بررسی الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی و فراوانی ژن های پمپ افلاکس OqxA وOqxB در ایزوله های کلبسیلا پنومونیه جداشده از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان های آموزشی

بیمارستان ها

 کلبسیلا عضوی از خانواده انتروباکتریاسه است.خصوصیات مهم این باکتری باسیل گرم منفی،کاتالاز مثبت،اکسیدازمنفی،تخمیرکننده قندلاکتوز،غیرمتحرک،ایندول منفی،MR منفی،VP مثبت،سیترات مثبت واوره مثبت می باشد. سویه های کلبسیلا همه جا در طبیعت یافت می شوندومیتوان آنها را در محیط های طبیعی(نظیرآب وخاک) وسطوح مخاطی پستانداران یافت.نواحی رایج کلونیزاسیون باکتری در انسان های سالم مجرای گوارشی،چشم ها،مجرای تنفسی ومجرای ادراری تناسلی است.

کلبسیلاپنومونیه یکی از مواردمهم عفونت های اکتسابی ازجامعه وبیمارستان است که میزان مرگ ومیرناشی از آن بالاست . مهم ترین عامل عفونت ادراری دردنیا  E.coli ومتعاقب آن کلبسیلاپنومونیه است به گونه ای که در6تا 17 درصدازعفونت های ادراری بیمارستانی نقش دارد.این باکتری باعث انواع مختلفی ازعفونت هامثل پنومونی،سپتی سمی،اسهال،ایجادآبسه درکبد،مننژیت،عفونت ادراری وباکتریمی می شود.(1).

در سال های اخیرشاهد افزایش چشم گیری در توسعه سویه های مقاوم به دارو در این باکتری بوده ایم(2)که یکی از این مقاومت ها  مقاومت نسبت به کینولون هاست.کینولون ها یکی از مهم ترین انواع انتی بیوتیک ها هستندکه برروی باکتری های گرم مثبت ومنفی موثرندو با جلوگیری از تکثیرDNA باعث مرگ باکتری می شوند.در حال حاضر استفاده از کینولون ها با پیدایش گونه های مقاوم  میکروبی به خطر افتاده است. با اینکه مکانیسم اصلی مقاومت نسبت به کینولون ها جهش در ژن های ناحیه هدف است اما پمپ های افلاکس(efflux pumps) چند دارویی هم به طور گسترده ای به مقاومت نسبت به کینولون ها کمک می کنند(3).پمپ های افلاکس پروتیین های انتقال دهنده ای هستند که عمل دفع مواد سمی از جمله تمام انواع آنتی بیوتیک ها از داخل به محیط اطراف را برعهده دارند(4).خصوصیت مشترک همه سیستم های افلاکس،توانایی دفع انواع مواد ضد باکتریایی نظیر آنتی بیوتیک ها،بیوسایدها، رنگ ها،پاک کننده ها ، اسیدهای چرب وحلال های آلی می باشد. افزون بر این ، باکتری ها متابولیت های طبیعی خود نظیر باکتریوسین ها، همولیزین هاو... را هم به خارج سلول پمپ می کنند(5).افلاکس پمپ ها با افزایش MIC  یا Minimum Inhibition Concentration( حداقل غلظت مهار کننده رشد باکتری) آنتی بیوتیک ها موجب کاهش غلظت دارو در داخل سلول و ایجاد سویه های مقاوم در باکتری ها می گردند.

در باکتری ها پنج خانواده از افلاکس پمپ ها وجود داردکه برحسب روش کسب انرژی برای انتقال سوبسترا به دو دسته تقسیم می شوند :پمپ های دسته اول که برای انتقال از انرژی ATP استفاده می کنند وفقط شامل پمپ های ABC  یا ATP Binding Cassette (کاست های اتصالی به ATP )می باشند.پمپ های دسته دوم از انرژی گرادیانت پروتون غشا برای انتقال سوبستراهایشان استفاده می کنند(6).

5 کلاس عمده پمپ های افلاکس عبارتند از:

خانواده MFS  یا Major facilitator superfamily  

خانواده SMR یا Small multidrug resistant

خانواده RND یا Resistant nodulation division

خانواده MATE یا Multidrug and toxic efflux

و خانواده ABC یا ATP binding cassette  (7)

سیستم های افلاکس پمپ به صورت یک قسمتی یا سه قسمتی هستند.پمپ های افلاکس یک قسمتی پس از جذب دارو به کمک پورین یا کانال های پروتیینی آن را به بیرون از سلول باکتری هدایت می کننددر حالی که پمپ افلاکس های سه قسمتی پس از جذب دارو مستقیما آن را به بیرون از باکتری دفع می کنند (5، 8 ، 9).

خانوادهRND : این خانواده از سیستم های افلاکس سه قسمتی بوده و باتوجه به ساختارش از بقیه خانواده ها متمایز شده است. ناقل های این خانواده بزرگتر از بقیه ناقل ها هستند و فقط در باکتری های گرم منفی یافت می شوند.این خانواده با توجه به ساختار سوبسترا ،آن را مستقیما به محیط بیرون پمپ می کندوقادر به پمپ کردن انواعی از ترکیبات از جمله مواد باردار وآمفی فیلیک مانند تتراسایکلین، کینولون ها ، کلرامفنیکل وبتالاکتام ها می باشد(10،11).این خانواده از تنوع زیادی در باکتری های مختلف برخورداربوده که در گونه ی کلبسیلا پنومونیه یکی از معروف ترین آن ها پمپOqxAB می باشدکه با کاهش حساسیت نسبت به کینولون ها ومقاومت نسبت به چند عامل دیگر در ارتباط است(12-15).ژن های این پمپ هم برروی کروموزوم وهم درپلاسمید هاقراردارند(16).این پمپ  توسط ژن های OqxAو OqxB کدگذاری می شود که این ژن ها برروی یک پلاسمید قابل انتقال 52 هزار بازی به نام POLA52 قراردارند(17).

در مطالعه ای که در سال 2013 و برروی نمونه های کلبسیلاپنومونیه جمع آوری شده از نقاط مختلف مثل تایوان-استرالیا-آرژانتین- بلژیک –ترکیه و آفریقای جنوبی انجام شد مشاهده گردیدکه در100% ایزوله های جمع آوری شده پمپ افلاکس OqxAB حضور داشته است (18).

نتایج مطالعه ی سعادتیان فریور برروی ایزوله های کلبسیلاپنومونیه جدا شده از بیمارستان های تهران انجام شد نشان می دهد که 96% نمونه ها دارای پمپ افلاکس OqxAB بودند(19).

هاشمی و همکاران در مطالعه ای توصیفی در سال 1393 برروی ایزوله های کلبسیلا پنومونیه در تهران اینطور نتیجه گیری کردند:

شیوع پمپ های OqxA و OqxB 50 در صد بود و در سویه های مقاوم به سیپروفلوکساسین افزایش 3/2 برابری پمپ افلاکس OqxAB مشاهده گردید(20).

هم چنین مطالعاتی که در سال 2013و2015 در تهران صورت گرفته نشان دادکه:

حضور هردو ژن OqxA وOqxB در مطالعه اول 2/60 و در مظالعه بعدی حضورژن OqxA  7/56 و ژن OqxB6/54 گزارش شده است.(21،22)

 با توجه به اهمیت  زیاد مقاومت چنددارویی کلبسیلا پنومونیه در درمان بیماری های عفونی وهمچنین نقش پررنگ پمپ های افلاکس oqxAB در ایجاد این گونه از مقاومت ،در این پژوهش بر آن شده ایم تا به بررسی فراوانی مقاومت آنتی بیوتیکی و فراوانی ژن های پمپ افلاکس OqxAB در جدایه های بالینی کلبسیلا پنومونیه جداشده از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان های آموزشی شهر زاهدان بپردازیم.

بررسی ژن پمپ افلاکس OqxAB  والگوی مقاومت آنتی بیوتیکی درایزوله های کلبسیلاپنومونیه ودرنتیجه به دست آوردن یک داروی مناسب برای درمان عفونت های مرتبط بااین باکتری.

1. توزیع فراوانی ژن کدکننده پمپ افلاکس  OqxA  در ایزوله های بالینی کلبسیلا پنومونیه چگونه است؟

2-توزیع فراوانی ژن کدکننده پمپ افلاکس OqxB در ایزوله های بالینی کلبسیلا پنومونیه چگونه است؟

3-توزیع فراونی مقاومت آنتی بیوتیکی در ایزوله های بالینی کلبسیلا پنومونیه چگونه است؟

فرضیه: 

فراوانی ژن های پمپ افلاکس OqxA در ایزوله های کلبسیلا پنومونیه متفاوت است.

فراوانی ژن های پمپ افلاکس OqxB در ایزوله های کلبسیلا پنومونیه متفاوت است.

توزیع فراوانی مقاومت آنتی بیوتیکی در ایزوله های بالینی کلبسیلا پنومونیه متفاوت است.

بررسی فراوانی مقاومت آنتی بیوتیکی و فراوانی ژن های پمپ افلاکس OqxAB در جدایه های بالینی کلبسیلا پنومونیه جداشده از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان های آموزشی شهر زاهدان.

1-تعیین توزیع فراوانی ژن های پمپ افلاکس OqxA در ایزوله های بالینی کلبسیلا پنومونیه جداشده از بیمارستان های آموزشی شهر زاهدان.

2-تعیین توزیع فراوانی ژن های پمپ افلاکسOqxB در ایزوله های بالینی کلبسیلا پنومونیه جداشده از بیماران در بیمارستان های آموزشی شهر زاهدان.

3-تعیین الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی در سویه های کلبسیلا پنومونیه جدا شده ازبیماران مراجعه کننده به بیمارستان های آموزشی شهر زاهدان.

بیمارستان ها

کلبسیلاپنومونیه: یکی از باکتریهای بیماریزا از خانواده انتروباکتریاسه است. این باکتری گرم منفی، غیرمتحرک، دارای کپسول، تخمیرکننده لاکتوز، بی هوازی اختیاری و استوانه‌ای شکل است.

 پمپ افلاکس: پمپ های افلاکس پروتیین های انتقال دهنده ای هستند که عمل دفع مواد سمی از جمله تمام انواع آنتی بیوتیک ها از داخل به محیط اطراف را برعهده دارند.

OqxAB:دو ژن کدکننده یک پمپ افلاکس در باکتری هایی مثل کلبسیلاپنومونیه وE.coli

توصیفی-مقطعی

ایزوله های بالینی کلبسیلا پنومونیه جداشده از بیماران بستری و مراجعه کننده به بیمارستان های آموزشی شهرستان زاهدان.

باتوجه به فرمول آماری حجم نمونه وبادرنظر گرفتن ɑ برابر با 05/0وهم چنین d برابربا 05

/0وباتوجه به اطلاعات به دست آمده ازمطالعاتی که قبلاانجام شده است حداقل تعدادنمونه 59وحداکثرآن 384

است که ما باتوجه به هزینه و وقت درنظرگرفته شده برای انجام این مطالعه حجم نمونه را برابربا120 عدد درنظرمی گیریم.

نمونه ها از بخش های مختلف در بیمارستان های آموزشی جداسازی ومورد بررسی قرار می گیرد.

داده ها با بررسی ایزوله ها وانجام آزمون هایی، که باهدف  تعیین الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی در سویه ها، استخراج DNA و شناسایی ژن های پمپ افلاکس OqxAB،جمع آوری خواهد گردید.سپس اطلاعات به دست آمده توسط نرم افزارSPSS وآزمون های مربوطه مورد بررسی قرارگرفته و فراوانی مقاومت نسبت به آنتی بیوتیک های مختلف و میزان حضور ژن های کدکننده پمپ  OqxABدر ایزوله های بالینی جمع آوری شده تعیین خواهد شد.

با مراجعه به بیمارستان های مربوطه ایزوله های بالینی از عفونت های مختلف و در بخش های مختلف ازبیماران مراجعه کننده جمع آوری شده و برای تایید نمونه ها آن ها را برروی محیط هایی مثل EMB و مک کانکی آگار کشت داده وبه مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه نگهداری میکنیم.

پس ازانجام انکوباسیون از کلنی های مشکوک به کلبسیلا پنومونیه لام مستقیم تهیه کرده و درصورت مشاهده باسیل های گرم منفی تست های تشخیصی زیر را میگذاریم:

تست های اکسیداز،کاتالازTSI,SIM,MR,VP,لیزین دکربوکسیلاز، سیترات ،اوره، تخمیرقندهاو اورنیتین دکربوکسیلاز.

نمونه ها درمحیطBHI همراه باگلیسرول ودر دمای 70-درجه نگهداری می شوند.

بررسی الگوی مقاومت دارویی:

مقاومت دارویی سویه های جداشده نسبت به آنتی بیوتیک های (ایﻤــــی ﭘــــﻨﻢ، ﻣــــﺮوﭘﻨﻢ، ﺳــــﻔﺘﺎزیﺪیﻢ، ﺳﻔﻮﺗﺎکﺴــــیﻢ، ﺳﻔﺘﺮیﺎکﺴﻮن، ﺳﻔﭙیﻢ،آﻣﭙی ﺳیﻠیﻦ و ﭘیﭙﺮاﺳـیﻠیﻦ / ﺗﺎزوﺑﺎکﺘـﺎم ،آزترونام،آمیکاسین،سیپروفلوکساسین،لووفلوکساسین،) را به روش انتشار دیسک در آگار( دیسک دیفیوژن )انجام می دهیم.،

برای این منظور از کشت های 24 ساعته باکتری در محیط نوترین آگار نیم واحد مک فارلند تهیه می کنیم .از سوسپانسیون میکروبی که تهیه کردیم مقدار مشخصی را برداشته وبر روی پلیت های حاوی محیط مولر هینتون آگار کشت می دهیم.حال دیسک های آنتی بیوتیکی را بافاصله از یکدیگربرروی محیط قرارداده و پلیت های مورد نظر را برای 18 ساعت در37 درجه قرار می دهیم و نتایج را با استفاده از جداول CLSI بررسی می کنیم در مرحله بعد برای جداسازی وتخلیص DNA از کیت استخراج DNA استفاده می شود. وسپس با استفاده از پرایمرهای مشخص که در ادامه آورده می شودوجود ژن های OqxAو OqxB بررسی خواهد گردید.

پس ازPCR محصول را برروی ژل آگارز 1 درصد الکتروفورز می کنیم.پس از پایان الکتروفورز، ژل در طول موج 280 نانومتر از نظر وجود باندهای هدف درکنار مارکر مولکولی وکنترل ها مورد بررسی قرار می گیرد.

در مرحله آخرتعدادی از محصولات PCR ازنظرتوالی ژن های OqxA وOqxB تعیین توالی می شوند.

مشخصات پرایمرها برای تکثیر ژن های OqxA و OqxB :

پرایمر OqxA-F ← 5-CTCGGCGCGATGATGCT-3

پرایمرOqxA-R ← -CCACTCTTCACGGGAGACGA-35

پرایمرOqxB-F← 5-TTCTCCCCCGGCGGGAAGTAC-3

پرایمرOqxB-R ← 5-CTCGGCCATTTTGGCGCGTA-3 (23)

سویه استاندارد← K∙pneumoniae ATCC700603

داده ها پس از جمع آوری با استفاده از نرم افزار spss مورد بررسی توصیفی قرارخواهدگرفت

بارضایت کامل ازبیماران نمونه  گیری می شودوتعهد می گرددنام ومشخصات بیماران درهیچ گزارشی قیدنشود.انجام آزمایشات هیچ گونه هزینه ای برای بیمارنخواهدداشت.دراین مطالعه کدهای اخلااقی شماره 1-14-18-25-29-و31 از دفترچه راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش های علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی رعایت خواهدشد.

محدودیت خاصی در اجرای این طرح وجود ندارد.

مقاومت آنتی بیوتیکی، پمپ افلاکس، OqxAB، کلبسیلا پنومونیه

1 Ullah F, Malik SA, Ahmed G. Antimicrobial susceptibility pattern and ESBL prevalence in Klebsiella pneumoniae from urinary tract infections in the North-West

of Pakistan. African Journal of Microbiology Research. 2009; 3(11): 676-680.

2- لنگریزاده ن, رضایی مآ, آقازاده م, حسنی آ. مقایسه شیوع کلبسیلا پنومونیه های دارای مقاومت دارویی چندگانه در کودکان و بزرگسالان مبتلا به عفونت ادراری مراجعه کننده  به مراکز آموزشی و درمانی تبریز. فصلنامه علوم زیستی دانشگاه آزاد اسلامی واحد زنجان. 1389;1(4):9-17.

3-       S C, P P, M H, JL C, G I. Mechanisms of quinolone action and resistance: where do we stand? Journal of Medical Microbiology. 2017;66(5):551-9.

4-       Webber MA, Piddock LJV. The importance of efflux pumps in bacterial antibiotic resistance. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2003;51(1):9-11.

5-T.Kohler,et al.Bacterial antibiotic efflux systems of medical importance,CMLS.Cell.Mol.life sci,(1999)56:771-778

6-Marc Ouellette,et al.Microbial multidrug resistance,International jornal of Antimicrobial agents,(1997) 8E:179-187

7-Paulsen,Tet al,Comparative genomics of microbial drug efflux system,JMOL Microbial,(2001)3:145-150

8-Piddock L J.Multidrug-resistance efflux pumps?not just for resistance,Nature Reviews Microbiology,2006;4(8):629-36.

9-Zgurskaya HI,Weeks JW,Ntreh AT,Nickels LM,Wolloscheck D.Mechanism of coupling drug transport reactions located in two different membranes.Frontiers in microbiology.2015;6:100

10-Nikaido H,Takatsuka Y.Mechanisms of RND multidrug efflux pumps Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-proteins an proteomics 2009;1794(5):769-81

11-Anes J,MeCusker MP,Fanning S,Martins M.The ins and outs of RND efflux pumps in Escherichiacoli.Frontiers in microbiology.2015;6.

12-     Goudarzi M, Azad M, Seyedjavadi SS. Prevalence of plasmid-mediated quinolone resistance determinants and OqxAB efflux pumps among extended-spectrum-lactamase producing Klebsiella pneumoniae isolated from patients with nosocomial urinary tract infection in Tehran, Iran. Scientifica. 2015;2015.

13-     Martínez-Martínez L, Pascual A, Jacoby GA. Quinolone resistance from a transferable plasmid. The Lancet. 1989;351(9105):797-9.

14-     Yuan J, Xu X, Guo Q, Zhao X, Ye X, Guo Y, et al. Prevalence of the oqxAB gene complex in Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli clinical isolates. J Antimicrob Chemother. 2012;67:1655-9.

15-     Hansen LH, Jensen LB, Sørensen HI, Sørensen SJ. Substrate specificity of the OqxAB multidrug resistance pump in Escherichia coli and selected enteric bacteria. J Antimicrob Chemother. 2007;60:145-7.

16-     Kim HB, Wang M, Park CH, Kim E-C, Jacoby GA, Hooper DC. oqxAB Encoding a Multidrug Efflux Pump in Human Clinical Isolates of Enterobacteriaceae. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2009;53(8):3582-4.

17-     Rodrı´guez-Martı´nez JM, Alba PDad, Briales A, Machuca J, Lossa M, Ferna´ndez-Cuenca F, et al. Contribution of OqxAB efflux pumps to quinolone resistance in extended-spectrum-b-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae. J Antimicrob Chemother. 2013;68:68-13.

18- Perez F, Rudin SD, Marshall SH, Coakley P, Chen L, Kreiswirth BN, et al. OqxAB, a Quinolone and Olaquindox Efflux Pump, Is Widely Distributed among MultidrugResistant Klebsiella pneumoniae Isolates of Human Origin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2013;57(9):4602-3.

19-     Farivar AS, Nowroozi J, Eslami G, Sabokbar A, Hashemi A. The study of antibiotic resistance among Klebsiella pneumoniae and expression level of oqxA and acrA genes by using real-time PCR. The Quarterly journal of School of Medicine, Shahid Beheshti University of Medical Sciences. 2016;40(1):42-8.

20      Hashemi A, Fallah F, Taherpour A, Goudarzi H, Erfanimanesh S, Taki E. Evaluation of Genetic Pattern and Determination of oqxA Gene Expression Levels among Clinical Isolates of Klebsiella Pneumoniae Strains. J Mazandaran Univ Med Sci. 2014;24(119):48-61.

21-A. Briales, J. M. Rodríguez-Martínez, C. Velasco et al., “Prevalence of plasmid-mediated quinolone resistance determinants qnr and aac(6′)-Ib-cr in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae producing extended-spectrum β-lactamases in Spain,” International Journal of Antimicrobial Agents, vol. 39, no. 5, pp. 431–434, 2012. View at Publisher · View at Google Scholar · View at Scopus

-22  Liu BT, Liao XP, Yang SS, Wang XM, Li LL, Sun J, et al. 1Escherichia coli isolates carrying plasmid-mediated quinolone resistance genes from diseased food-producing animals. J Med Microbiol. 2012; 61:1591-1599.

23- Kim HB, Wang M, Park CH et al. oqxAB encoding a multidrug efflux pump in human clinical isolates of Enterobacteriaceae. Antimicrob Agents Chemother 2009; 53: 3582–4.

در این پژوهش سعی بر بررسی فراوانی  مقاومت آنتی بیوتیکی باکتری کلبسیلاپنومونیه نسبت به یک سری آنتی بیوتیک مشخص  می باشد.بااین کار معین میشود چه در صد از این باکتری نسبت به این آنتی بیوتیک ها مقاوم شده اند.هم چنین وجود یا عدم وجود دوژن که عامل مقاومت هستند نیز بررسی می شود.

ندارد

بیمار باشزکت در این طرح درواقع کمک میکند تا درصد مقاومت آنتی بیوتیکی که یکی از معضل های علم پزشکی است مشخص شود وحداقل راجع به این باکتری وجلوگیری از گسترش مقاومت های آن تمهیداتی دردستور کارقرارگیرد.

ندارد

ندارد

چنانچه در این طرح اقدام تشخیصی یا درمانی صورت گیرد هزینه برعهده مجریان طرح است وبیمار هیچ هزینه ای پرداخت نخواهد کرد.

ندارد

نتایج این پژوهش صرفا جهت مقاصداین پژوهش استفاده داردونام ومشخصات بیمار کاملامحرمانه خواهد بود.

دکتر محمدبکاییان

آدرس میدان دکتر حسابی -دانشگاه علوم چزشکی -ساختمان پیراپزشکی-شماره تلفن:09153415601

دکترزندحقیقی: دانشگاه علوم پزشکی- تلفن 09151414547

مریم روشندل:خیابان باقری14-نبش میلان اول طبقه دوم واحددوم-تلفن09039824214

شرکت من در مطالعه کاملاً اختیاری است و آزاد خواهم بود که از شرکت در مطالعه امتناع نموده یا هر زمان  که مایل بودم بدون آنکه تغییری در نحوه رفتار پزشک درمانگر یا نحوه درمان و مراقبت از بیماری اینجانب ایجاد شود از پژوهش مذکور خارج شوم.

با توجه به اطلاعات موجود در این فرم و توضیحات حضوری مجری یا همکاران طرح موافقت خود را با شرکت در این مطالعه اعلان می نمایم. یک نسخه از این فرم به من داده شده و فرصت خواندن آن را داشته ام.

ندارد