بررسی ایمونوهیستوشیمیایی بیان ژن CB1 و ارتباط آن با پلی مورفیسم ژن CNR1-1359G/A در لوله فالوپ در حاملگی نابجای لوله ای در مقایسه با گروه کنترل

لانه گزینی تخمک لقاح یافته در هر بافتی به ‌جز آندومتر رحم، حاملگی خارج رحمیPregnancies (EP) Ectopic نامیده می‌شودکه از مهم‌ترین علل مرگ  و میر مادران به شمار می‌آید. بر اساس گزارشی از سازمان جهانی بهداشت میزان مرگ ومیر مادران، ناشی از حاملگی خارج رحمی  10 درصد است.(1)

حاملگی خارج رحمی یک عارضه شایع در جهان است و میزان شیوع آن در کشورهای مختلف متفاوت است؛ به طوریکه شیوع آن در کشورهای در حال توسعه از ۱ در ۴۴ زایمان تا ۱ در ۲۱ زایمان متفاوت است، درحالی که در کشورهای پیشرفته غربی، شیوع آن بین ۱ در ۲۳۳ تا ۱ در ۲۸۰ زایمان متغیر است در مطالعات گوناگونی که در ایران انجام شده شیوع آن  بین 2-1% برآورد شـده اسـت.(2و3)

 البته مطالعات نشان داده‌اند که شیوع حاملگی خارج رحمی در آمریکا رو به افزایش است به طوری که طی ۲۵ سال گذشته میزان آن تا ۶ برابر افزایش داشته است. بر اساس آخرین آمار منتشر شده، شیوع حاملگی خارج رحمی از ۵/0 % در سال ۱۹۷۰ به ۲% افزایش داشته است که می تواند ناشی از افـزایش فاکتورهای خطرساز نظیر افـزایش شـیوع بیمـاریهـای مقـاربتی، استفاده از تکنولوژیهای کمک باروری، افزایش عمل توبوپلاسـتی (باز کردن لوله رحمی)  و مـصرف لونورژسـترول جهـت پیشگیری اورژانسی از بارداری باشد. همچنین بیماری  های التهابی لگن، استعمال دخانیات، افزایش سن و وضعیت اقتصادی اجتماعی هم جزء عوامل تاثیر گذار بر این بیماری هستند.(6-4)

همچنین  نباید نقش بهبود روش‌های تشخیص اولیه و پی بردن به عوامل خطرساز این عارضه را نادیده گرفت(7) البته میزان مرگ ومیر ناشی از آن به دلیل تشخیص زودهنگام کاهش یافته، ولی عوارض طولانی مدت و روانی آن همچنان بالا است.(8)

در حاملگی خارج رحمی جنین ممکن است در لوله رحم، تخمدان، سرویکس یا در سگمان داخلی لوله رحم و یا نواحی داخل ابدومن جایگزین شود. حاملگی نابجا  لوله ای 98 درصد حاملگی های خارج رحمی را شامل می شود.(9)

۷۵ تا ۸۰ در صد حاملگی‌های خارج رحمی در ناحیه آمپول لوله فالوپ، ۱۰ تا ۱۵ درصد موارد حاملگی خارج رحمی درقطعه ایسمی و حدود ۵ % حاملگی‌های خارج رحمی در انتهای فیمبریایی لوله رخ می‌دهد. حاملگی‌های خارج  رحم اینترستیشیال ۲ تا ۵ % از همه حاملگی‌های خارج رحمی را به خود اختصاص می‌دهد که اغلب در سه ماهه اول با مرگ و میر زیادی همراه است. حاملگی خارج رحمی تخمدانی نسبت به بقیه حاملگی‌ها نادر است و در حدود ۵/۰ تا ۱% حاملگی‌های خارج رحمی را شامل می‌شود.(10)

لوله فالوپ در انتقال گامت و جنین به حفره رحم نقش دارد و محل ظرفیت یابی ، لقاح و طی مراحل پیش لانه گزینی  و تکامل جنین است. انتقال اووسیت از لوله فالوپ به وسیله حرکات پریستالتیک عضلات طولی و حلقوی دیواره لوله فالوپ تسهیل می شود که انقباض ریتمیک آن قبل از اوولاسیون شروع می شود. همچنین زنش هماهنگ مژه ها و جریان مایع از طریق عملکرد اپیتلیوم مژه دار پوشاننده لوله انجام می شود.(9)

روش متـداول بـرای تشخیص حاملگی خارج رحمی، سنجش سـریال سـطح βHCG سرم و سونوگرافی ترانس واژینال است. بـا ایـن وجـود افتراق بین حاملگی خارج رحمی ، سـقط خـود بخـود و مراحـل اولیه حاملگی داخل رحمی در بسیاری موارد مشکل اسـت. برآورد شده که حدود 50% حاملگی های خارج رحمی با این روشها در مراحل اولیه تشخیص داده نمی‌شوند. سنجش سطح سرمی βHCG می‌تواند حاملگی طبیعی داخل رحمی را از یک حاملگی غیر قابل حیات افتـراق دهـد ولـی قادر بـه افتـراق حـاملگی داخـل رحمـی غیرقابـل حیـات از بــارداری خارج رحمی نیــست. افــت βHCG یــا افــزایش نامناسب آن در سنجش سریال، می‌تواند مطرح کننـده یک حاملگی غیر طبیعی باشد. البته در شـرایط اورژانـس ایـن نوع اندازه گیـری سـریال عملـی نیـست. لـذا اسـتفاده از بیومارکرهایی که قادر به افتراق رشد ترفوبلاست داخل لوله رحمی از حاملگی داخل رحمی باشند اهمیت دارد  که از جمله می‌توان به اندازه گیری سـطح پروژسـترون، ۱۲۵-CA، پروتئین A پلاسما وابسته به حـاملگی (PAPP-A)، فـاکتور رشــد انــدوتلیال عروقــی (VEGF) و کــراتین فــسفوکیناز (CPK) اشاره کرد.(11-17)

در چند دهه گذشته، بسیاری از محققان بر تغییرات چرخه‌ای بافت اندومتری رحم و سلول‌های ایمنی بدن  متمرکز شده‌اند. با این حال اخیراً بررسی بافت‌های دیگر تولید مثلی مانند گردن رحم و واژن با پیشرفت روش‌های شناخت بافت آسان‌تر شده است و ویژگی‌های سیستم ایمنی بدن و نقش هر سلول ایمنی در دستگاه تولید مثل در زنان هنوز تحت تحقیق و بررسی است. درک سیستم ایمنی دستگاه تناسلی زن بسیار مهم است و در بهبود باروری و نتایج حاملگی اهمیت زیادی دارد. دستگاه تناسلی زنان باید درحین حفظ توانایی پاسخ به عفونت، امکان بارور شدن، پیوند و بارداری را فراهم کند.(18)

جداسازی و شناسایی آناندامید ها ((AEAاولین بار در سال 1992 یعنی 4 سال پس از شناسایی رسپتورهای کانابینوئید (CB) انجام شد و مشخص گردید که مولکول بسیار مهمی در تقابل هورمون- رسپتور بلاستوسیست و اندومتر در مدل های تجربی است. تغییرات سطح AEA اندومتر باعث نقص لانه گزینی و بارداری می شود که نشان دهنده کاهش مسیرهای فعالیت آناندامیدها از طریق G پروتئین کوپل رسپتورهای  CB1 است  که برای مراحل اولیه بارداری موفق لازم است.  علاوه بر CB1  حرکات پریستالتیک عضله صاف لوله فالوپ و زنش مژه های سلول های پوششی جدار لوله نیز در انتقال موفقیت آمیز جنین نقش دارند. مطالعات نشان داده اند رسپتور CB1 در موش ناک اوت مونث نه تنها  نقص در بارداری ایجاد می کند بلکه در انقال جنین در لوله فالوپ هم اختلال ایجاد می کند که این امر منجر به حاملگی خارج رحمی می شود که نشان دهنده  اهمیت سیگنالینگ  AEA در باروری موش است.(19)

AEA و CB1 در سیستم عصبی مرکزی، تستیس، کبد، رحم ، قلب،  غده آدرنال هم مشاهده می شوند این گستردگی حضور نشان دهنده نقش آنها در در مسیرهای پاتوفیزیولوژیک است . سیستم های اندو کانانبینوئید بر بیماری هایی نظیر چاقی، دیابت و عوارض مربوط به آن، بیماری های نورودژنریتیو، التهابی، قلبی عروقی و کبد و سرطان ها نقش دارند.(20)

مطالعات مختلف نشان داده اند که القای التهاب و عفونت در موش مانع انقباض رحم با واسطه  CB1  می شود بنابراین این فرضیه مطرح می شود که مهار سیگنالینگ CB1 در لوله  فالوپ  می تواند منجر به آسیب های سلولی لوله فالوپ  و اختلال در انتقال جنین در  لوله  فالوپ  شود.(1)

ژن CNR1 رسپتور اندوکانانبینوئید نوع 1، بر روی 6q14-q15 قرار دارد. اخیرا پلی مورفیسم های متعددی بر روی ژن CNR1 در جمعیت های متعدد مورد مطالعه قرار گرفته اند. مطالعات گذشته بر روی ارتباط این پلی مورفیسم ها با بیماری هایی مانند اعتیاد ، شیزوفرنی و ... بوده و به ارتباطاتی بین این پلی مورفیسم ها با چاقی ، dyslipidemia  و بیماری های قلبی عروقی دست یافته اند.(21و22)

مطالعات نشان داده اند که پلی مورفیسم 1359 G/A ژن CNR1 منجر به جایگزینی G به A در کدون 435 می شودکه با شرایط پاتولوژیک مانند سندرم متابولیک، بیماری عروق کرونری، پره کلامپسی و بیماری Crohn's مرتبط است.(23و24)

در این راستا بررسی پلی مورفیسم ژن CNR1-1359G/A ( ژن کد کننده CB1)در میزان بیان ژن در ناحیه ای از لوله رحم که لانه گزینی نابجا در آن انجام شده در مقایسه با کنترل می تواند اطلاعات مفیدی در مورد مکانیسم اختلال در انتقال جنین در لوله فالوپ ارائه دهد.

مرور متون:

Teylor  و همکاران  در سال 2011  با بررسی سطح AEA در بارداری های کامل و دارای نقص و مقایسه آن با سطح (beta-HCG و پروژسترون ، نشان دادند که سطح بالای AEA در اوایل بارداری با نقص بارداری و غلظت βHCG ارتباط دارد اما  ارتباط معناداری با سطح پروژسترون  ندارد.(19)

مطالعه  fugedi و همکاران در سال 2014 بر  روی  میزان بیان CB1 و  CB2 در نمونه های جفت در بارداری سالم و  پره کلامپسی نشان داد که بیان CB1 در نمونه های پره کلامپسی افزایش داشته در حالیکه تغییر معنی داری  در بیان CB2   بین دو گروه مشاهده نشده است.(20)

Haung  و همکاران  مطالعه خود  را بر روی 55 زن باردار انجام دادند و آنها را بر اساس دریافت یا عدم دریافت  لوونورژسترول به دو گروه تقسیم کردند و سطح βHCG ، استروژن و پروژسترون سرم اندازه گیری شد. علاوه بر آن بیان رسپتورهای استروژن و پروژسترونی، فاکتور مهار کننده لوسمی، فاکتور رشد آندوتلیال عروق و رسپتور اندوکانانبینوئید CB1  در محل لانه گزینی نابجا و در پرزهای کوریون مورد بررسی قرار گرفت و تفاوت معناداری بین دو گروه از لحاظ فاکتورهای ذکر شده مشاهده نشد.(25)

Gebeh  و همکاران در سال 2012 با بررسی سطح اندوکانانبینوئید ها  و رسپتور های کانانبینوئید در لوله فالوپ در حاملگی خارج رحمی و نمونه های غیر باردار  دریافتند که سطح آناندامید ها در لوله فالوپ با حاملگی خارج رحمی  به طور معناداری نسبت به گروه کنترل سالم بالاتر است. همچنین نتایج مطالعه آنها نشان داد که بیان  CB1 در حاملگی خارج رحمی نسبت به گروه کنترل افزایش معنی دار داشته است.(26)

 در مطالعه  Horne و همکاران  در سال 2008 بررسی سطح   mRNA و پروتئین   CB1 در نمونه های لوله فالوپ و اندومتر رحم انجام شد. نتایج مطالعه آنها نشان داد که میزان بیان CB1 در فاز لوتئال نسبت به فاز فولیکولار و در اندومتر رحم نسبت به لوله رحم افزایش داشته است. (27)

Buraczynska و همکاران در سال 2014 به بررسی ارتباط بین  پلی مورفیسم CNR1  و مشکلات قلبی عروقی در بیماران مبتلا ب دیابت نوع 2 پرداختند و نتایج حاکی از فراوانی آلل A در بیماران دارای مشکلات قلبی عروقی بود. (21)

Kabza و همکاران در مطالعه خود  ارتباط بین پلی مورفیسم  رسپتور CNR1 را با پارامترهای متابولیک و آنتروپومتریک در زنان مبتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک مورد بررسی قرار دادند. نتایج مطالعه آنها نشان دهنده افزایش سطح LDL(low-density lipoprotein) در افراد دارای ژنوتیپ T/T نسبت به افراد دارای ژنوتیپ C/C و C/T  بود.(28)

با توجه به مطالعات انجام شده و نقش CB1، هدف از مطالعه حاضربررسی ایمونوهیستوشیمیایی بیان ژنCB1  و ارتباط آن با پلی مورفیسم  ژنCNR1 در  لوله فالوپ در حاملگی نابجای لوله ای در مقایسه با کنترل است. به این ترتیب امید است که با کسب اطلاعات جدیددراین مورد گامی در جهت تشخیص مسیر سیگنالینگ و مکانیسم اختلال انتقال جنین و کاربرد احتمالی آن در روند تشخیص و پیشگیری این عارضه در جامعه  برداشته شود.

- میزان بیان ایمونوهیستوشیمیایی CB1 در بافت لوله رحم در حاملگی نابجای لوله ای و در کنترل غیرحامله متفاوت است.

-میزان بیان  CB1  در سطح  mRNA در بافت لوله رحم در حاملگی نابجای لوله ای و در کنترل غیرحامله متفاوت است.

-فراوانی پلی مورفیسم CNR1-1359G/A   در افراد با حاملگی نابجای لوله ای و در کنترل غیر حامله متفاوت است.

- توزیع ژنوتیپ های پلی مورفیسم CNR1-1359G/A با استعداد ابتلا به حاملگی نابجای لوله ای ارتباط دارد.

بررسی  ایمونوهیستوشیمیایی  بیان ژن CB1 و ارتباط آن  با  پلی مورفیسم ژن CNR1-1359G/A در  لوله فالوپ در حاملگی نابجای لوله ای در مقایسه با گروه کنترل

1-تعیین ومقایسه میزان بیان ایمونوهیستوشیمی  CB1دربافت لوله رحم در حاملگی نابجای لوله ای و کنترل غیر حامله

2- تعیین ومقایسه میزان بیان  CB1در سطح mRNA  دربافت لوله رحم در حاملگی نابجای لوله ای و کنترلغیر حامله

3-تعیین ومقایسه فراوانی پلی مورفیسم CNR1-1359G/A  در موارد با حاملگی نابجای لوله ای و کنترل غیر حامله

4- -تعیین ارتباط بین  پلی مورفیسم CNR1-1359G/A و استعداد ابتلا به حاملگی نابجای لوله ای و کنترل غیر حامله

کلیه موسسات آموزشی پژوهشی و اساتید و دانشجویان رشته های مرتبط به این زمینه تحقیقاتی

- ایمونوهیستوشیمی (IHC : immunohistochemistry) روند تشخیص آنتی ژن (برای مثال پروتئینها) در سلول های یک مقطع بافتی توسط اصل اتصال آنتی بادی خاص به آنتی ژن در بافت های بیولوژیکی است.

-حاملگی خارج رحمی(Ectopic Pregnancy) لانه گزینی تخمک لقاح یافته درناحیه ای  خارج از رحم

واکنش زنجیره ای پلیمریزاسیون قطعه محدود شده: RFLP-PCR

مورد – شاهدی(Case-Control)

در این مطالعه زنان 18-45 سال که بعلت حاملگی خارج رحمی(لوله ای) تحت سالپنژکتومی قرار گرفته اند بعنوان گروه مورد و زنان با همین رنج سنی که بعلت هیسترکتومی و یا تقاضای بستن لوله (توبکتومی)تحت عمل جراحی شکمی و برداشتن قسمتی از لوله قرار گرفته اند با درنظر گرفتن معیارهای ورود و نداشتن معیار های خروج،بعنوان گروه شاهدوارد مطالعه می گردند.

معیارهای ورود: سن 18-45 سال،عدم وجود سالپنژیت حاد،عدم وجود هر گونه بیماری زمینه ای خاص و یا هرگونه بیماری نئوپلاستیک خوش خیم یا بدخیم،نداشتن سابقه قبلی حاملگی خارج رحمی،عدم مصرف استروژن وپروژسترون و هرگونه هورمون در سه ماه گذشته. تایید حاملگی خارج رحمی لوله ای با مراجعه به پرونده پاتولوژی فرد. برای گروه کنترل هیسترکتومی به علت میوم یا هموراژی و برداشت لوله برحسب تقاضای خود فرد با درنظر گرفتن معیارهای ورود فوق.

معیارهای حروج: وجود شوک هموراژیک قبل از عمل،عدم رضایت بیمار، وجود سایر انواع حاملگی خارج رحمی،دریافت متوتروکسات قبل از جراحی جهت درمان حاملگی خارج رحمی بصورت طبی

با توجه به شیوع متوسط حاملگی نابجا لوله ای در ایران و همچنین با توجه به حجم نمونه سایر مقالات مرتبط به پلی مورفیسم های ژنی، حجم نمونه برای هر گروه 100 نفر با سابقه حاملگی لوله ای  و شاهد برای بررسی پلیمورفیسم بر اساس نمونه خونی در نظر گرفته می شود. پس از تعیین ژنوتیپ ها از بین مواردی که منجر به جراحی شده و نمونه بافتی در دسترس قرار دارد بر اساس ژنوتیپ های مربوطه در هر گروه حداقل 10 نمونه مورد بررسی بیان بافتی در سطح پروتئین و mRNA قرار خواهد گرفت.

این مطالعه در بخش زنان بیمارستان علی ابن ابیطالب (ع)زاهدان و بخش بافت شناسی دانشکده پزشکی و نیز آزمایشگاه مرکز تحقیقات بیماری های عفونی و گرمسیری زاهدان  صورت می گیرد.هر دو گروه مورد و شاهداز بین بیماران مراجعه کننده به بیمارستان علی ابن ابیطالب (ع) زاهدان که یک بیمارستان ریفرال و مرجع در سطح استان است انتخاب می شود.گروه مورد از بین بیماران با حاملگی خارج رحمی لوله ای که علائم حیاتی پایدار داشته و کاندید سالپنژکتومی هستند و معیارهای ورود را دارند و معیار های خروج را نداشته باشند انتخاب می شوند. گروه کنترل از بین بیماران کاندید هیسترکتومی و یا توبکتومی که بیماری خاص زمینه ای نداشته با رعایت معیارهای ورود و خروج با تایید پزشک متخصص زنان و زایمان همکار طرح انتخاب می شوند. تست های مولکولی در آزمایشگاه مرکز تحقیقات بیماری های عفونی و گرمسیری زاهدان و فرآیند تهیه مقاطع بافتی، مطالعات ایمونوهیستوشیمی و فتو میکروگرافی در بخش بافت شناسی دانشگاه علوم پزشکی زاهدان انجام خواهد شد.

برای تعیین ژنوتیپ ابتدا استخراج DNAاز خون انجام و پلی مورفیسم مربوطه تعیین و در فرم ثبت می شود. سپس بر اساس نوع ژنوتیپ انتخاب نمونه های بافتی و بررسی بیان در آنها انجام و اطلاعات در فرم وارد و مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار خواهد گرفت.

ابتداجهت بررسی پلی مورفیسم CNR1-1359G/A ، 5 میلی لیتر نمونه خون محیطی از هر فرد گرفته شده و در لوله حاوی EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid ) به عنوان ماده ضد انعقاد منتقل و در دمای 80 – درجه سانتیگراد تا زمانی که استخراج DNA ژنومی بر روی نمونه های خون انجام شود فریز می گردد. استخراج DNA ژنومی با استفاده از روش نمک اشباع و به روش دستی انجام می شود. به طور خلاصه مراحل استخراج به شرح ذیل می باشد:

1. در یک میکروتیوپ 5/1 میلی لیتری به 500 میکرولیتر خون تام 1 میلی لیتر بافر لیزکننده1 اضافه کرده و با چند بار سر و ته کردن مخلوط و پس از 2 دقیقه مرحله بعد را انجام میدهیم.
2. مخلوط را به مدت 2 دقیقه در 12000rpm  در درجه حرارت اتاق سانتریفوژ و سوپرناتانت را دور میریزیم.
3. به رسوب 500 میکرولیتر بافر لیزکننده 1را اضافه و با پیپتاژ حل نموده سپس حجم را با بافر 1 به 1500 میکرولیتر رسانده و پس از چند بار سرو ته کردن به مدت 2 دقیقه در 6000 دور و دمای اتاق سانتریفوژ و محلول رویی را دور میریزیم.
4. به رسوب 400 میکرو لیتر بافر لیزکننده 2 ضافه کرده و به مدت 10 دقیقه در درجه حرارت اتاق قرار داده و با پیپتاژ رسوب را حل می نماییم.
5. به مخلوط مرحله چهار 100 میکرولیتر کلرید سدیم اشباع و 600 میکرولیتر کلروفرم اضافه کرده و به آرامی با چند بار سرو ته کردن میکروتیوب مخلوط کرده به طوری که یک مخلوط شیری رنگ ایجاد شود سپس به مدت دو دقیقه و در 6000 دور سانتریفوژ میکنیم(دمای اتاق).
6. 400میکرولیتر سوپرناتانت را به یک لوله تمیز انتقال داده و 800 میکرولیتر ایزوپروپیل سرد به آن اضافه نموده و به آرامی با چند بار سرو ته کردن میکروتیوب مخلوط می نماییم.
7. سپس تیوب ها را به مدت 2 دقیقه در دمای 4 درجه و 12000 دور سانتریفوژ میکنیم.
8. سوپر ناتانت را دور ریخته و به آن اتانول 70٪ سرد اضافه و با سرو ته کردن کردن تیوب ها مخلوط و سپس به مدت 2 دقیقه در 12000 دور و دمای 4 درجه سانتریفوژ میکنیم.
9. محلول رویی را دور ریخته و تیوب را وارونه روی دستمال قرار داده و اجازه می دهیم رسوب در هوای اتاق خشک شود (20 دقیقه).
10. به رسوب 100میکرولیتر آب مقطر استریل اضافه می کنیم.

 با استفاده ازدستگاه اسپکتروفوتومتر نسبت جذب نوری در طول موج260 نانومتر (طول موجی که DNA حداکثر جذب را دارد) به 280 نانومتر (طول موجی که در آن پروتئین حداکثر جذب را دارد) اندازه گرفته و نمونه هایی که بهترین خلوص را دارند(2>280/260 OD >1.8 ) در 80- درجه سانتیگراد جهت استفاده در فرایند PCR فریز می شوند. پرایمرهای اختصاصی برای بررسی پلی مورفیسم ژنی ذکر شده به روش  RFLP طراحی می شود. در مرحله بعد شرایط PCR برای تعیین این پلی مورفیسم بهینه می شود و سپس پلی مورفیسم ژنی ذکر شده در نمونه ها با این تکنیک آنالیز می شوند.

پس از تعیین ژنوتیپ انتخاب نمونه های بافتی بر اساس توزیع در زیر گروه های ژنوتیپی صورت خواهد گرفت.

روند کار بر روی نمونه های بافتی به روش زیر است:

پس از دریافت نمونه ها از اتاق عمل نمونه به دو بخش تقسیم می شود. بخشی از نمونه برای تعیین بیان در سطح mRNA  در نیتروژن مایع فریز می شود. آزمایش های مولکولی بر روی نمونه RNA استخراج شده از بافت با روش qRT-PCR انجام و میزان بیان بیومارکر   CB1   در سطح mRNA تعیین می گردد.

برای بررسی تغییرات بافت شناسی و میزان بیان پروتئین بیومارکر CB1  در نمونه های بافتی از تکنیک ایمونوهیستوشیمی بر روی بخش دیگر لوله که در فرمالین فیکس و مراحل پاساژ بافتی بر روی آن اعمال می شود استفاده خواهد شد.

استخراج RNA تام  ژنومی با استفاده از کیت استخراج RNA  بر روی نمونه های فریز شده در محیط نیتروژن مایع انجام می شود. با استفاده ازدستگاه اسپکتروفوتومتر نسبت جذب نوری 280/260  اندازه گرفته و نمونه هایی که بهترین خلوص را دارند(2>280/260 OD >1.8 )در 80- درجه سانتیگراد جهت استفاده در فرایند  QRT-PCR فریز می شوند. برای تعیین میزان بیان  RNA بیومارکر  از روش QRT-PCR (Quantification Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) یا واکنش زنجیره ای پلیمراز ترانس کریپتاز معکوس کمی استفاده خواهد شد. در این روش پس از طراحی و تهیه  پرایمرها و پروب های مناسب جهت تکثیر RNA و تولید CDNA مناسب و تکثیر آن برای بیومارکر، واکنش پلیمریزاسیون با استفاده از مواد اولیه خریداری شده از شرکت های معتبر و با استفاده از دستگاه Real Time انجام خواهد شد. پس از تصویب طرح، پرایمرها و پروب های مناسب جهت تکثیر RNA و تولید CDNA با استفاده از دیتا بانک NCBI به آدرس http:www.ncbi.nlm.nih.gov طراحی شده و جهت تولید به شرکت های معتبر سفارش داده خواهد شد. سپس کیت های حاوی مواد اولیه لازم جهت تولید  CDNA و تکثیر آن برای بیومارکر CB1 به صورت آماده از شرکت سیناکلون خریداری خواهد شد و مطابق دستور العمل کیت ارزیابی های ژنتیکی انجام و فراوانی ژنوتیپ CNR1 بررسی خواهد شد.

جهت بررسی ایمونوهیستوشیمیایی بیوپسی لوله رحم،اقدامات ذیل بر روی نمونه ها انجام خواهد شد: آماده سازی نمونه های بافتی،  قالب گیری نمونه ها، برش گیری، رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین و بررسی میزان بیان بیومارکر CB1  در بافت با استفاده از تکنیک ایمونوهیستوشیمی بر اساس دستورالعمل کیت های مربوطه.

ایمونوهیستوشیمی فرآیندی برای مکان‌یابی پروتئین‌ها در سلول های  یک بافت است. در این روش با استفاده ازآنتی‌بادی‌ها، آنتی ژن های سلولی شناسایی می‌شود. اساس این روش، قرار دادن برش‎های بافتی تحت تأثیر آنتی بادی‎های خاص برای تشخیص یک سری پروتئین خاص می‎باشد. پروتئین‎های مورد نظر از طریق اتصال آنتی بادی‎ها به یک سوبسترای رنگی شناسایی و حتی تعیین مقدار می‎شوند. به این صورت که محل قرار گیری این مواد ایمونولوژیک دقیقا شناسایی شده و با استفاده از آنتی بادی مناسب به همراه عمل کنژوگاسیون توسط مارکر اختصاصی در کنار محلول های رنگ آمیزی بر روی نمونه های مقاطع تهیه شده انجام می گردد. پس از انجام رنگ آمیزی کانون های کمپلکس  (Ag-Ab) به صورت رنگی مشخص می گردد. این کانون های رنگی دلیل بر وجود پروتئین های مورد نظر بوده و ارزش تشخیصی بسیار بالایی دارد.

نمونه ها بر اساس شدت و وسعت رنگ پذیری هسته (درصد هسته های مثبت) درجه بندی می شوند.درجه بندی شدت واکنش به صورت، منفی(0)، ضعیف(1)، متوسط(2) و شدید(3) و وسعت واکنش ایمنی به صورت ،کمتر از 5 درصد(0)، 6-25 درصد(1)، 26-50 درصد(2)، 51-75 درصد(3)، 75-100 درصد(4) در نظر گرفته می شود و در نهایت نتیجه نهایی هر نمونه محاسبه و به صورت درجات شدت بیان مثبت گزارش می شود که شامل: عدم بیان (- ، 0)، بیان مثبت ضعیف(+ ، 1-3)، بیان مثبت متوسط(++، 4-7) و بیان مثبت شدید(+++، 8-12) است.(29)

برای تعیین وجود یا عدم وجود تفاوت معنی دار در میانگین دو گروه مورد و شاهد از آزمون t مستقل استفاده خواهیم کرد(Independent student t test). یکی از نکات مهم در انجام این آزمون پیروی داده ها از توزیع نرمال می باشد و به همین منظور و برای اثبات تبعیت داده ها از توزیع نرمال ابتدا آزمون کولموگروف-اسمیرونوف (one sample Kolmogorov–Smirnov test) انجام خواهد پذیرفت.

همچنین هنگام مقایسه دو گروه ممکن است واریانس دو جامعه ای که نمونه ها از آن انتخاب شده اند با یکدیگر برابر باشند و یا برابر نباشند. در هر یک از این دو حالت روش محاسبه t و درجه آزادی F اندکی با یکدیگر متفاوتند. برای تشخیص هریک از این دو حالت از یکدیگر آزمون Levene test به منظور بررسی همسانی واریانس ها مورد استفاده قرار خواهد گرفت. آنالیز واریانس یک طرفه ANOVA و تست Tokeys posthoc برای مقایسه میانگین ها و تفاوت زیر گروه های آزمایشی مربوط به پلی مورفیسم های مختلف مورد استفاده قرار می گیرد. جهت مقایسه متغیرهای کیفی از تست کای اسکوئر و متغیرهای کمی از آزمون ANOVA و تست های نان پارامتریک استفاده خواهد شد. به منظور مقایسه و آنالیز متغیرهای وابسته ای که بیش از دو حالت دارند نیز از مدل رگرسیون لجستیک Multinomial Logistic Regression استفاده خواهد شد. جهت مقایسه فراوانی پلی مورفیسم ها از آزمون کای اسکوئر و برای مقایسه متغیرهای کمی از آزمون T-Test استفاده می گردد. در نهایت نتایج به صورت    گزارش می شود. برای آنالیز تمام داده ها و انجام تست های آماری از نرم افزار SPSS ویرایش 20 بهره خواهیم برد. هنگامیکه 05/0P< شود تفاوت ها معنی دار فرض خواهند شد.  

در این مطالعه کدهای 1،2،3،4،5،10،11،25،28،29،30،31 از دفترچه راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش‌های دارای آزمودنی انسانی و همچنین کدهای 1،2،3،6،7،8،9دفترچه راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی مربوط به بخش عمومی رعایت می شود.

مشکلات مربوط به تهیه مواد اولیه و تجهیزات آزمایشگاهی مورد نیاز عمده ترین محدودیت های اجرای طرح به نظر می رسد زیرا برخی از مواد مورد نیاز باید از منابع خارج از کشور تهیه شوند و در این ارتباط بحث تحریم های اقتصادی خودنمایی می کند. برای مدیریت این محدودیت و همچنین منابع مالی، برخی از محلول ها بصورت دستی تهیه خواهد شد.

Ectopic Pregnancy , Immunohistochemistry, gene polymorphism

منابع و مراجع

مراجع مورد استفاده براساس رفرانس نویسی ونکوور تنظیم گردد

1. Shao R. Understanding the mechanisms of human tubal ectopic pregnancies new evidence from knockout mouse models. Human Reproduction. 2010;  25(3): 584–587.
2. Obed S. Diagnosis of unruptured ectopic pregnancy is still uncommon in Ghana. Ghana medical journal. 2006; 40(1):3.
3. Barnhart KT, Sammel MD, Gracia CR, Chittams J, Hummel AC, Shaunik A. Risk factors for ectopic pregnancy in women with symptomatic first-trimester pregnancies. Fertility and sterility. 2006; 86(1): 36-43.
4. Amina A, Hanaa F, Doaa M, Zeinab E. The Role of creatinine phosphokinase (CPK) & β-human chorionic gonadotropin (βHCG) in the early diagnosis of ectopic pregnancy. Nature and Science. 2012;10.
5. Pereira PP, Cabar FR, Raiza LCP, Roncaglia MT, Zugaib M. Emergency contraception and ectopic pregnancy: report of 2 cases. Clinics. 2005;60(6):497-500.
6. Cabar FR, Pereira PP, Zugaib M. Intrauterine pregnancy after salpingectomy for tubal pregnancy due to emergency contraception: a case report. Clinics. 2007;62(5):641-2.
7. Chandrasekhar C. Ectopic pregnancy: a pictorial review. Clinical imaging. 2008;32(6):468-73.
8. Bouyer J. Epidemiology of ectopic pregnancy: incidence, risk factors and outcomes. Journal de gynecologie, obstetrique et biologie de la reproduction. 2003;32(7 Suppl):S8-17.
9. Khoo I, Van Noorden S, El-Bahrawy M. The Status of Interstitial Cells of Cajal in Fallopian Tubes with Ectopic Pregnancy. Sience domain.2014; 2(7): 376-386.
10. Valley VT, Mateer JR, Aiman EJ, Tkoma ME, Phelan MB. Serum progesterone and endovaginal sonography by emergency physicians in the evaluation of ectopic pregnancy. Academic emergency medicine. 1998;5(4):309-13.
11. Cabar FR, Fettback PB, Pereira PP, Zugaib M. Serum markers in the diagnosis of tubal pregnancy. Clinics. 2008;63(5):701-8.
12. Mueller MD, Raio L, Spoerri S, Ghezzi F, Dreher E, Bersinger NA. Novel placental and nonplacental serum markers in ectopic versus normal intrauterine pregnancy. Fertility and sterility. 2004;81(4):1106-11.
13. Scheid DC, Ramakrishnan K. Determining ectopic pregnancy risk using progesterone levels. American family physician. 2006;73(11):1892.
14. Daponte A, Pournaras S, Zintzaras E, Kallitsaris A, Lialios G, Maniatis A, et al. The value of a single combined measurement of VEGF, glycodelin, progesterone, PAPP-A, HPL and LIF for differentiating between ectopic and abnormal intrauterine pregnancy. Human Reproduction. 2005;20(11):3163-6.
15. Condous G, Kirk E, Syed A, Van Calster B, Van Huffel S, Timmerman D, et al. Do levels of serum cancer antigen 125 and creatine kinase predict the outcome in pregnancies of unknown location? Human Reproduction. 2005;20(12):3348-54.
16. Ugurlu EN, Ozaksit G, Karaer A, Zulfikaroglu E, Atalay A, Ugur M. The value of vascular endothelial growth factor, pregnancy-associated plasma protein-A, and progesterone for early differentiation of ectopic pregnancies, normal intrauterine pregnancies, and spontaneous miscarriages. Fertility and sterility. 2009;91(5):1657-61.
17. Singh A, Sh B. Serum creatinine kinase: an alternative diagnostic marker in rupture tubal pregnancy. Obstetrics Gynaecology India. 2005;55:451-3.
18. Givan AL, White HD, Stern JE, Colby E, Guyre PM, Wira CR, et al. Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina. American journal of reproductive immunology. 1997;38(5):350-9.
19. Taylor A H, Finney M, Patricia MW Lam MW P, Konje J C. Modulation of the endocannabinoid system in viable and non-viable first trimester pregnancies

                  by pregnancy-related hormones. Reproductive Biology and Endocrinology. 2011;                  9:152-170.

20. Fügedi G, Molnár M, Rigo JRJ, Schönléber J, Kovalszky I, Molvarec A. Increased placental expression of cannabinoidreceptor 1 in preeclampsia: an observational study.2014;14: 395-403.
21. Buraczynska M, Wacinski P, Zukowski P, Dragan M, Ksiazek A. Common polymorphism in the cannabinoid type 1 receptor gene (CNR1) is associated with microvascular complications in type 2 diabetes. Journal of Diabetes and Its Complications. 2014; 27: 35–39.
22. Plaksej JK, Laczmanski L, Milewicz A, Lenarcik-Kabza A, Trzmiel-Bira A, Zaleska-Dorobisz U, Lwow F, Hirnle L. Cannabinoid Receptor 1 Gene Polymorphisms and Nonalcoholic Fatty Liver Disease in Women with Polycystic Ovary Syndrome and in Healthy Controls. International Journal of Endocrinology.2014: 1-8.
23. Deluis DA, Pacheco D, Aller R, Gonzalez M, Sagrado R, Conde R, Izaola O, Cuellar L et al. G1359A polymorphism of the cannabinoid receptor gene (CNR1) and clinical results of

biliopancreatic diversion. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 2010; 14: 197-201.

24. Storr M, Emmerdinger J, Pfennig S, Ochsenkuhn T, Goke B, Lohse P, Brand S. The Cannabinoid 1 Receptor (CNR1) 1359 G/A Polymorphism Modulates Susceptibility to Ulcerative Colitis and the Phenotype in Crohn’s Disease. Plos one. 2010; 5(2): 1-6.
25. Haung CH, Zhang M, Meng CH, Shi W, Sun L, zhang J. Expressions of candidate molecules in the human fallopian tube and chorionic villi of tubal pregnancy exposed to levonorgestrel emergency contraception. Reproductive Biology and Endocrinology. 2013; 11:46-53.
26. Gebeh AK, Willets JM,  Marczylo EL, Taylor AH. Ectopic Pregnancy Is Associated with High Anandamide Levels and Aberrant Expression

                 of FAAH and CB1 in Fallopian Tubes. J Clin Endocrinol Metab, 2012;   97(8):2827–2835.

27. Horne AW, Phillips JA, Kane N, Lourenco PC, McDonald SE, Williams ARW,  Simon C, Dey KS, Critchley DOH. CB1 Expression Is Attenuated in Fallopian Tube and Decidua of Women with Ectopic Pregnancy.Plos one.2008;12(3): 3969-3975.
28. Lenarcik-Kabza A, Łaczmański L, Bidzińska-Speichert B, Pawlak M, Kolackov K, Kuliczkowska-Płaksej J, Trzmiel-Bira A, Brona A.  The influence of endocannabinoid receptor 1 gene variations on anthropometric and metabolic parameters of women with polycystic ovary syndrome. Endokrynologia Polska.  2014; 65 (3): 181-188.
29. Heidari Z, Mahmoudzadeh-Sagheb H, Jahantigh M,  Charkhat Gorgich EA. Immunohistochemical Expression of Ki67 and HER2 in Colorectal Cancer Compared to Adenomatous and Normal Samples. Int J Cancer Manag. 2017; 10(11): 1-9.

حاملگی نابجا لوله ای حدود 98 درصد حاملگی های خارج رحمی را شامل می شود. نتایج تحقیقات نشان می دهد که میزان مرگ و میر حاصل از آن در ایران در طول سالیان اخیر افزایش داشته است. نظر به اهمیت این بیماری در دنیا و با در نظر گرفتن میزان مرگ و میر ناشی از آن و با توجه به عدم وجود برنامه های غربالگری، تشخیص زودهنگام بیماری، افزایش بروز این بیماری ، دیدگاه ما در این پژوهش این است که با کمک تکنیک ایمونوهیستوشیمی و مولکولی و بررسی ژنوتیپ افراددر گیر این عارضه از نظر ژن مورد بررسی در این مطالعه به نتایج جدیدی در مورد شناسایی زودهنگام این اختلال دست یابیم.

دارد

ندارد

ندارد

ندارد

هزینه  آزمایشات  این طرح به عهده مجریان خواهد بود که توسط معاونت تحقیقات در اختیارشان قرار خواهد گرفت.

ندارد

نتایج بصورت کاملاً محرمانه و صرفاً جهت مقاصد پژوهش به کار خواهد رفت و هویت بیماری افراد در چارچوب قانون و جامعه و خانواده محرمانه خواهد ماند.

آدرس مجریان طرح جهت پاسخ گویی به سوالات بیماران شرکت کننده در مطالعه:

زاهدان، بزرگراه خلیج فارس، روبروی بیمارستان علی ابن  ابیطالب(ع) مجتمع پزشکی پردیس، گروه بافت شناسی

شرکت من در مطالعه کاملاً اختیاری است و آزاد خواهم بود که از شرکت در مطالعه امتناع نموده یا هر زمان  که مایل بودم بدون آنکه تغییری در نحوه رفتار پزشک درمانگر یا نحوه درمان و مراقبت از بیماری اینجانب ایجاد شود از پژوهش مذکور خارج شوم.

با توجه به اطلاعات موجود در این فرم و توضیحات حضوری مجری یا همکاران طرح موافقت خود را با شرکت در این مطالعه اعلام می نمایم. یک نسخه از این فرم به من داده شده و فرصت خواندن آن را داشته ام.

فرم اطلاعاتی طرح پژوهشی

بررسی  ایمونوهیستوشیمیایی  بیان ژن CB1 و ارتباط آن  با  پلی مورفیسم ژن CNR1-1359G/A در  لوله فالوپ در حاملگی نابجای لوله ای در مقایسه با گروه کنترل

اطلاعات زمینه ای:

نام ونام خانوادگی بیمار:                          تاریخ مراجعه:              

گروه : مورد ........شاهد .....                    شماره پرونده: .......                        

سن(سال)  :             سن حاملگی:           قد: .......وزن:.......BMI:.......

سطح هورمون بتا HCG .... 

سابقه بارداری:Gravida:…….parity:…….live:…….abortion:………..death:……….       

سابقه نازایی:دارد....ندارد....

روش پیشگیری از حاملگی مورد استفاده:  قرص     آیودی     باریر   سایر موارد

سابق عفونت لگنی: دارد        ندارد

سابقه وجود حاملگی نابجا در فامیل درجه یک:    دارد        ندارد

سابقه استفاده از داروهای هورمونی: دارد        ندارد

سابقه جراحی لگنی: دارد        ندارد

سابقه بیماری های سیستمیک، التهابی و متابولیک:      دارد        ندارد        نام بیماری:

سابقه مصرف سیگار....     میزان مصرف .....

سابقه مصرف مواد مخدر....        نوع ماده....    میزان مصرف .....

سمت جسم زرد:    راست     چپ         

هماهنگی جسم زرد با لوله مورد بررسی:      همان طرف.... سمت مقابل.....

ژنوتیپ CNR1-1359G/A: AA    AG   GG  

میزان بیان ایمونوهیستوشیمی

میزان بیان mRNA