بیماری سل توسط مایکوباکتریوم توبرکلوزیس[1] ایجاد می شود و به عنوان دومین عامل  مرگ و میر ناشی از بیماری های عفونی در سرتا سر جهان شناخته شده است (1). علیرغم واکسیناسیون فعال و داروهای ضد سلی موثر ،این بیماری همچنان به عنوان یک چالش بزرگ جهانی مطرح است و تخمین زده می شود که سالانه حدود 9 میلیون نفر در جهان به فرم فعال این بیماری مبتلا می شوند و 1.5 میلیون نفر در اثر ابتلا به بیماری جان خود را از دست می دهند (2, 3) .طبق گزارش سازمان بهداشت جهانی[2] ،میزان بروز سل در سال 2016 در ایران ،14 نفر در هر 100000 نفر ، تخمین زده شده است که نسبت به سال  2015 (21 نفر در هر 100000 نفر ) کاهش داشته است (4).

شیوع بیماری سل در کشورهای هم مرز با ایران چندین برابر این مقدار گزارش شده است . با توجه به هم مرز بودن استان سیستان و بلوچستان با دو کشور افغانستان و پاکستان که در زمره ی کشورهای با نرخ بالای مبتلایان به سل می باشند و از طرفی نرخ بالای مهاجرت از این کشورها به استان، باعث شده بیماری سل همچنان به عنوان مشکل مهم و اساسی در ایران و بخصوص در استان سیستان و بلوچستان باقی بماند (5, 6).

در دهه های اخیر ،اپیدمیولوژی مولکولی، کمک شایانی به تدوین برنامه های کنترل و پیشگیری بیماری های عفونی نموده است . هدف از بررسی اپیدمیولوژی مولکولی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس، ژنوتایپینگ و مقایسه ی  DNA سویه های جدا شده به منظور آگاهی از وضعیت و نحوه ی سرایت بیماری می باشد . اساس کار بر این پایه استوار است که بیمارانی که با گروهی از سویه ها مبتلا شده اند از لحاظ اپیدمیولوژیکی با هم در ارتباط می باشند . بر این اساس مطالعات منطقه ای با هدف دستیابی به اطلاعاتی در مورد گونه و تایپ مایکوباکتریوم توبرکلوزیس شایع در منطقه و همچنین الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی آنها می تواند کمک شایانی به پزشکان در انتخاب راه درمان مناسب ارائه کند .  به نظر می رسد تمام سویه های درگیر در شیوع یک عفونت از اجزاء یک کلون باشند .ارتباطات کلونال در میان اعضاء کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ، توسط روش های تیپ بندی مولکولی تعیین می گردند که ممکن است به ناحیه خاصی محدود شود یا در کل جهان منتشر شود (7).

روش های مولکولی مانند IS[3]-6110، اسپولیگوتایپینگ[4] و[5] MIRU-VNTRجهت مشخص کردن ایزوله های بالینی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس به عنوان روشهایی متداول و قابل اتکا مورد استفاده قرار می گیرند (8).

روش IS6110 RFLP  ،به عنوان روشی مرسوم و  gold standard در ژنوتایپ بندی سویه های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس مطرح می باشد ولی از آنجایی که این روش بر اساس هیبریداسیون ساترن - بلات[6] می باشد ، بسیار پرزحمت و وقت گیر است و به مقدار زیادی DNA  نیاز دارد . به علاوه، مقایسه ی الگوهای بدست آمده بین آزمایشگاه های مختلف نیز دشوار می باشد که در نتیجه ی آن استفاده از این روش را محدود کرده است (9-12). بر همین اساس امروزه روشهای اسپولیگوتایپینگ و  MIRU-VNTR در ژنوتایپینگ سویه های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس رواج فراوان یافته اند (13).

روش VNTR  از سال 1985 و پس از آن روش اسپولیگوتایپینگ در سال 1997بر پایه روش PCR  برای اهداف تایپینگ به کار گرفته شدند که از مزایای آنها می توان به سرعت و سادگی این  روش ها و  از طرفی نیاز به مقدار کم DNA الگو جهت تایپینگ اشاره کرد .تایپینگ MIRU اغلب بر اساس 12 لوکوس پیشنهاد ساپلای[7] و همکاران ،که بیش ترین پلی مورفیسم را در بین 41 لوکوس دارند انجام می شود . بر اساس مطالعات انجام شده  قدرت تمایز این دوازده لوکوس تقریباً برابر قدرت تمایز IS6110- RFLP می باشد (8).

در مطالعه ی بوکلات[8] نشان داده شد که تکنیک تایپینگ MIRU-VNTR  ،قدرت تفکیک بالاتری نسبت به اسپولیگوتایپینگ دارد . بنابراین برای نمایش انتقال سل در جمعیت ارجحیت دارد (14).

در یک دهه ی اخیر مطالعات فراوانی بر پایه ی اپیدمیولوژی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در ایران انجام شده است .

 در مطالعه ای که توسط جعفریان و همکاران در سال های 86-85  بر روی 96 نمونه در مرکز سل کشوری مسیح دانشوری تهران، با هدف مقایسه ی میزان تقارب الگوهای ژنتیکی سویه های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس با استفاده از تکنیک MIRU-VNTR  انجام شد ، به این نتیجه رسیدند که بیش ترین تعداد و تنوع الگوهای ژنتیکی در استان تهران ،مربوط به منطقه ی جنوبی، از قسمت جنوب تهران تا منطقه ی میدان آزادی و در سطح کشور نیز مربوط به شهرهای مرزی کشور که همجوار با کشورهای افغانستان، عراق، ترکمنستان و همچنین شهرهای با درصد بالای مهاجر پذیری ، مشاهده گردیده است که نشان از وجود منابع آلوده ی مشترک بین بیماران می باشد .

در این مطالعه نشان داده شد که خانواده های دهلی/کس[9] با 49 مورد (35 درصد ) ،اوگاندا-[10]1 با 28 مورد (20 درصد ) ،نیو-1[11] با 16 مورد (11.4 درصد ) بیش ترین و خانواده های EA-1 با 1 مورد ،هارلم[12] با 3 مورد (2.1 درصد ) و H37-RV با 5 مورد (3.5 درصد )کم ترین الگوی ژنتیکی خانواده ها را به خود اختصاص داده اند (15).

مطالعه ی عظیمی و همکاران از بهمن 93 تا دی ماه 95 ، بر روی 80  ایزوله ی بالینی جدا شده از بیمارستان های آموزشی شهر تهران با هدف بررسی تنوع ژنتیکی و  نحوه ی انتقال سویه های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ، نشان دهنده ی حضور 78 پروفایل مختلف VNTR شامل 2 کلاستر و 76 الگوی غیر مشابه بود (16).

در مطالعه ای که با هدف شناسایی لایناژهای[13] ژنتیکی ، خانم ریاحی زانیانی و همکاران ، بر روی 55 ایزوله ی جدا  شده از مرکز سل ملاهادی در استان اصفهان به روش MIRU-VNTR typing بر پایه ی 24 لوکوس انجام شد ،مشخص گردید فراوان ترین لایناژ ، فرم جهانی اروپایی-آمریکایی[14] با درصد فراوانی 49.09% می باشد. بین 27 ایزوله ای که در این لایناژ جهانی قرار گرفته اند، فراوان ترین لایناژ ،نیو-،1 با درصد فراوانی 29% بود. لایناژهای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در اصفهان مشابه لایناژهای گزارش شده از منطقه مدیترانه شرقی می باشد و این مهم ، ارتباط اپیدمیولوژیکی این مناطق به هم را نشان می دهد. پایین بودن میزان خوشه بندی در این مطالعه نشان دهنده ی این است که بیماری سل در استان اصفهان در اکثر موارد به دلیل فعال شدن مجدد عفونت قبلی سل بوده و نقش بیماری جدید در اثر انتقال ، جزئی می باشد (17).

همچنین طی مطالعه ای که ولایتی و همکاران انجام دادند ،فراوان ترین خانواده ی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در بیماران ،مربوط به خانواده ی دهلی/کس و در نمونه های آب و خاک از خانواده ی T گزارش شده بود (18).

در مطالعه ای که رقیه مصطفی علی[15] و همکارانش با هدف بررسی مولکولار اپیدمیولوژی شهر بغداد روی بیماران مسلول  مراجعه کننده به مرکز بیماریهای ریوی بغداد طی سالهای 2009 و 2010 انجام دادند از مجموع 110  نمونه ای  که توسط تکنیک MIRU-VNTR بررسی نمودند ، بیشترین ژنوتایپ مربوط به ژنوتایپ CAS با فراوانی 6/39% بود (19).

 در مطالعه ای دیگر که توسط مووانگ[16] و همکارانش در کشور اوگاندا  انجام گردید ، ژنوتیپ T2 به عنوان غالبترین ژنوتایپ مشخص گردید (20).

لذا در این مطالعه با هدف تعیین تنوع ژنتیکی سویه های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس توسط ابزارهای مولکولی در شهر زاهدان و مقایسه ی سویه ها ی جدا شده در این مطالعه با سایر مطالعات، سیمای اپیدمیولوژیک و فیلوژنتیک این منطقه از کشور را بررسی می نماییم که با توجه به مطالعات صورت گرفته و امکانات موجود در این دانشگاه، روش  MIRU-VNTRبرای این منظور انتخاب گردید .

1. قرابت ژنتیکی با  استفاده از تکنیک MIRU-VNTR،بین سویه ها ی شهر زاهدان چگونه است ؟
2. ) کلاستر و ژنوتیپ سویه های مورد مطالعه چگونه است؟

تعیین الگوی ژنتیکی سویه های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس جدا شده از نمونه های خلط ،در منطقه با استفاده از روش تایپینگ MIRU-VNTR

1)تعیین قرابت ژنتیکی بین سویه ها ی شهر زاهدان با  استفاده از تکنیک MIRU-VNTR

2) تعیین کلاستر و ژنوتیپ سویه های مورد مطالعه

بیمارستان ها و مرکز مبارزه با سل جنوب شرق کشور

VNTR( Variable Number of Tandem Repeats )  is a location in a genome where a short nucleotide sequence is organized as a tandem repeat.

 مکانهایی در ژنوم می باشد که در آن یک توالی کوتاه، پشت سر هم تکرار شده است

Mycobacterium tuberculosis

A species of gram-positive, aerobic bacteria that produces tuberculosis in humans, other primates, cattle's, dogs, and some other animals which have contact with humans.

یک گونه ی باکتریایی گرم مثبت و هوازی است که عامل ایجاد کننده ی بیماری توبرکلوزیس در انسان ،دیگر پستانداران ،سگ ،گربه و بعضی دیگر از حیواناتی که تماس با انسان دارند ،می باشد.

Tuberculosis

Any of the infectious diseases of man and other animals caused by species of Mycobacterium tuberculosis.

یک نوع بیماری عفونی در انسان و دیگر حیوانات است که توسط مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ایجاد می شود.

Genotyping Techniques

Methods used to determine individuals' specific alleles or SNPS (single nucleotide polymorphisms).

روش هایی که برای تعیین آلل های خاص یا پلی مورفیسم های چند نوکلئوتیدی به کار گرفته می شود .

این مطالعه از نوع  توصیفی - مقطعی  می باشد .

سویه های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس، انتخاب خواهند شد ولی سایر سویه های مایکو باکتریوم (NTM) از طرح  خارج خواهند شد.

بر اساس مطالعات مشابه(رفرنس شماره 16-17-18 )  ،حجم نمونه 50 در نظر گرفته می شود .

نمونه گیری تصادفی ساده از نمونه های در دسترس

دفاتر ثبت اطلاعات درمانی بیماران

تکنیک آزمایشگاهی PCR

این مطالعه ی توصیفی – مقطعی ، به روش نمونه گیری تصادفی ساده، از نمونه های DNA مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در دسترس تائید شده به روش RD typing در مرکز سل زاهدان، به فاصله سال های  94 -93 ، انجام می گیرد.

در این مطالعه، با استفاده از روش MIRU_VNTR  با 24 لوکوس به عنوان یکی از روشهای مولکولار اپیدمیولوژیک ، ژنوتایپ این سویه ها مورد بررسی قرار خواهد گرفت .

آزمون PCR بصورت مستقل و انفرادی برای هر لوکوس صورت گرفته و به عنوان کنترل + ، از سوش H37Rv یا BCG Pasteur و از آب به عنوان کنترل منفی استفاده خواهد شد .

سپس  به روش ژل الکتروفورز در ژل آگارز 2% با ولتاژ 110V ،بعد از طی مدت زمان 4-3 ساعت ، وزن باندها با  استفاده از مارکرهای مناسب تخمین زده می شود و پس از آن ،تعدادکپی هر لوکوس تعیین می گردد. شمارش تکرار توالی های  MIRU_VNTR، در یک لوکوس ،در دو مرحله به دست می آید :

مرحله اول، PCR :در این مرحله برای هر لوکوس یک جفت پرایمر طراحی شده است که در نزدیک محل توالی های پشت سر هم می چسبد و باعث تکثیر ناحیه ی مورد نظر می شود.

مرحله دوم، سایز بندی محصولات  PCR : محاسبه ی تعداد تکرارها به وسیله ی کم کردن طول نواحی کناری و تقسیم حاصل طول واقعی قطعه بر طول یک توالی تکراری کنار هم انجام می گیرد.

سپس جهت تأیید اینکه باندهای حاصل از  محصولات   PCR، در آزمون MIRU-VNTR همان قطعات مورد نظر هستند، تعدادی از محصولات  PCRمربوط به لوکوس ها و آلل های مختلف جهت تعیین توالی[1] ارسال خواهد شد.

در خاتمه ،نتایج تعیین توالی با نرم افزارهای Blast و  Mega5 تائید می شوند.

توالی پرایمرهای مورد استفاده بر طبق روش معرفی شده توسط ساپلای و همکاران در جدول زیر آورده شده است :

در این مطالعه از برآورد شاخص های مرکزی و پراکندگی استفاده خواهد شد.

طرح تحقیقاتی بر اساس راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش های انسانی

کد 1-4-5-7-9-10-11--13- 14- 25-28-29-30-31

با توجه به شرایط ویژه شرکت‌های فروش مواد و تجهیزات موارد ذیل محتمل است:

• گران شدن آنزیمها و کیتها و مواد مصرفی
• دیر رسیدن مواد

راه حل: درخواست افزایش اعتبار و درخواست افزایش زمان اجرای طرح

MIRU-VNTR, mycobacterium tuberculosis, tuberculosis, genotyping techniques

• 1.            Mbugi, E.V., et al., Genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis isolated from tuberculosis patients in the Serengeti ecosystem in Tanzania. Tuberculosis, 2015. 95(2): p. 170-178.

· 2.         Glaziou, P., et al., Global epidemiology of tuberculosis. Cold Spring Harbor perspectives in medicine, 2015. 5(2): p. a017798.

· 3.         Organization, W.H., Regional strategy to stop tuberculosis in the Western Pacific 2011-2015. 2011, Manila: WHO Regional Office for the Western Pacific.

· 4.         Organization, W.H., Global tuberculosis report 2016. 2016.

· 5.         Zamani, S., et al., Genotyping of Mycobacterium tuberculosis Isolates from Hormozgan Province of Iran Based on 15-Locus MIRU-VNTR and Spoligotyping. International journal of bacteriology, 2016. 2016.

· 6.         Haeili, M., et al., Spoligotyping and drug resistance patterns of Mycobacterium tuberculosis isolates from five provinces of Iran. MicrobiologyOpen, 2013. 2(6): p. 988-996.

· 7.         Supply, P., et al., Automated high-throughput genotyping for study of global epidemiology of Mycobacterium tuberculosis based on mycobacterial interspersed repetitive units. Journal of clinical microbiology, 2001. 39(10): p. 3563-3571.

· 8.         Pourostadi, M., et al., Molecular Diversity of Mycobacterium tuberculosis Strains in Northwestern Iran. Jundishapur journal of microbiology, 2016. 9(9).

· 9.         Sougakoff, W., Molecular epidemiology of multidrug‐resistant strains of Mycobacterium tuberculosis. Clinical Microbiology and Infection, 2011. 17(6): p. 800-805.

· 10.       McEvoy, C.R., et al., The role of IS6110 in the evolution of Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis, 2007. 87(5): p. 393-404.

· 11.       Sun, Y.-J., et al., Use of mycobacterial interspersed repetitive unit-variable-number tandem repeat typing to examine genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis in Singapore. Journal of clinical microbiology, 2004. 42(5): p. 1986-1993.

· 12.       Dantas, N.G.T., et al., Genetic diversity and molecular epidemiology of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis in Minas Gerais State, Brazil. BMC infectious diseases, 2015. 15(1): p. 306.

· 13.       Groenen, P., et al., Nature of DNA polymorphism in the direct repeat cluster of Mycobacterium tuberculosis; application for strain differentiation by a novel typing method. Molecular microbiology, 1993. 10(5): p. 1057-1065.

· 14.       Bouklata, N., et al., Molecular Typing of Mycobacterium tuberculosis complex by 24-locus based MIRU-VNTR typing in conjunction with spoligotyping to assess genetic diversity of strains circulating in Morocco. PLoS ONE, 2015. 10(8): p. e0135695.

· 15.       Jafarian, M., et al., Comparison of the genetic convergence degree of Mycobacterium tuberculosis (TB) strains isolated from patients infected with TB by MIRU-VNTR technique. ZUMS Journal, 2011. 19(75): p. 25-36.

· 16.       Azimi, T., et al., Mycobacterium Tuberculosis Genotyping Using MIRU-VNTR Typing. Journal of Mazandaran University of Medical Sciences, 2017. 27(149): p. 40-48.

· 17.       Zaniani, F.R., et al., Genetic Lineages of Mycobacterium tuberculosis Isolates in Isfahan, Iran. Current Microbiology, 2017. 74(1): p. 14-21.

· 18.       Mustafa Ali, R., et al., Molecular epidemiology and genotyping of Mycobacterium tuberculosis isolated in Baghdad. BioMed research international, 2014. 2014.

· 19.       Huard, R.C., et al., Novel genetic polymorphisms that further delineate the phylogeny of the Mycobacterium tuberculosis complex. Journal of bacteriology, 2006. 188(12): p. 4271-4287.

20.       Velayati, A.A., et al., Identification and genotyping of Mycobacterium tuberculosis isolated from water and soil samples of a metropolitan city. CHEST Journal, 2015. 147(4): p. 1094-1102.

فرمی وجود ندارد

تعیین الگوی ژنتیکی سویه های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس جدا شده از نمونه های خلط بیماران مبتلا به سل درمنطقه ی زاهدان با استفاده از روش تایپینگ MIRU-VNTR در سال 1394-1393.

ندارد

بررسی الگوی ژنتیکی جهت  بررسی مقاومت دارویی و درمان و پیشگیری از ورود سویه های جدید به کشور ومقایسه و  پیدا کردن سویه های جدید در استان برای اولین بار

ندارد

ندارد

کار آرشیو است و با انسان سرو کار ندارد

ندارد

اطلاعات نمونه ها به صورت محرمانه حفظ می شود 

ندارد( اطلاعات آرشیو)

ندارد (اطلاعات آرشیو) 

به دلیل استفاده از اطلاعات آرشیو از کمیته اخلاق کسب اجازه می شود.