راه اندازی و ارزیابی عملکرد، تست تشخیصی لمپ( تکثیر هم دما به واسطه حلقه) در تشخیص توکسوپلاسموزیس و بررسی میزان بار آلودگی به روش Real Time- PCR در بیماران همودیالیزی

عفونت توکسوپلاسمای یکی از شایع ترین عفونت های انگلی انسان و سایر حیوانات خونگرم با گستره ای جهانی است(1) . به طوری که شواهد سرمی نشان می دهد قریب یک سوم از جمعیت جهان به این عفونت انگلی آلوده اند(2) . این عفونت توسط تک یاخته ی اجباری داخل سلولی از شاخه ی ای پی کمپلکسا، به نام توکسوپلاسما گوندی ای، ایجاد می شود(3) . در چرخه تکاملی این انگل، گربه سانان اهلی و وحشی نقش میزبان نهایی، و طیـف وسـیعی از مهره داران خون گرم از جمله انسان نقش میزبان واسطه را ایفا می کنند. انسان از طریق خوردن آب و غذای آلوده به اواوسیست و یا گوشت خوب پخته نشده ی آلوده به کیست این انگل آلوده می گردد(4) . عفونت توکسوپلاسمایی ممکن است به اشکال مختلف ،حاد مزمن، و یا تحت بالینی رخ دهد . در مرحلـه حـاد عفونت، تاکی زوئیت های انگل سریعاً در سیتوپلاسم سلول های سیستم رتیکولواندوتلیال و سایر سلول های هسته دار بافتی تکثیر شده و به سرعت در سرتاسر بدن پراکنده می شوند و ممکن است در بیماران مبتلا به نفص سیستم ایمنی عفونت های وسیع و کشنده سیستمک را ایجاد نمایند با. این حال، در افرادی که از سیستم ایمنی طبیعی برخوردارند مواجه انگل با سیستم ایمنی بدن موجب بر انگیخته شده پاسخ های ایمنی سلولی و هومورال شده و در چنین شرایطی انگل برای فرار از سیستم ایمنی میزبان وارد سلول های بافتی از جمله سلول های عضلانی، سیستم عصبی و چشم شده و کانون های مزمن عفونت را تشکیل می دهند (5). در افرادی که آلودگی نهفته دارند و به بیماری هایی مانند ایدز ، همودیالیز و یا سرکوب سیستم ایمنی مبتلا می شوند ، ممکن است پاره شدن کیست ها و به دنبال آن تکثیر و افزایش تعداد تاکی زوئیت ها باعث فعال شدن مجدد عفونت شود (6). در بیمارن مذکور انسفالیت، پنومونی، کوریورتینیت، میوکاردیت و عفونت منتشر ناشی از توکسوپلاسموزیس از علل مهم مرگ و میر و ناخوشی محسوب می شود (7) . در ایران بیش از 85000 نفر مبتلا به سرطان و قریب 24000 نفر بیمار دیالیزی وجود دارد کـه سالانه 5500 نفر به تعداد آنها افزوده می شود. دیالیزدرنارسایی حادومزمن کلیه زمانی که درمان دارویی درکنترل حجم ،هایپرکالمی واسیدوزمتابولیک شکست بخوردیاعوارض شدید اورمی ماننداستریکسی ،فریکشن راپ،انسفالوپاتی وخونریزی اورمیک وجودداشته باشدیاBUNبیشتراز100mg/dlشودیاGFRبه 10 ml/min/1/73m3برسدانجام میشود.عوارض همودیالیزافت فشارخون،نوروپاتی اتونوم،حساسیت به مایع دیالیز،انمی،انتقال بیماریهایی مانندهپاتیت BوCوHIVاست .بیماران مبتلا به نارسایی مزمن کلیه و تحت همودیالیز، به واسطه اختلال در عملکرد لکوسیت ها و کاهش تعداد آن ها، اختلال در پاسخ های ایمنولوژیک مانند فاگوسیتوز و کموتاکسی و نیز اختلال در عملکرد کمپلمان دچار ضعف سیستم ایمنی بوده، مستعد ابتلا به عفونت های فرصت طلب می باشند. در زمینه شیوع عفونت های انگلی و قارچی در بیماران تحت همودیالیز مطالعات محدودی وجود دارد . میزان شیوع و بروز عفونت توکسوپلاسمایی و عوامل خطر دخیل در آن در مناطف مختلف جهان و حتی در نواحی مختلف یک کشور متفاوت است. (8،9،10) . شیوع عفونت در مناطق مختلف ایران نیز بر اساس وضعیت آب و هوایی متفاوت بوده به گونه ای که بیشترین شیوع توکسوپلاسموز به ترتیب در مناطق معتدل شمالی سپس مناطق معتدل و خشک کوهپایه ای و پس از آن مناطق سرد و کوهستانی شمال غرب و مرکز ایران، مناطق گرم و خشک مرکزی و گرم و مرطوب جنوب گزارش شده است. بر این اساس در مناطق معتدل و مرطوب شمال ایران شیوع عفونت در سنین پایین قابل توجه و در حدود 70 درصد، در مناطق سردسیر و کوهستانی شمال غرب و غرب ایران شیوع کلی بیماری در حد 18 تا 38 درصد، در مناطق معتدل و خشک کوهپایه ای غرب ایران حدود 33 تا 68 درصد، در مناطق گرم و خشک مرکزی ایران شیوع کلی به نسبت پایین و در حد 39 درصد و در مناطق گرم و مرطوب جنوب ایران شیوع در حد 20 تا 35 درصد گزارش شده است (11). همچنین شیوع عفونت در مناطق روستایی شمال کشور 7/55% ، استان های کوهستانی سردسیر 3/18% ، سیستان و بلوچستان /8/22% ، استان خوزستان 7/17 %و جنوب تهران 3/68 %گزارش شده است (12-14) .شیوع آنتی بادی علیه توکسوپلاسما گوندی ای در انسان در کرمان%32 ، ساری %40 ، کاشان 86 %و تهران 90 -36 %گزارش شده است (15). در دو مطالعه ای که توسط موسوی و حسن زاده به ترتیب بر روی افراد دیابتی و شیزوفرنیک در شهر زاهدان انجام شده بود شیوع توکسوپلاسموز در بیماران مبتلا به دیابت برای ژن RE (1/57%) و ژن B1 (8/67%) نفر مثبت و شیوع توکسوپلاسموزیس در بیماران شیزوفرنیک از میان 118 نمونه 43 نمونه(36.44%) به روش Nested-PCR-B1 مثبت تشخیص داده شد.بودند. (16-17).

با توجه به اهمیت بیماری در مبتلایان به بیماری های نقص سیستم ایمنی، آگاهی از میزان فراوانی عفونت توکسوپلاسمایی در بیماران مبتلا به ناسایی کلیه( دیالیزی ) از اهمیت بالایی برخوردار است زیرا با بالا رفتن BUN خون سیستم ایمنی دچار ضعف میشود . در تشخیص توکسوپلاسموز روش های سرولوژیک بیشترین کاربرد را داشته که تشخیص عفونت معمولاً با جداسازی آنتی بادی اختصاصی در خون انجام می شود، در انجام این آزمایشات توجه به نتایج مثبت کاذب و منفی کاذب اهمیت بسزایی دارد. اگرچه تشخیص توکسوپلاسموز بر مبنای آزمونهای سرولوژیکی است(زیرا روش پارازیتولوژی به عنوان گلدن استاندارد برای این بیماری به صورت یک متد تهاجمی مطرح است)، ولی این روشها در مواردی کارایی لازم را ندارند (18).روش های مولکولی وجود انگل را بر اساس آنتی ژن های آن و یا قطعه هایی از ژنوم اثبات می کند . روش هـای تشخیصی مولکولی برای شناسایی انگل توکسوپلاسمما شامل ،RAPD ،AFLP ،RFLP ،روش نشـانگر microsatellite تکنولوژی لومینسانس اساس بر ، LAMP , xMAP و Real-time PCR است ( 18)،

real- time PCR یک سیستم تکثیری آسان، سریع و اتوماتیک است که به عنوان عاملی بـرای کـاهش خطـر آلودگی در PCR مرسوم استفاده می شود (18). استفاده از PCR time-real به راحتی وجود نوکلئیک اسید در نمونه های بافتی را تأئید می کند و میزان آلودگی و یا وجود انگل را تخمین می زند . اسـتفاده از روش real- time PCR به عنوان یک متد حساس برای شناسایی توکسوپلاسما گوندی ای در نمونه های انسانی و حیوانی ثابت شده است (16). این تکنیک روشی سریع، حساس و کمی برای جداسازی توکسوپلاسما در نمونه های کلینیکی است و در مبتلایان به ایدز که به طور عمومی افزایش سطح ایمونوگلوبولین M و G را ندارند، کاربرد تشخیصی دارد (19-18).

تکثیر هم دما به واسطه لوپ (LAMP (یکی از تکنیک های جدیدتکثیراسیدهای نوکلئیک است که در تشخیص توکسوپلاسموزیس مورد استفاده قرار گرفته است.در این تکنیک با استفاده از 4 الی 6 پر ایمر مخصوص، 6 8تا ناحیه مشخص از DNA الگو شناسایی شده و یک DNA پلی مراز با خاصیت جانشینی رشته، DNA را بـا اختصاصیت، کارایی و سرعت بالا تکثیر می نماید. این روش می تواند تا 10⁹ کپی در مدت زمانی کمتر از یک ساعت تحت شرایط هم دمایی (36-65 درجه سانتی گراد )تکثیر نماید. یک بن ماری و یا یک بلوک حرارتی برای تکثیر DNA کافی است (21-20). با توجه به اهمیت و مخاطرات عفونت توکسوپلاسمایی در مبتلایان به بیماری های نقص سیستم ایمنی از جمله مبتلایان به سرطان و نارسایی کلیه و عدم وجود اطلاعات زمینه ای در خصوص فراوانی این عفونت انگلی در مبتلایان به نارسایی کلیه در استان سیستان و بلوچستان ، مطالعـه حاضر با هدف بررسی میزان فراوانی عفونت توکسوپلاسمایی در بیماران مذکور با استفاده از روش های ELISA ،LAMP و PCR time-Real براساس ژن RE پیشنهاد می گردد .

سابقه طرح و بررس ی متون :

Homan و همکاران در سال 2000 ،یک قطعه 529 جفت باز را دز ژنوم توکسوپلاسما گوندی ای گزارش کردند که 200 تا 300 بار تکرار شده و در مقایسه با ژن B1 بسیار دقیق تر و حساس تر می تواند آلودگی به انگل را تشخیص دهد. ضمناً آنان ابراز داشتند که این قطعه در تعین کمی تعداد کیست های مغزی موش های آلوده نیز قابل استفاده است (22).

Calderaro و همکاران در سال 2006 دو تکنیک PCR time-real با استفاده از FRET و TaqMan با

ژن تکرار شونده 529 جفت باز و rRNA 18S با ژن B1 را جهت تشـخیص توکسوپلاسموزیس در نمونه های بالینی استفاده نمودند. نتایج مطالعه این محققین نشان داد حساسیت آماری TaqMan و PCR nested تعداد10³ و FRET تعداد 10² تاکی زوئیت در هر میلی لیتر نمونه است (23).

Sotiriadou و همکاران در سال 2008 تکنیک های LAMP و PCR nested با استفاده از ژن های B1

و TgOWPو تکنیک ایمونوفلورسانت (IFT )جهت تشخیص آلودگی نمونه های آب به توکسوپلاسما گوندی ای را با هم مقایسه نمودند. بر اساس نتایج حاصله حساسیت LAMP و PCR nested به ترتیب 100% و 8/53 % گزارش گردید و با روش IFT آلودگی به توکسوپلاسما گوندی ای در هیچیک از نمونه های آب تشخیص داده نشـد(24).

Zhang و همکاران در سال 2009 محدودیت تشخیص LAMP را با ژن تکرار شونده 529 جفت باز 1 ul/pg

از DNA توکسوپلاسما گوندی ای گـزارش نمودند . همچنین نتیجه مقایسه تکنیک هـای LAMP و PCR استاندارد در تشخیص DNA انگل در نمونه غدد لنفاوی خوک های مشکوک به توکسوپلاسموزیس در مطالعه آنها نشان داد که روش LAMP بسیار حساس تر از PCR استاندارد قادر به تشخیص آلودگی به توکسوپلاسما در نمونه های مورد آزمایش است (25).

Kerastiva و همکاران در سال 2009 تکنیک های LAMP و PCR استاندارد را با استفاده از ژن SAG1 ،

جهت تشخیص توکسوپلاسما گوندی ای در ارگان های موش آلوده استفاده نمودند . نتایج آنها نشان داد که حساسیت روش LAMP حداقل 1000 برابر بیشتر از PCR استاندارد است (26).

Lau Ling Yee و همکاران در سال 2010 حساسیت و ویژگی تکنیک LAMP را با استفاده از ژن های

SAG1 ،SAG2 و B1 در تشخیص توکسوپلاسموزیس فعال در نمونه های خون انسان با روش nested- PCR مقایسه کردند و گزارش نمودند که تکنیک LAMP در تشخیص توکسوپلاسموزیس فعال 10 برابر حساس تر از nested- PCR است. هر دو تست در تشخیص توکسوپلاسما گوندی ای دارای ویژگی 100 %بودند (27).

Hu Xin و همکاران در سال 2012 به منظور تشخیص ژن B1 توکسوپلاسما گوندی ای در نمونه های ادرار با

استفاده از LAMP ،نشان دادند که این تکنیک قادر به تشخیص 1 پیکو گرم از DNA توکسوپلاسما گوندی

می باشد. LAMP قادر به تشخیص DNA انگل در ادرار موش های درمان شده با دگزامت ازون 90 روز پس ازآلودگی بود (28).

Kong Ming Qing و همکاران در سال 2012 گزرش نمودند که روش LAMP - bp 529 دارای حد

تشخیصی کمتر از fg 6/ 0 از DNA توکسوپلاسما بوده و حساسیت آن را نسبت به روش های B1-LAMP و nested PCR-529 bp ترتیب به 100 و 1000 برابر گزارش نمودند(21).

Lin Bing و همکاران در سال 2012 در مطالعه ای دو تکنیک LAMP و PCR time-real را با استفاده

از توالی تکراری 529 جفت باز در تشخیص توکسوپلاسموزیس با یکدیگر مقایسه نمودند . نتایج تحقیق آنان حد تشخیصی LAMP و PCR time-real را به ترتیب fg 10 و fg 1 از DNA توکسوپلاسما گوندی ای نشان داد(29).

Du F و همکاران در سال 2012 از تکنیک های LAMP و PCR با ژن های B1 ،قطعه 529 جفت باز و

MIC3 جهت تعیین آلودگی پارک های عمومی به اواوسیست توکسوپلاسما استفاده نمودنـد . در این مطالعه حدتشخیصی B1-PCR ،B529-PCR و MIC3-LAMP را به ترتیب 50و 5 ،5 اواوسیست در خاک گـزارش گردید(30).

درمطالعه ای دربیمارستان اهوازجهت شیوع توکسوپلاسموزیس دربیماران همودیالیزی روی 280بیمارو100نفرسالم،میزا نIgGدر3/29درصدهمودیالیزیها و26درصدافرادسالم مثبت بوددرروش الایزاومیزان IgMدر7/9درصدبیماران و4%گروه کنترل مثبت بود.pcrدر4نفراز280بیمارمثبت امادرگروه کنترل موردی مثبت نبود(31).

درمطالعه ای دیگردرقم وکاشان روی 50گیرنده پیوندکلیه و135بیمارهمودیالیزی و120فردسالم درسال2014-2015تستهای سرولوژی توکسوپلاسما انجام شد.سپس pcrدرهمه افرادIgMمثبت یاlgGمثبت باتیترانتی بادی متوسط وبالاصورت گرفت .IgGدر52%گیرندگان پیوندو63%دیالیزیها و33%گروه کنترل مثبت بود.DNAتوکسوپلاسموزیس در12%گیرندگان پیوندکلیه و7/1%دیالیزیهامثبت بود(32).

1. آیا فراوانی عفونت توکسوپلاسمایی در بیماران مبتلا به نارسایی کلیوی (همودیالیزی ) با استفاده از روش

الایزا در مقایسه با افراد سالم در شهر زاهدان متفاوت است؟

2. آیا فراوانی عفونت توکسوپلاسمایی در بیماران مبتلا به نارسا یی کلیوی (همودیالیزی ) با استفاده از روش

LAMP در مقایسه با افراد سالم در شهر زاهدان متفاوت است؟

3. آیا فراوانی عفونت توکسوپلاسمایی در بیماران مبتلا به نارسایی کلیوی (همودیالیزی ) بااستفاده از روش Nested-PCRدر مقایسه با افراد سالم در شهر زاهدان متفاوت است؟
4. آیا بار عفونت انگلی توکسوپلاسمایی در بیماران مبتلا به نارسا یی کلیوی (همودیالیزی ) با استفاده از روش PCR time-Real در مقایسه با افراد سالم در شهر زاهدان متفاوت است؟

ارزیابی تست تشخیصی لمپ( تکثیر هم دما به واسطه حلقه) در تشخیص توکسوپلاسموزیس و بررسی میزان بار آلودگی به روش Real Time- PCR در بیماران همودیالیزی

1. تعیین فراوانی عفونت توکسوپلاسمایی در بیماران مبتلا به نارسا یی کلیوی (همودیالیزی ) بااستفاده از روشالایزا در مقایسه با افراد سالم در شهر زاهدان
2. تعیین فراوانی عفونت توکسوپلاسمایی در بیماران مبتلا به نارسا یی کلیوی (همودیالیزی ) بااستفاده از روشLAMP در مقایسه با افراد سالم در شهر زاهدان
3. تعیین فراوانی عفونت توکسوپلاسمایی در بیماران مبتلا به نارسا یی کلیوی (همودیالیزی ) با استفاده از روش Nested-PCR در مقایسه با افراد سالم در شهر زاهدان
4. تعیین بار عفونت انگلی توکسوپلاسمایی در بیماران مبتلا به نارسا یی کلیوی (همودیالیزی ) با استفاده از روش PCR time-Real در مقایسه با افراد سالم در شهر زاهدان
5. تعیین حساسیت، ویژگی ، ارزش اخباری مثبت و منفی دو روش LAMP و Nested-PCR در مقایسه با روش روتین الایزا در بیماران مبتلا به نارسا یی کلیوی (همودیالیزی )
6. تعیین ضریب توافق کاپا دو روش LAMP و Nested-PCR در مقایسه با یکدیگر در بیماران مبتلا به نارسا یی کلیوی (همودیالیزی )  

،مراکزبهداشتی درمانی بااستفاده ازاین پانل آزمایشگاهی و تعیین فراوانی توکسوپلاسموزمی توانندباتشخیص به موقع عفونت جهت درمان ان اقدام قاطع انجام دهند

تاکی زوئیت : فرم فعال و تکثیر شونده توکسوپلاسما گوندی که به تمامی سلولهای هسته دار میزبان حمله کرده ودر مرحله حاد بیماری دیده می شود.

برادی زوئیت : فرم غیر فعال با تکثیر آهسته توکسوپلاسما گوندی که در داخل کیست نسجی ودر مرحله مزمن بیماری دیده می شود.

اووسیست : فرم حاصل از سیکل جنسی انگل در روده گربه که با مدفوع دفع شده و باعث آلودگی میزبانان واسط می شود.

الایزا (ELISA) : یک تکنیک ایمونوآنزیمی بیوشیمیایی است که بر پایه اندازه گیری کمپلکس رنگی آنتی‌ژن و آنتی‌بادی استوار است.

تکثیر هم دما به واسطه لوپ (LAMP) : یکی از روشهای جدید تکثیر اسیدهای نوکلئیک که DNA را با حساسیت و ویژگی بالا با استفاده از 4 الی 6 پرایمر اختصاصی تحت شرایط دمایی یکسان (°65) در مدت زمان یک ساعت تکثیر می کند

واکنش زنجیره پلی مراز در زمان واقعی (Real-time PCR):

همانطور که از معنی واژه Real-time PCR بر می آید مشاهده لحظه به لحظه یک فرایند می باشد. در این سامانه یک رنگ فلورسانت در طی واکنش PCR متناسب با میزان محصول در هر سیکل از خود نور مرئی ساطع می کند که توسط آشکارگر، شناسایی و ثبت می شود. اولین بار در سال 1992 Higuchi و همکاران با اضافه کردن اتیدیوم بروماید به مخلوط PCR جزء پیشگامان این تکنیک بودند. تکثیر قطعه ی مورد نظر باعث افزایش DNA دو رشته ای شد که اتیدیوم برماید به آنها باند می شود، و در نهایت توسط دستگاه ترموسایکلری که توانایی پرتودهی اشعه ماوراء بنفش را دارد، اندازه گیری می گردد

• زنجیره پلی مراز آشیانه ای (Nested-PCR): زنجیره پلی مراز آشیانه ای روش تغییر یافته ای از واکنش زنجیره پلی مراز است که برای کاهش آلودگی محصولات حاصله از تکثیر جایگاه های اتصال پرایمرغیر منتظره ابداع گردیده است. در این روش دو دسته پرایمر در دو مرحله متوالی واکنش زنجیره پلی مراز مورد استفاده قرارمی گیرد که دومین سری پرایمر جهت تکثیر یک هدف ثانویه در داخل اولین محصول بکار می رود .

موردی شاهدی

• بیماران همودیالیزی که در بازه زمانی یک سال به بخش دیالیز بیمارستان خاتم الانبیا و بیمارستان های امام علی (ع) مراجعه میکنند.

معیار ورود و خروج بر اساس تشخیص و مطالعات پزشک متخصص می باشد.

خروج: عدم رضایت برای شرکت در مطالعه

ورود: بیماران همودیالیزی بعلت نارسایی کلیه و در گروه شاهد از افرادی که نارسایی کلیه یا نقص ایمنی ندارند نمونه گیری میشود

- حجم نمونه و روش محاسبه آن:

ازآنجا که تعداد کلیه بیماران همودیالیزی زاهدان 160 نفر است لذا از همه 160 بیمارنمونه گیری خواهدشد و همین تعداد از گروه کنترل

غیراحتمالی دردسترس

برای ثبت نتایج مشاهدات از یک فرم جمع آوری اطلاعات استفاده می شود . که علاوه بر اطلاعات دموگرافیک شامل  نتایج آزمون های الایزا، LAMP ، Real time-PCR و Nested-PCR وتاریخ مشاهده می باشدکه ضمیمه نموده ایم .

فرم اطلاعاتی پایان نامه تحقیقاتی

راه اندازی و ارزیابی عملکرد، تست تشخیصی لمپ( تکثیر هم دما به واسطه حلقه) در تشخیص توکسوپلاسموزیس و بررسی میزان بار آلودگی به روش Real Time- PCR در بیماران همودیالیزی

ابتدا هماهنگی های لازم با معاونت تحقیقات و فناوری دانشگاه علوم پزشکی زاهدان و بیمارستان امام علی (ع) و خاتم زاهدان جهت نمونه گیری خون ازبیماران همودیالیزی صورت می گیرد و سپس پرکردن رضایت نامه جهت نمونه گیری و همچنین گرفتن اطلاعات دموگرافیک بیمار و در ج سوابق و آزمایشات کلیوی بیماران توسط رزیدنت عفونی و تحت نظر پزشک متخصص نفرولوژی انجام خواهد شد ودر ادامه نمونه های جمع آوری می گردد .

متعاقبا جهت مقایسه میزان شیوع ، به تعداد افراد همودیالیز از افراد سالم که این بیماری و سایر مشکلات ضعف سیستم ایمنی را ندارند نیز نمونه گیری میشود .5 میلی لیترنمونه خون ازهرفرد برای تجزیه و تحلیل آزمایشات سرولوژیکی و ملکولی جهت تشخیص توکسوپلاسموزیس گرفته می شود ، روش معمول تشخیص توکسوپلاسموزیس روش های سرولوژیکی است که متداول ترین آنها روش اندازه گیری جذب ایمنی با واسطه آنزیم (ELISA) می باشد. نمونه خون تمام بیماران همودیالیزی و گروه شاهد به منظورتهیه مایع بافی کوت در3000 دوردردقیقه به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژشده وسرم تمام بیماران و گروه شاهد نیز در C°20 - برای انجام آزمایشات نگهداری می شود .

سپس استخراج وتخلیص DNA از تمام نمونه های خون و تاکی زوئیت های انگل با استفاده از کیت انجام خواهد گرفت و پس از طراحی پرایمرهای مخصوص LAMP ، Nested PCR و Real time-PCR وراه اندازی وتعیین شرایط اپتیمم جهت واکنش LAMP تکنیکهای LAMP، Real time -PCRو Nested PCR با استفاده از ژن RE انجام خواهد شد .

BIP- 5´-TGGTTGGGAAGCGACGAGAGTTCCAGGAAAAGCAGCCAAG-3´

RE-LAMP FIP-5´-TCCTCACCCTCGCCTTCATCTAGGACTACAGACGCGATGC-3´

LF- 5´-TCCAAGACGGCTGGAGGAG-3´

1532222250. LB- 5´-CGGAGAGGGAGAAGATGTTTCC-3´

F3- 5´-CCACAGAAGGGACAGAAGTC-3´

B3- 5´-TCCGGTGTCTCTTTTTCCAC-3´

برای انجام آزمون PCR time-real ژن 529 جفت باز از پرایمرها و نشانگر زیر استفاده می شود :

P1: GCTCGCCTGTGCTTGGAG

P2: ATCTTCTCCCTCTCCGACTCTC

Probe: FAM-TCGCTTCCCAACCACGCCACCC-BHQ1

7- روش تحلیل و توصیف داده‌ها(نمونه‌ای از جدول توخالی ضمیمه شود و روش های آماری مورد استفاده به طور کامل توضیح داده شود):

حساسیت ، ویژگی و ضریب توافق تست ها (ضریب کاپا) ، وکارآیی تست های مولکولی توسط نرم افزار مدیکال کالکولیتور تجزیه و تحلیل خواهند شد .

حساسیت ، ویژگی و ضریب توافق تست ها (ضریب کاپا) ، وکارآیی تست های مولکولی توسط نرم افزار مدیکال کالکولیتور تجزیه و تحلیل خواهند شد .

دفترچه راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش های دارای آزمودنی انسانی

1 – هدف اصلی ارتقای سلامت انسان ها با رعایت کرامت و حقوق ایشان

2 – اولویت سلامت و ایمنی فرد فرد آزمودنی ها

3 - منافع بالقوه ی پژوهش برفرد آزمودنی بیش تر از خطر آن باشد

4 – فرد آزمودنی در نتیجه پژوهش نباید درمعرض خطر یا زیان قرار گیرد

7 – توقف بلافاصله پژوهش در صورتی که در حین اجرای پژوهش مشخص شود خطرات برای آزمودنی بیش از فواید بالقوه ی آن باشد

11 – اطلاعات و مدارکی که برای پایش از سوی کمیته اخلاق درخواست شود در اختیار این کمیته گذاشته شود

13 – کسب رضایت آگاهانه وآزادانه کتبی در پژوهش

14 – اطلاع دادن تغییرات در طول پژوهش به کمیته اخلاق

15 – اطلاع رسانی دقیق و آگاهانه فرد آزمودنی از اطلاعات پژوهش

17 – پژوهشگر ارشد مسئول مستقیم ارائه اطلاعات کافی برای آزمودنی و اخذ رضایت آگاهانه است

18 – در پژوهش هایی که از مواد بدنی (مایعات بدن انسان) استفاده شده نیز اخذ رضایت آگاهانه مطرح است

19 – عدم قبول شرکت در پژوهش نباید تاثیری بر خدمات درمانی ارائه شده در مرکز درمانی داشته باشد

25 – پژوهشگر مسئول رعایت اصل رازداری و حفظ اسرار آزمودنی ها برای جلوگیری از انتشار است

27 – درپایان پژوهش ، فرد آزمودنی حق دارد که درباره ی نتایج مطالعه آگاه شود

28 – نشر صادقانه ، دقیق و کامل نتایج پژوهش

29 – گزارش نتایج پژوهش باید ضامن حقوق مادی و معنوی تمامی اشخاص مرتبط با پژوهش باشد

31 – روش پژوهش نباید مغایر با ارزش های اجتماعی ، فرهنگی و دینی جامعه باشد

دفترچه راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی

1 – استفاده و نابودسازی نمونه ها با رعایت ملاحظات وشئون مرتبط

2 – پژوهش باید اهداف ارزشمندی در راستای مبارزه با بیماری ها و ارتقای سلامت انسان ها داشته باشد

3 – داشتن تایید کمیته اخلاق در پژوهش

4 – رضایت آگاهانه فرد دهنده شرط اساسی در تایید اخلاقی پژوهش است

6 – تمام اطلاعات که از افراد دهنده مورد پژوهش جمع آوری و ثبت شده راز حرفه ای تلقی می شود

7 – داشتن مهارت و امکانات لازم برای حفظ رازداری

8 – جلوگیری از هدررفت نمونه ها واستفاده بهینه از آن ها

9 – تامین تمهیدات لازم ایمنی برای جلوگیری از انتقال آلودگی

11 – عنوان زمان و نحوه و میزان اطلاع آزمودنی ها از نتایج پژوهش در رضایت نامه

12 – در صورت کمبود بافت یا عضو ، استفاده های درمانی اولویت دارند بر استفاده های پژوهشی

یکی دیگر از منابع خطا، خطای ابزار می باشد. فقط از دستگاههایی استفاده خواهد شد که قبلا توسط کارشناسان بخش کالیبره و استاندارد شده باشند(روایی آنها مورد تایید باشد).

-احتمال ناکارآمد شدن نمونه های خونی جمع آوری شده که بدین منظور نمونه های جمع آوری شده در شرایط مناسب و سریع جهت آزمایش به آزمایشگاه منتقل و آزمایش شدن

تهیه موادومعرف آزمایش که از خارج ازکشور تهیه میشودبه دلیل عدم ساخت در داخل کشور راه حلی ندارد.

LAMP, Toxoplasma gondi, hemodialysis patients

1.Dubey JP. Toxoplasmosis – a waterborne zoonosis. Vet Parasitol. 2004; 126(1-2): 57-72.

2.Weiss LM, Dubey IP. Toxoplasmosis: a history of clinical observations. Int J Parasitol. 2009; 39(8): 895-901.

3.Tenter AM, Heckeroth AR, Weiss LM. Toxoplasma gondii: from animals to humans. Int J Parasitol. 2000; 30(12-13): 1217-58.

4. Mandell GL, Bennett JE, Dolin R. Mandell, Douglas, and Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases. 7th ed. Philadelphia: Churchhill Livingston Elsevier. 2009.

5. Goebel S, Gross U,Lüder C.G.K. Inhibition of host cell apoptosis by Toxoplasma gondii is accompanied by reduced activation of the caspase cascade and alterations of poly (ADP ribose) polymerase expression. J Cell Sci 2001;114:3495-3505.

6. Flegr J,Striz I. Potential immunomodulatory effects of latent Toxoplasmosis in humans. BMC Infect Dis 2011;11(1):274.

7. Blader IJ,SAEIJ JP. Communication between Toxoplasma gondii and its host: impact on parasite growth, development, immune evasion, and virulence. APMIS 2009;117:458-476.

8. Petersen E. Toxoplasmosis. Semin Fetal Neonatal Med. 2007; 12(3):214-23.

9. Studenicová C, Bencaiová G, Holková R. Seroprevalence of Toxoplasma gondii antibodies in a healthy population from Slovakia. Eur J Intern Med. 2006 Nov; 17(7):470-3.

10. Beazley DM, Egerman RS. Toxoplasmosis. Semin Perinatol. 1998 Aug; 22(4):332-8.

-11 مصطفوی س ن، جلالی منفرد ل . مرور نظام مند مطالعات منتشر شده در زمینه ی اپیدمیولوژی توکسوپلاسموز در ایران . مجله دانشکده پزشکی اصفهان . 1391 .سال 30 ،شماره 176 ،ص 74 -87

12. Ghorbani M, Edrissian GH, Assad N. Serological survey of toxoplasmosis in the northern part of Iran, using indirect fluorescent antibody technique. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1978; 72(4):369-71.

13. Ghorbani M, Edrissian GH, Afshar A. Serological survey of human toxoplasmosis in mountainous regions of the north-west and south-west parts of Iran (1976-77). Trans R Soc Trop Med Hyg. 1981;75(1):38-40.

14. Salahi-Moghaddam A, Hafizi A. A serological study on Toxoplasma gondii infection among people in south of Tehran, Iran. Korean J Parasitol. 2009; 47(1):61-63.

-15 قاسمی ف، هوشیار ه. اهمیت توکسوپلاسموزیس و روشهای تشخیص آزمایشگاهی . آن مجله علمی سازمان نظام پزشکی جمهوری اسلامی ایران. 1393 .دوره 32 ، شماره ،1 ص -77. 65

16. Daryani A, Sarvi S, Aarabi M, Mizani A, Ahmadpour E, Shokri A, et al. Seroprevalence of Toxoplasma gondii in the Iranian general population: a systematic review and metaanalysis. Acta tropica. 2014;137:185-9

17. Ahmadpour E, Daryani A, Sharif M, Sarvi S, Aarabi M, Mizani A, et al. Toxoplasmosis in immunocompromised patients in iran: A systematic review and meta-analysis. Journal of Infection in Developing Countries. 2014;8(12):1503-10.

18. Tavares RG, Staggemeier R, Borges ALP, Rodrigues, Castelan LA, Vasconcelos J, Anschau ME, Spalding SM..Molecular techniques for the study and diagnosis of parasite infection. J Venom Anim Toxins Incl Trop Dis 2011;17:239-248.

19. Costa J M, Pautas C, Ernault P, Foulet F, Cordonnier C, Bretagne S. Real-time PCR for diagnosis and follow-up of Toxoplasma reactivation after allogeneic stem cell transplantation using fluorescence resonance energy transfer hybridization probes. J Clin Microbiol 2000;38(8):2929-2932.

20. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonikawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T. Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 2000; Vol.28, N.12,

21. Qing-Ming Kong, Shao-Hong Lu, Qun-Bo Tong, heng B, Kumagai T, Wen LY, Ohta N, Zhou XN. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): Early detection of Toxoplasma gondii infection in mice. Parasites & Vectors. 2012; 5:2

22. Homan W.L., Vercammen M., De Braekeleer J. and H. Verschueren. Identi®cation of a 200- to 300-fold repetitive 529 bp DNA fragment inToxoplasma gondii, and its use for diagnostic and quantitative PCR. International Journal for Parasitology. 2000; (30):69-75.

23. Calderaro A, Piccolo G, Gorrini C, Peruzzi S, Zerbini L, Bommezzadri S, Dettori G, Chezzi C. Comparison between two Real-time PCR assays and a nested-PCR for the detection of Toxoplasma gondii. ACTA BIOMED. 2006; (77) 75-80.

24. Sotiriadou I, Karanis P. Evaluation of loop-mediated isothermal amplification for detection of Toxoplasma gondii in water samples and comparative findings by polymerase chain reaction and immunofluorescence test (IFT). Diagnostic Microbiology and Infectious

Disease. 2008; (62):357–365.

25. Zhang H., Thekisoe Oriel M.M. Aboge Gabriel O. et al., Toxoplasma gondii: Sensitive and rapid detection of infection by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method. Experimental Parasitology. 2009; (122):47–50.

26. Krasteva D, Toubiana M, Hartati Sri, Kusumawati A, Dubremetz JF, Sri Widada J. Development of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a diagnostic tool of toxoplasmosis. Vet Parasitol. 2009; (162):327–331.

27. Lau YL, Meganathan P, Sonaimuthu P, Thiruvengadam G, NissapatornV, Chen Y. Specific, Sensitive, and Rapid Diagnosis of Active Toxoplasmosis by a Loop-Mediated Isothermal Amplification Method Using Blood Samples from Patients. J Clin Mic. 2010;

3698–3702.

28. Hun X, Pan CW, Li YF, Wang H, Tan F. Urine sample used for detection of Toxoplasma gondii infection by loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Folia Parasitologica. (2012; (59):21-26.

29. Zhibing Li,Yanlei Z, Houshuang Z., et al., Comparison of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) and real-time PCR method targeting a 529-bp repeat element for diagnosis of toxoplasmosis. Vet Parasitol. 2012; 185(2-4):296-300.

30. F. Du, H.L. Feng, H. Nie et al. Survey on the contamination of Toxoplasma gondii oocysts in the soil of public parks of Wuhan, China. Vet Parasitol. 2012; (184):141– 146.

31. Saki J, Khademvatan S, Soltani S, Shahbazian H. Detection of toxoplasmosis in patients with end stage renal disease by enzyme-linked immunosorbent assay and polymerase chain reaction methods parasitol2013:163-8

32.Rasti S.Hassanzadeh M.soliemani . serological and molecular survey of toxoplasmosis in renal transplant recipients and hemodyalisis patients in Kashan and Qom 2016 Jul 970-3

دراین پژوهش باتستهای سرولوژیکی ومولکولی لمپ وpcrدربین بیماران همودیالیزی مواردمبتلابه توکسوپلاسموزیس شناسایی ودرمان  می شوند

5ccخون ازهرفردبرای تجزیه وتحلیل ازمایشات سرولوژیکی ومولکولی جهت تشخیص توکسوپلاسموزیس گرفته می شود

غربالگری افرادازنظرسرولوژیکی ومولکولی جهت عفونت توکسوپلاسموزیس جهت درمان مواردمبتلا

احتمال ایجاد عفونت وهماتوم درمحل خونگیری

جبران عوارض احتمالی روش تشخیصی به عهده مجریان طرح تحقیقاتی می باشد

هزینه طرح برعهده مجریان طرح خواهدبودوبیمارهزینه ای پرداخت نمی کند

نتایج ازمایشها وروشهای به کاررفته به هطلاع بیمارخواهدرسیدواین نتایج کاملامحرمانه وصرفاجهت مقاصدپژوهش به کارخوههدرفت

دانشگاه علوم پزشکی زاهدان-09155722990

شرکت درمطالعه کاملااختیاری است وازادخواهم بودکه ازشرکت درمطالعه امتناع کنم یاازپژوهش خارج شوم

باتوجه به اطلاعات موجوددراین فرم وتوضیحات حضوری مجریان طرح موافقت خودراباشرکت دراین مطالعه اعلان می نمایم

فرم اطلاعاتی پایان نامه تحقیقاتی

راه اندازی و ارزیابی عملکرد، تست تشخیصی لمپ( تکثیر هم دما به واسطه حلقه) در تشخیص توکسوپلاسموزیس و بررسی میزان بار آلودگی به روش Real Time- PCR در بیماران همودیالیزی

سن....               جنس...............     سابقه دریافت همودیالیز(ماه).......