضافه شده، دوقطره بافر مخصوص کیت را به چاهک مخصوص بافر اضافه می کنیم و نتیجه را براساس تشکیل باندهای مورد نظر بعد از 20 دقیقه قرائت می کنیم.

می توان از نمونه خون تازه یا از خون گرفته شده در لوله حاوی ضد انعقاد مناسب استفاده کرد.

استخراج DNA وتشخیص مولکولی با استفاده از روش Nested-PCR و LAMP:

جهت تهیه DNA از نمونه های جمع آوری شده ، از کیت Pro mega استفاده خواهد شد. تشخیص گونه های آلوده کننده با روش Nested- PCR وبا استفاده از ژن 18s rRNA انجام می شود. سپس با استفاده از پرایمرهای اختصاصی جنس وگونه، ژن 18s rRNA نوع گونه آلوده کننده نیز مشخص خواهد شد.

روش الایزا:

با استفاده از آنتی ژن نوترکیب Pv MSP-1 42 KDa تهیه شده در مطالعه قبل و طبق پروتوکل از سرم های تهیه شده از خون کامل تست الایزا انجام شده و افرادی که تیترآنتی بادی آنها از cut off نرمال بالاتر باشند به عنوان مورد مثبت گزارش خواهند شد

توالی پرایمر های تعیین جنس و گونه در روش Nested- PCR

توالی پرایمرهای لمپ برای پلاسمودیوم ویواکس

داده ها پس از جمع آوری، وارد نرم افزار SPSS شده و سپس آمار توصیفی آن ارائه می‌گردد. سپس جهت تجزیه و تحلیل داده‌ها از آزمونهای آماری t، من ویتنی و ویلکاکسون استفاده می‌کنیم. همچنین ضریب توافق کاپا بین تست های انجام شده ، توسط نرم افزار مدیکال کالکیولیتور تعیین میگردد.

در این پژوهش کدهای اخلاقی زیر از دفترچه راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی  رعایت شده است.    

با کد های 1، 2، 3، 4، 5، 7، 10، 11، 12، 13، 14، 15، 16، 17، 18، 19، 20، 21، 22، 23، 25، 26، 27، 28، 29، 30 و 31

همچنین در این پژوهش کدهای اخلاقی زیر از دفتر چه راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی  در جمهوری اسلامی ایران راهنمای عمومی با کد های  1، 2، 3، 4، 5، 6، 7، 8، 9، 10 ، 11،

تنها محدویت اجرایی طرح، سختی کار در شرایط فیلد می باشد.

asymptomatic malaria , recombinant protein, PCR

1- برنامه حذف مالاریا جمهوری اسلامی ایران در افق 1404، وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشکی، معاونت سلامت

2- ادریسیان غ، رضاییان م، قربانی م. تک یاخته شناسی پزشکی.چاپ دوم .دانشگاه علوم پزشکی تهران 1394، صفحات 271-213.

3-ناصری نژاد د. راهنمای مدیریت وبرنامه ریزی مبارزه با مالاریا،ویرایش اول،دانشگاه علوم پزشکی بندرعباس. 1382.

4- آمار گرفته شده از اداره کل مبارزه با بیماری ها، وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشکی،1395 (مکتوب نمی باشد).

5- Hassanpour, G., et al. (2017). 'Asymptomatic Malaria and its Challenges in the Malaria Elimination Program in Iran: a Systematic Review.' Journal of Arthropod-Borne Diseases.

6- Tanner, M., et al. (2015). 'Malaria eradication and elimination: views on how to translate a vision into reality.' BMC medicine 13(1): 167.

7. . LindbladeKim A,Steinhardt L, Samuels A,Kachur P.et al. The silent threat: asymptomatic parasitemia and malaria transmission. Expert Rev. Anti Infect. Ther. 11(6), 623–639 (2013).

8- Amirshekari, M. B., et al. (2016). 'Determination of Asymptomatic Malaria among Afghani and Pakistani Immigrants and Native Population in South of Kerman Province, Iran.' Iranian journal of parasitology 11(2): 247-252.

9. Nateghpour, M., et al. (2011). 'Detection of asymptomatic malaria infection among the Afghani immigrant population in Iranshahr district of southeastern Iran.' Bulletin de la Société de pathologie exotique 104(4): 321-323.

10- Maradiaga, A., et al. (2016). 'Asymptomatic Malaria Infections in an Endemic City of Honduras.' Human Parasitic Diseases 8: 37.

11- Turki, H., et al. (2015). 'Efficiency of nested-PCR in detecting asymptomatic cases toward malaria elimination program in an endemic area of Iran.' Iranian journal of parasitology 10(1): 39

12- Shahbazi, A., et al. (2013). 'Detection of asymptomatic carriers of Plasmodium vivax among treated patients by Nested PCR method in Minab, Rudan and Bashagard, Iran.' Iranian journal of parasitology 8(4): 586.

13- da Silva NS, da Silva-Nunes M, Malafronte RS et al. Epidemiology and control of frontier malaria in Brazil: lessons from community-based studies in rural Amazonia. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 104(5), 343–350 (2010).

14- Turki H, S Zoghi, A AMehrizi, S Zakeri, A Raeisi, H Khazan, AA Haghdoost Absence of Asymptomatic Malaria Infection in Endemic Area of Bashagard District, Hormozgan Province, Iran. Iranian J Parasitol: Vol. 7, No.1, 2011, pp. 36-44.

15- Zoghi S, Mehrizi AA, Raeisi A, Haghdoost AA, Turki H, Safari R, et al. Survey for asymp-tomatic malaria cases in low transmission set-tings of Iran under elimination programme. Malar J. 2012; 11: 126-36.

16- Baum, E., et al. (2016). 'Common asymptomatic and submicroscopic malaria infections in Western Thailand revealed in longitudinal molecular and serological studies: a challenge to malaria elimination.' Malar J 15: 333.

17- Moreira, C. M., et al. (2015). 'A systematic review of sub-microscopic Plasmodium vivax infection.' Malaria journal 14(1): 360.

18- Cucunubá ZM, Guerra AP, Rahirant SJ, Rivera JA, Cortés LJ, Nicholls RS. Asymptomatic Plasmodium spp. Infection in Tierralta, Colombia. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 103(7), 668–673 (2008).

19- Mohanna M, Ghouth A, Rag’a Y. Et Al. Malaria Signs And Infection Rate Among AymptomaticSchollchildren In Hair Valley,Yeman. Eastern Mediterranean Health Journal 2007; 13(1): 35-40.

20- Ladeia-Andrade S 2005. AspectosEpidemiológicos Da Malária No ParqueNacional Do Jaú, Amazonas, Brasil, Phd Thesis Instituto Oswaldo Cruz-Fiocruz, Rio De Janeiro, 287 Pp.

21. Suárez-Mutis Mc, Cuervo P, Fernandes O, CouraJr 2004. Evidência Da Presença De InfecçãoAssintomáticaPor Plasmodium No Médio Rio Negro, Estado Do Amazonas. Rev Soc Bras Med Trop 37(Supl. I): 268-269.
22. Marcano Tj, Morgado A, TostaCe, CouraJr 2004. Cross-Sectional Study Defines Diference In Malaria Morbidity In Two Yanomami Communities On Amazonian Boundary Between Brazil And Venezuela. MemInstOsw Cruz 99: 369-376.

23- Roshanravan B, Ari E, Gilman Rh, Cabrera L, Lee E, Metclafe J, Calderon M, Lescano Ag, Montenegro Sh, Calampa C, VinetzJm 2003. Endemic Malaria In The Peruvian Amazon Region Of Iquitos. Am J Trop Med Hyg 69: 45-52.

24- Landry-Erik Mombo, Francine Ntoumi, CyrilleBisseye, Simon Ossari, Chang Yong Lu, Ronald L. Nagel And RajagopalKrishnamoorthy. Human Genetic Polymorphisms And Asymptomatic Plasmodium Falciparum Malaria In Gabonese Schoolchildren . The American Society Of Tropical Medicine 2003.

25- Carter R, Mendis 2002. Evolucionary And Historic Aspects Of The Burden Of Malaria. ClinMicrobiol 15: 564-594

26- Alves Fp, DurlacherRr, MenezesMj, Krieger H, Silva Lhp, Camargo Ep 2002. High Prevalence Of Asymptomatic Plasmodium Vivax And Plasmodium Falciparum Infections In Native Amazonian Populations. Am J Trop Med Hyg 66: 641-648.

27- Fontes Cjf 2001. Epidemiologia Da Malaria E FatoresAssociados À InfecçãoAssintomáticaPor Plasmodium Em Uma População De Garimpeiros Da Amazonia Brasileira (MatoGrosso, 1996), Phd Thesis, Universidade Federal De Minas Gerais, Belo Horizonte.

28. Roper C, ElhassanIm, Hviid L, Giha H, Richardson W, Babiker H, SattiGm, TheanderGt, Arnot De 1996. Detection Of Very Low Level Plasmodium Falciparum Infections Using The Nested Pcr And A Reassessment Of The Epidemiology Of Unstable Malaria In Sudan. Am J Trop Med Hyg 54: 325-331.

29- Greenwood B 1987. Asymptomatic Malaria Infections Do They Matter? Parasitol Today 3: 206-214

30. Andrade Alss, MartelliCmt, Oliveira Rm, Arias Jr, Zicker F, Pang L 1995. High Prevalence Of Asymptomatic Malaria In Gold Mining Areas In Brazil. ClinInfec Dis 20: 475.

31- Harrison G 1978. Mosquitoes, Malaria And Man: A History Of The Hostilities Since 1880, John Murray, London, P. 172-174.

فرم جمع آوری داده های طرح تحقیقاتی

مقایسه تکنیک های الایزا و RDT در غربالگری افراد ایرانی بدون علامت پلاسمودیوم ویواکس و بررسی فراوانی آلودگی به این انگل در افراد مذکور با استفاده از تکنیک های LAMP و Nested – PCR در مقایسه با روش استاندارد میکروسکوپی در مناطق پر خطر استان سیستان و بلوچستان در سال 1398-1397

پژوهش برای بیمار و یا قیم قانونی وی به صورت کامل توضیح داده خواهد شد

مرحله خون گیری و تهیه لام قبل از گرفتن رضایت نامه انجام شده و لذا تنها میبایست رضایت نامه کتبی جهت استفاده از بیمار اخذ گردد

مزایای شرکت در این پژوهش هم از لحاظ فردی(سلامت فردی) و هم از جنبه اجتماعی(شناسایی مخاذن مخفی بیماری) به صورت کامل توضیح داده میشود.

عوارض جانبی ندارد

با توجه به بند قبلی توجیه ندارد

هزینه طرح از منبع گرنت تحقیقاتی اخذ میشود

ندارد

اطلاعات بیمار کاملا محرمانه بوده و از انتشار اسم و دیگر موارد شخصی اجتناب خواهد شد

از آنجا که همیشه کارشناسان بومی در مراکز درمانی حضور دارند لذا در توضیح و پاسخ دادن به سوالات پرسشگر و فرد پاسخ دهنده هیچ مشکلی وجود ندارد

حق پذیرش و یا رد شرکت در طرح تحقیقاتی برای شرکت کننده کاملا محفوظ است

رضایت نامه به صورت کتبی از شرکت کننده اخذ خواهد شد