بررسی پلی مورفیسم های ژن GREM1 (rs1129456 A>T,rs10318 C>T,rs12915554 C>A,rs3743105 G>A,rs7162202 T>G) در مبتلایان به شکاف لب و یا شکاف کام غیر سندرمی در جمعیت استان سیستان و بلوچستان

شکاف‌های دهانی غیرسندرمیک جزء فراوان‌ترین ناهنجاری‌های مادرزادی در تولدهای زنده محسوب می‌شوند؛ و شامل دو نوع مجزا می‌باشند که عبارت‌اند از 1: شکاف لب با و بدون شکاف کام (CL/P) 2: شکاف کام به‌تنهایی (CPO).(1)

شکاف لب آسیبی است مادرزادی که به‌صورت شکافی در لب فوقانی ظاهر می‌شود. این شکاف ممکن است تمام یا بخشی از لب را در برگرفته و گاهی یک‌طرفه و در حالت دیگر به‌صورت دوطرفه می‌باشد. در مواردی دیگر نیز نوزادی متولد می‌شود که شکافی در سقف دهان آن وجود دارد. این شکاف ممکن است سرتاسر کام و یا بخشی از آن را در برگیرد که در برخی مواقع یک‌طرفه و گاهی نیز دوطرفه می‌باشد. این ناهنجاری نیز مادرزادی بوده و گاهی به‌تنهایی مشاهده می‌شود و در مواردی هم به همراه شکاف لب ظاهر می‌گردد.(2)

شکاف کام به‌تنهایی (CPO) شیوع کمی دارد و به تعداد 1 به ازای 1500 تولد زنده که بیشترین میزان بروز آن می‌باشد. در مقابل شکاف لب با و بدون شکاف کام CL/P میزان شیوع تقریباً 2-1 به ازای 1000 تولد زنده داشته؛ که این میزان در آسیایی‌ها نسبت به اروپائی‌ها و آفریقایی‌ها بیشتر شایع است.(3)

که این مقدار فراوانی شکاف لب در ایران به میزان 1163/1 برآورد شده است.(4)

ازنظر تکامل جنینی در پایان هفته چهارم برجستگی‌های صورتی ظاهر می‌شوند؛ و در طی هفته پنجم، پلاکودهای (ضخیم شدگی‌های) بینی به سمت داخل حرکت کرده و گوده‌های بینی را به وجود می‌آورند که در ادامه تکامل یک تیغه بافتی در اطراف هر گوده تشکیل می‌شود و به‌این‌ترتیب برجستگی‌های بینی ایجاد می‌شود. سپس در طی دو هفته‌ی بعدی، برجستگی‌های ماگزیلاری (فک بالایی) بزرگ می‌شوند و در همین هنگام به سمت داخل رشد می‌کنند و برجستگی‌های داخلی بینی را به‌طرف خط وسط می‌فشارند و شکاف بین برجستگی داخلی بینی و برجستگی ماگزیلاری از بین رفته و این دو به هم جوش می‌خورند؛ بنابراین لب بالایی توسط دو برجستگی داخلی و دو برجستگی ماگزیلاری تشکیل می‌شوند. ساختاری که از ادغام دو برجستگی ماگزیلاری تشکیل می‌شود، قطعه بین ماگزیلاری (Inter maxillary segment) نام دارد. اگرچه کام اولیه از قطعه بین دو ماگزیلا مشتق می‌شود، اما قسمت عمده یا بخش اصلی کام نهایی توسط دو بیرون‌زدگی طاقچه مانند از برجستگی‌های ماگزیلاری ساخته می‌شود. سپس در طی روند تکاملی در هفته هفتم این زوائد بالا می‌روند تا در بالای زبان به‌صورت افقی درآیند و به یکدیگر متصل شوند و کام ثانویه را ایجاد می‌کنند. این اتصال در هفته هشتم شروع و در هفته دوازدهم کامل می‌شود.(5)

به علت عدم اتصال یا اتصال ناقص برجستگی ماگزیلاری به برجستگی داخلی بینی در یک سمت یا هر دو سمت نقصی به نام لب‌ شکری نیز ایجاد می‌شود.(6)

مشخص‌شده که طاقچه‌های کامی در جنس مؤنث تقریباً یک هفته دیرتر از جنس مذکر به هم متصل می‌شوند. این مسئله می‌تواند توجیهی برای شیوع بیشتر کام شکری منفرد در جنس مؤنث باشد.(7)

سبب‌شناسی شکاف‌های دهانی مخلوطی از فاکتورهای ژنتیکی و محیطی می‌باشد؛ که در بیماران با جمعیت‌های مختلف که سابقه خانوادگی مثبت دارند، فاکتورهای ژنتیکی در این بیماران نقش مهمی در تولدهای زنده همراه با این نقص ایفاء می‌کنند.(8) محققین در سال‌های اخیر به این نتیجه رسیده‌اند که فاکتورهای ژنتیکی مشخص  ، یک محیط مناسب برای اثر فاکتورهای محیطی خارجی ایجاد می‌کنند که این  باعث شروع مکانیسم آن‌ها می‌شود و هر دو باهم شکاف را ایجاد می‌کنند.(9, 10)

ژن GREM1 آنتاگونیست پروتئین مورفوژنتیک استخوان (BMPs)،2 و 4 و 7، می‌باشد؛ژن GREM1 بر روی بازوی بلند کروموزوم 15q13.q15 قرار دارد و در سلول‌های ستیغ عصبی بیان می‌شود و یک گلیکوپروتئین را رمزگذاری می‌کند. GREM1، یک گلیکوپروتئین به‌شدت حفاظت‌شده با20.7 کیلو دالتون،  و  یک عضو از خانواده DAN / سربروس است و دارای 184 اسید امینه می باشد. GREM1  مانع BMP از اتصال به گیرنده‌های خود با لیگاند شده و در شیوع CL / P نقش دارند. سیگنال‌های BMPs برای تکامل ناحیه craniofacial در دوره جنینی ضروری است. BMPs نقش مهمی در طول رشد و نمو جنین در الگودهی محورهای جنینی و تشکیل ساختار اسکلتی اولیه نقش دارد. به‌این‌ترتیب که اختلال در سیگنال‌های BMPs می‌تواند در طرح اولیه بدن جنین درحال‌تکامل دچار اختلال و ناهنجاری ایجاد کند. همچنین BMPs در الگودهی تکامل ناحیه سر و در القاء آپوپتوز سلول‌های ستیغ عصبی نیز نقش دارد. پس GREM1 برای مورفوژنز تکامل صورت نیز ارتباط و دخالت دارد .GREM1 به‌عنوان آگونیست فاکتور رشد اندوتلیالی عروقی (VEGFR2) نیز شناخته‌شده که بااتصال القای این فاکتور رشد فرایند Angiogenesis رو تحریک می‌کند .(11)

GREM1 در دوره جنینی یک تنظیم‌کننده برای رشد، تمایز و توسعه و به‌عنوان یک عامل برای پیشرفت فرایند angiogenic  نیز شناخته‌شده است. (12)

سیگنالینگ مسیر BMPS طی تکامل و رشد جنین ضروری می‌باشد.به‌طوری‌که در طی تکامل سر در دوره جنینی، این سیگنال در تکامل انواع ساختارها نقش دارد و ساختارهای متفاوتی را ایجاد می‌کند. این سیگنالینگ های BMPS در القاء، شکل‌گیری و مهاجرت سلول‌های ستیغ عصبی که در تشکیل بسیاری از ساختارهای سروصورت نقش اساسی دارد. از مشتقات سلول‌های ستیغ عصبی می‌توان تشکیل استخوان‌های صورت و جمجمه و بافت همبند و تشکیل بافت درم در ناحیه صورت و گردن را نام برد. پس سلول‌های ستیغ عصبی برای تشکیل قسمت اعظم کرانیوفاشیال ضروری می‌باشند در طی تکامل صورت که برجستگی‌های صورتی در هفته چهارم ایجاد می‌شوند این برجستگی‌ها که عمدتاً از مزانشیم مشتق از ستیغ عصبی می‌باشند ظاهر می‌شوند که برجستگی‌های ماگزیلاری در سمت خارج دهان اولیه و برجستگی‌های مندیبولار در سمت دمی دهان اولیه ظاهر می‌شوند و برجستگی‌های فرونتونازال که در اثر تکثیر بافت مزانشیمی مشتق از سلول‌های ستیغ عصبی در سمت ونترال وزیکول‌های مغزی به وجود می‌آید و لبه فوقانی دهان اولیه را تشکیل می‌دهد طی روند تکاملی دو برجستگی فرونتو نازال ضخیم شدگی‌های موضعی اکتودرم سطحی موسوم به پلاکود های نازال را تحت اثر القایی بخش ونترال مغز پیشین ایجاد می‌کنند در ابتدای روند تکاملی برجستگی ماگزیلاری و نازال لاترال توسط یک چین عمیق موسوم به ناودان نازولاکریمال از هم جدا هستند سپس اکتودرم کف ناودان شروع به تکثیر کرده و طناب اپی تلیالی توپری را ایجاد می‌کند سپس از اکتودرم پوشاننده روی خود جداشده و این طناب اپی تلیالی مجرا دار می‌شود و مجرای نازو لاکریمال رو ایجاد می‌کند البته پس از جدا شدن طناب برجستگی ماگزیلاری و نازال لترال در هم ادغام‌شده و سپس برجستگی ماگزیلاری بزرگ‌شده و فک فوقانی و گونه را تشکیل می‌دهند. (13) (14)

سلول‌های ستیغ عصبی که از سلول‌های نورو اپی تلیالی مجاور در اکتودرم سطحی و در طول تمامی لبه‌های چین‌های عصبی منشأ می‌گیرند چون سیگنال دهی BMPS در تثبیت ستیغ اکتودرمی رأسی مهم می‌باشد سپس مهاجرت سلول‌های ستیغ عصبی با عرضه شدن ژن‌هایی به سمت قوس‌ها آغازشده که در تشکیل ساختارهای مختلف در هر قوس حلقی شرکت می‌کنند. سیگنالینگ BMPS در طول اسکلت زایی craniofacial، یک سیگنال القایی اولیه است که برای مهاجرت، تجمع، تکثیر و تمایز تحریک‌شده موردنیاز است. پس‌ازآن، سیگنالینگ BMPS نقش‌های نظارتی در ساختار اسکلتی و مراکز رشد اسکلتی را ایجاد می‌کند. در تکامل سر جنین، این سیگنال در تشکیل انواع ساختارها نقش دارد. پس درنتیجه اثرات BMPS ها می‌تواند توسط آنتاگونیست های BMPS خارج سلولی تعدیل شود که بااتصال به BMPS و جلوگیری از اتصال آن‌ها به گیرنده‌های سطح سلولی خاص، سیگنال‌های BMPS را متوقف می‌کند. این آنتاگونیست های BMPS خارج سلولی عبارت‌اند از GREM1 و نوگین، کوردین، فلوستاتین را شامل می‌شود. جالب‌توجه است که سنتز این آنتاگونیست های BMPs خارج سلولی معمولاً توسط BMPS تحریک می‌شود که نشان می‌دهد که تعادل بین BMPS ها و آنتاگونیست های آن‌ها به‌خوبی حفظ می‌شود. درحالی‌که بیشتر آنتاگونیست ها عملکرد BMPS را در تمایز استئوبلاست ها محدود می‌کنند، مانند GREM1, ولی نقش جزئی تر آن‌ها در توسعه اسکلت مشخص نشده است. درواقع القای سلول‌های ستیغ عصبی نیاز به تداخلات مابین حاشیه اتصالی صفحه عصبی و اکتودرم سطحی (اپیدرم) دارد. غلظت‌های بینابینی BMPS در این منطقه مرزی دیده‌شده ولی سطوح BMPS در سلول‌های صفحه عصبی بسیار پایین و در سلول‌های اکتودرم سطحی بسیار بالا است؛ که انتاگونیست ها با اعمال اثر بر روی مهارکننده‌های BMPS آن را تنظیم می‌کنند. غلظت‌های بینابینی BMPS سبب القای سایر فاکتورهای نسخه‌برداری‌شده به‌طوری‌که حاشیه صفحه عصبی دارای محدوده‌های خاص می‌شود. سپس این فاکتورهای نسخه‌برداری یکسری موج‌های دوم نسخه‌برداری را القا کرده که به اختصاصیت سلول‌های ستیغ عصبی می‌انجامد و مهاجرت سلول‌های ستیغ عصبی را از نورواکتودرم می‌انجامد؛ بنابراین وضعیت لایه زایای اکتودرمی به غلظت‌های BMPS بستگی دارد. سطوح بالاتر سبب القای تشکیل اپیدرم و سطوح بینابینی در حاشیه صفحه عصبی و اکتودرم سطحی منجر به القای ستیغ عصبی و غلظت بسیار پایین سبب تشکیل اکتودرم عصبی می‌شود.BMPS مهاجرت سلول‌های ستیغ عصبی را تنظیم نموده به‌طوری‌که غلظت‌های غیرطبیعی این پروتئین با نقایص ستیغ عصبی در ناحیه کرانیوفاشیال همراه بوده است.(9, 15)

سرکوب GREM1 سبب افزایش BMP-2 و افزایش استخوان‌سازی سلول‌های بنیادی مزانشیمی انسان می‌شود؛ و همچنین عملکرد GREM1 در تمایز فرایند استئوژنیک به اثبات رسیده و دارای یک نقش مهارکننده osteogenesis است که نتیجه آن نشان‌دهنده عملکرد آن درروند تکاملی سر می‌باشد.(16)

بیان GREM1 و BMP4 در عضله اسکلتی جنین انسان نیز صورت می‌گیرد؛ و همچنین تنظیم تکثیر اجدادی myogenic در عضله اسکلتی جنین انسان توسط BMP4 و GREM1 صورت می‌گیرد.(17)

 GREM1 برای شروع تداخل‌های سیگنالینگ اپیتلیالی-مزانشیمی ضروری بوده و در طول سیگنالینگ اپیتلیالی-مزانشیمی در فرآیندهای organogenetic گوناگون ازجمله تکامل مورفوژنز در صورت ضروری می‌باشد. GREM1 در طول تکامل ناحیه فاشیال و ارگانوژنز اندام‌ها سیگنالینگ اپیتلیالی و مزانشیمی را تنظیم کرده درنتیجه جهش در GREM1 منجر به اختلالات ناحیه صورت و اندام‌ها می‌شود.(18)

در طول تکامل جنینی، GREM1 برای ایجاد ستیغ اکتودرمی رأسی) AER (ضروری می‌باشد و انواع مختلفی از سیگنال‌ها را بیان می‌کند که برای بیان SHH و پیشرفت morphogenesis ناحیه فاشیال و جوانه اندام را کنترل می‌کند.(19)

GREM1 باعث تقویت پیام‌هایی برای بیان SHH از ناحیه قطبی به ستیغ اکتودرمی رأسی را ایجاد می‌کند. سپس ژن SHH دستورالعمل‌هایی برای ساخت پروتئین به نام Sonic Hedgehog فراهم می‌کند. عملکرد این پروتئین به‌عنوان یک سیگنال شیمیایی برای رشد و نمو جنین ضروری است؛ و نقش مهمی در رشد، تخصصی شدن سلول و شکل‌گیری طبیعی الگوی بدن ایفا می‌کند؛ که این پروتئین برای تکامل ناحیه سر و گردن و مغز و نخاع (سیستم عصبی مرکزی)، چشم، و بسیاری از نقاط دیگر بدن مهم است.(20, 21)

غیرفعال شدن GREM1 منجر به نقایص شدید رشد در جنین شده؛ اما پیامدهای کلی و همه‌جانبه GREM1 در اسکلت پس از تولد هنوز مشخص نشده است. برای دانستن تأثیر GREM1 ابتدا BMPS باعث تمایز سلول‌های مزانشیمی به سلول‌های استئوبلاستی شده و باعث افزایش استئوبلاست ها و عملکرد استئوبلاست های بالغ در تکامل سیستم اسکلتی می‌شود. بیان بیش‌ازحد GREM1 در سلول‌های استروما مغز استخوان موجب کاهش سیگنالینگ BMPs می‌شود که یک اثر مخالف اثر BMP-2 بر استئوبلاست ها دارد. پس Grem1 به‌عنوان یک آنتاگونیست BMPs در بافت اسکلتی نقش دارد.(22)

GREM1،  با اثر بر روی BMP4 نقش مهمی در تکامل‌بخش‌های مختلف جنین در ناحیه کرانیوفاشیال دارد. (23)

این ناهنجاری‌ها عوارض فردی و اجتماعی متعدد و درازمدتی را در پی دارد. مبتلایان با احتساب وقت و هزینه بالا دوره طولانی از عمرشان را باید صرف درمان‌های جراحی، دندانی فکی، گفتاردرمانی و سایکولوژیک ناشی از این ناهنجاری‌ها نمایند.تحقیقاتی بر روی سبب‌شناسی ژنتیکی این بیماران انجام‌گرفته است که به نقش ژن‌ها در استعداد ابتلا به این بیماری اشاره داشته بر این اساس ما بر آن شدیم که در این استان که ازدواج‌های فامیلی درصد بالایی از ازدواج‌ها را به خود اختصاص می‌دهد بیماران مبتلابه شکاف لب و کام را ازنظر بررسی پلی مورفیسم‌های ژن GREM1 موردمطالعه و بررسی قرار دهیم و ببینیم که این پلی مورفیسم در برابر ابتلا به بیماری شکاف کام و لب نقش محافظتی دارد یا اینکه به‌عنوان یک عامل مستعد کننده عمل می‌کند.تا کنون تنها یک مطالعه در دنیا در ارتباط با پلی مورفیسم ژن GREM1   و ارتباط آن با NSCLP توسطXiaotong Wang1, و همکارانش بر روی یک جمعیت چینی صورت گرفته که. یافته‌ها نشان داد که پلی مورفیسم GREM1 به‌طور قابل‌توجهی با خطر ابتلا به NSOC در جمعیت چینی در ارتباط بود.(24)

تاکنون در ایران مطالعه‌ای در ارتباط این ژن با ناهنجاری شکاف لب و کام غیر سندرمیک صورت نگرفته درنتیجه مطالعه ما جهت مشخص کردن ارتباط این ژن با این ناهنجاری می‌باشد.

برسی متون و مقالات گذشته:

در مطالعه‌ای که در سال 2017 توسط Xiaotong Wang و همکارانش صورت گرفت ارائه شواهدی از rs1258763 به‌عنوان یک منبع خطر برای NSOC در یک جمعیت از چین بود که شناسایی شد که GREM1 یک ژن حساس NSOC است. تا حدودی، یافته‌ها و نتایج حاصل از آزمون جمعیت غیراروپایی به‌منظور شناسایی عوامل خطر NSOC برای هر جمعیت و برای درک بهتر ساختار ژنتیکی این بیماری ارائه‌شده است. علاوه بر این، حضور GREM1 تحت مدل غالب به طرز محسوسی مربوط به افزایش خطر ابتلا به CL / P در جمعیت چین بود.(11)

در مطالعه‌ای که در سال 2014 توسط Adrianna Mostowska و همکارانش بر روی یک جمعیت لهستانی صورت گرفت نتایج نشان می‌دهد که انواع ژنتیکی که بر سطح بیان GREM1 تأثیر می‌گذارند، به‌جای آنکه انواع تأثیرگذار بر عملکرد پروتئین کد شده، عامل مهمی در اتیولوژی NSCL / P باشند. درواقع تقویت GREM1 اثر قابل‌ملاحظه‌ای بر خطر ابتلا به شکاف کام همراه فراهم می‌کند. مطالعات مرتبط با همکاری‌های انجام‌شده در جمعیت‌های مختلف و همچنین مطالعات عملکردی در دستگاه‌های مختلف برای تائید نتایج ما و کشف نقش GREM1 و افزایش‌دهنده GREM1 در توسعه craniofacial موردنیاز است.(25)

در مطالعه‌ای که در سال 2007 توسط KOT, M و Kruk- Jeromini J در کشور لهستان انجام شد نتایج حاصله عبارت بودند از:

در 17 درصد از بچه‌ها با شکاف لب و یا شکاف کام تاریخچه خانوادگی پیدا شد.

نوع شکاف در فرزند ارتباطی با نوع شکاف یافته شده در پدر یا مادر نداشت، اما به جنس بچه ارتباط داشت.(26)

و در مطالعه‌ای که در Aug 1995 توسط Stein, J. Mulliken JB صورت گرفت در ارتباط با شناسایی ژن‌های مرتبط با شکاف لب غیر سندرمی با یا بدون شکاف کام (CL / P) انجام گرفت. پیشنهاد کرده‌اند که ژن‌ها نقش مهمی در اتیولوژی CL / P را ایفا می کند.در این مطالعه ارتباط 22 ژن در 11 خانواده multigenerational مورد آزمایش قرار گرفت، و نتایج شواهد قانع‌کننده‌ای برای ارتباط این ژن ها با CL / P داد.که در این مطالعه به‌طور گسترده‌ای شامل 39 خانواده CL / P چند نسلی بود؛ و 21 از این کاندیداها از مطالعه حذف شدند.(27)

در مطالعه‌ای که در سال 2013 توسط دکتر رفیق‌دوست و همکارانش بر روی ژن CDH1 و MSX1  در ارتباط این ژن‌ها با شکاف  لب و کام غیرسندرمیک  در یک جمعیت  ایرانی صورت گرفت نتایج  به این صورت بود که هر دو عامل ژنتیکی و محیطی می‌توانند به NS-CL / P کمک کنند.  در مطالعه  حاضر، بررسی اثر پلی مورفیسم های CDH1 و MSX1 ژن به حساسیت به CL / P در یک نمونه از جمعیت ایران انجام‌شده است. کهCDH1 نقش مهمی درتکامل و مورفولوژی craniofacial دارد..(28)

در مطالعه دیگری که دکتر رفیق دوست و همکارانش در سال 2017 بر روی ژن‌های WNT3 وwnt3aوwnt9a وwnt10a  و ارتباط  این ژن‌ها با شکاف لب و کام غیر سندرومیک در یک جمعیت ایرانی انجام گرفت نتایج حاصل نشان‌دهنده ارتباط پلی مورفیسم های این ژن‌ها در ایجاد این ناهنجاری را بیان می‌کرد .(29)

1. توزیع فراوانی پلی مورفیسم ژن  GREM1 (rs1129456 A>T) در مبتلایان به شکاف لب و/یا کام غیرسندرمیک در مقایسه با افراد سالم متفاوت است .
2. توزیع فراوانی پلی مورفیسم ژن GREM1 (rs10318 C>T)  در مبتلایان به شکاف لب و/یا کام غیرسندرمیک در مقایسه با افراد سالم متفاوت است .
3. توزیع فراوانی پلی مورفیسم ژن GREM1 (rs12915554 C>A)  در مبتلایان به شکاف لب و/یا کام غیرسندرمیک در مقایسه با افراد سالم متفاوت است .
4. توزیع فراوانی پلی مورفیسم ژن GREM1 (rs3743105 G>A)   در مبتلایان به شکاف لب و/یا کام غیرسندرمیک در مقایسه با افراد سالم متفاوت است .
5. توزیع فراوانی پلی مورفیسم ژن GREM1 (rs7162202 T>G)   در مبتلایان به شکاف لب و/یا کام غیرسندرمیک در مقایسه با افراد سالم متفاوت است .

بررسی پلی مورفیسم های ژن GREM1 (rs1129456 A>T,rs10318 C>T,rs12915554 C>A,rs3743105 G>A,rs7162202 T>G) در مبتلایان به شکاف لب و یا شکاف کام غیر سندرمی در جمعیت استان سیستان وبلوچستان.

1. تعیین توزیع فراوانی پلی مورفیسم  ژن GREM1 (rs1129456 A>T)   در مبتلایان به شکاف لب و شکاف کام غیر سندرمی و افراد سالم.
2. تعیین توزیع فراوانی پلی مورفیسم  ژن GREM1 (,rs10318 C>T)  در مبتلایان به شکاف لب و شکاف کام غیر سندرمی و  افراد سالم.
3. تعیین توزیع  فراوانی پلی مورفیسم  ژن GREM1 (,rs12915554 C>A)  در مبتلایان به شکاف لب و یا کام غیر سندرمی و  افراد سالم.
4. تعیین توزیع فراوانی پلی مورفیسم  ژن GREM1 (rs3743105 G>A)   در مبتلایان به شکاف لب و یا کام غیرسندرمی و  افراد سالم .
5. تعیین توزیع فراوانی پلی مورفیسم ژن GREM1 (rs7162202 T>G)   در مبتلایان به شکاف لب و یا کام غیرسندرمی و افراد سالم .

دانشگاه علوم پزشکی زاهدان

• آنتاگونیست: نوعی لیگاند و ماده شیمیایی قابل پیوند با گیرندهٔ سلولی
• Angiogenesis :تشکیل عروق خونی یا فرایند رگ زایی در دوره جنینی
• AER:ستیغ اکتودرمی رأسی در محورهای جنینی
• Morphogenesis: شکل‌گیری و تکامل ساختاری
• Organogenetic:تشکیل اندام‌ها در دوره جنینی
• مجرای نازولاکریمال:مجرای بینی اشکی
• کرانیوفاسیال:استخوان‌های سروصورت
• Osteogenesis:استخوان‌سازی

( Case – Control )موردی – شاهدی     

*افراد مبتلاء به شکاف لب و/یا کام غیرسندرمیک استان سیستان و بلوچستان

*کلیه مبتلایان به شکاف لب و/یا کام غیرسندرمی در دسترس مراجعه کننده به کلینیک  ENT در شهرهای مختلف استان  و همچنین نوزادان دارای شکاف لب و/یا کام غیرسندرمیک تازه متولد شده  در سطح زایشگاههای استان که ایزوله بودن بیماری آنها مورد تایید مشاور بالینی  متخصص (ENT ) باشند در گروه افراد بیمار قرار می گیرند.

برای گروه شاهد هم افراد سالم بدون بیماری زمینه ایی مثل دیابت و بیماری های قلبی - عروقی مادر زادی و هپاتیت و HIV  و بیماری های سیستماتیک و اتوایمون .دیالیزی  و مشکلات روانی از جمعیت استان سیستان و بلوچستان در گروه شاهد قرار می گیرد.

همچنین  گروه ها بر حسب جنس و سن نیزجدا شده اند.

نمونه گیری آسان و در دسترس برای نمونه های کنترل و شاهد*

     با توجه به محدودیت زمانی و افزایش هزینه طرح ٬ حجم نمونه 110 نفر در نظر گرفته شد تا در تجزیه و تحلیل آماری نیز خللی ایجاد نگردد و نمونه گیری بصورت آسان (حداقل 110 نفر بیمار و 110 نفر سالم) انجام می شود.

بارعایت نکات بهداشتی ازفرد 2میلی لیتر نمونه خون تهیه می نماییم

.

پس از مشخص شدن افراد مورد نظر و کسب رضایت آگاهانه از افراد،اقدام به تهیه 2سی سی نمونه خون کرده و نمونه ها را درشرایط مناسب محیطی قرار می دهیم و پس از تصویب پروپوزال پرایمرهای اختصاصی برای بررسی پلی مورفیسم های ژن GRAM1 (rs1129456 A>T,rs10318 C>T,rs12915554 C>A,rs3743105 G>A ,rs7162202 T>G) را  به روش PCR – RFLP طراحی کرده . در مرحله بعد شرایط PCR برای تعیین این پلی مورفیسم ها بهینه شده، سپس پلی مورفیسم ها ی ژنی ذکر شده درDNA نمونه خون افراد گروه شاهد و مورد (که  به روش salting out تخلیص شده) با این تکنیک آنالیز می شوند .

پس از گردآوری اطلاعات لازم، یافته ها در نرم افزار آماری SPSS  وارد گشته و داده ها با استفاده از آزمون­های آماری χ2  مورد تجزیه و تحلیل قرار خواهند گرفت.

بر اساس  کدهای راهنمای عمومی اخلاق در پژوهش‌های علوم پزشکی  دارای آزمودنی انسانی

1. هدف اصلی هر پژوهش‌باید ارتقای سلامت انسان‌ها توأم با رعایت کرامت و حقوق ایشان باشد.

2.در پژوهش بر آزمودنی انسانی، سلامت و ایمنی فرد فرد آزمودنی‎ها در طول و بعد از اجرای پژوهش، بر تمامی مصالح دیگر اولویت دارد. هر پژوهشی که بر روی آزمودنی انسانی انجام می‌گیرد، باید توسط افرادی طراحی و اجرا شود که تخصص و مهارت بالینی لازم و مرتبط را داشته باشند. در کارآزمایی‌های بالینی  بر روی بیماران یا داوطلب‌های سالم نظارت پزشک دارای مهارت و دانش متناسب الزامی است.

5. قبل از آغاز هر پژوهش پزشکی ، باید اقدامات  اولیه جهت به حداقل رساندن زیان احتمالی وارده به آزمودنی‌ها و تامین سلامت آن‌ها انجام گیرد.

10. هر پژوهشی باید بر اساس و منطبق بر یک طرح‌نامه (پروپوزال) به انجام برسد. در کارآزمایی‌های بالینی باید علاوه بر طرح نامه، دستورالعمل (پروتکل) نیز تهیه و ارائه شود. طرح‌نامه و دستورالعمل باید شامل تمامی اجزای ضروری باشد. از جمله بخش ملاحظات اخلاقی، اطلاعات مربوط به بودجه، حمایت کننده‌ها، وابستگی‌های سازمانی، موارد تعارض منافع بالقوه‌ی دیگر، مشوق‌های شرکت کنندگان، پیش بینی درمان و یا جبران خسارت افراد آسیب دیده در پژوهش .در مواردی که لازم است رضایت‌نامه‌ی آگاهانه به‌صورت کتبی اخذ شود، فرم رضایت‌نامه باید تدوین و به طرح‌نامه پیوست شده باشد. پیش از تصویب یا تأیید طرح‌نامه از سوی کمیته‌ی مستقل اخلاق در پژوهش، نباید اجرای پژوهش شروع شود.

11.کمیته‌ی اخلاق در پژوهش علاوه بر بررسی و تصویب طرح‌نامه و دستورالعمل، این حق را دارد که طرح‌‌ها را در حین و بعد از اجرا را از نظر رعایت ملاحظات اخلاقی مورد پایش قرار دهد. اطلاعات و مدارکی که برای پایش از سوی کمیته‌ی اخلاق درخواست می‌شود، باید از سوی پژوهشگران در اختیار این کمیته گذاشته شود.   

12.انتخاب آزمودنی‌های بالقوه از میان جمعیت بیماران یا هر گروه جمعیتی دیگر، باید منصفانه باشد، به‌نحوی که توزیع بارها (خطرات یا هزینه‌ها) و منافع شرکت در پژوهش، در آن جمعیت و کل جامعه، تبعیض‌آمیز نباشد.

13.کسب رضایت آگاهانه و آزادانه در هر پژوهشی که بر روی آزمودنی انسانی اجرا می‌شود، الزامی است. این رضایت باید به شکل کتبی باشد. در مواردی که اخذ رضایت آگاهانه‌ی کتبی غیر ممکن یا قابل صرف‌نظر باشد، باید موضوع با ذکر دلایل به کمیته‌ی اخلاق منتقل شود. در صورت تأیید کمیته‌ی اخلاق، اخذ رضایت کتبی قابل تعویق یا تبدیل به رضایت شفاهی یا ضمنی خواهد بود.

18.در پژوهش‌هایی که از مواد بدنی (شامل بافت‌ها و مایعات بدن انسان)  یا داده‌هایی استفاده می‌شود که هویت صاحبان آن‌ها معلوم یا قابل کشف و ردیابی است، باید برای جمع‌آوری، تحلیل، ذخیره‎سازی و /یا استفاده‌ی مجدد از آن‌ها رضایت آگاهانه گرفته شود. در مواردی که اخذ رضایت غیرممکن باشد یا اعتبار پژوهش را خدشه‌دار کند، می‌توان در صورت بررسی مورد و تصویب کمیته‌ی اخلاق ، از داده‌ها یا مواد بدنی ذخیره شده، بدون اخذ رضایت آگاهانه استفاده کرد.

22.از گروه‌های آسیب‌پذیر هیچ‌گاه نباید (به دلایلی چون سهولت دسترسی ) به عناون آزمودنی ترجیحی استفاده شود. پژوهش پزشکی با استفاده از گروه‌ها یا جوامع آسیب‌پذیر تنها در صورتی موجه است که با هدف پاسخگویی به نیازهای سلامت و اولویت‌های همان گروه یا جامعه طراحی و اجرا شود و احتمال معقولی وجود داشته باشد که همان گروه یا جامعه از نتایج آن پژوهش سود خواهد برد.

25.پژوهشگر مسؤول رعایت اصل رازداری و حفظ اسرار آزمودنی‌ها و اتخاذ تدابیر مناسب برای جلوگیری از انتشار آن است. هم‌چنین، پژوهشگر موظف است که از رعایت حریم خصوصی آزمودنی‌ها در طول پژوهش اطمینان حاصل کند. هرگونه انتشار داده‌ها یا اطلاعات به‌دست آمده از بیماران باید بر اساس رضایت آگاهانه انجام گیرد.

27.در پایان پژوهش، هر فردی که به‌عنوان آزمودنی به آن مطالعه وارد شده است، این حق را دارد که درباره‌ی نتایج مطالعه آگاه شود و از مداخلات یا روش‌هایی که سودمندی‌شان در آن مطالعه نشان داده شده است، بهره‌مند شود.

28.پژوهشگران موظفند که نتایج پژوهش‌های خود را صادقانه ، دقیق، و کامل منتشر کنند. نتایج، اعم از منفی یا مثبت، و نیز منابع تأمین بودجه، وابستگی  سازمانی، و تعارض منافع – در صورت وجود – باید کاملاً آشکارسازی شوند. پژوهشگران نباید در هنگام عقد قرارداد انجام پژوهش، هیچ  گونه شرطی را مبنی بر حذف یا عدم انتشار یافته‌هایی که از نظر حمایت کننده‌ی پژوهش  مطلوب نیست، بپذیرند.

31.روش پژوهش نباید با ارزش‌های احتماعی، فرهنگی و دینی  جامعه در تناقض باشد.

و بر اساس کد های راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی

1. پژوهشگر باید به این امر مهم توجه داشته باشد که بافت‌ها و اعضای مورد استفاده، دارای منشأ انسانی‌اند و کرامت انسانی اقتضا می‌کند که جمع‌آوری، نگه‌داری، استفاده و نابودسازی آن‌ها توأم با رعایت ملاحظات و شؤون مرتبط باشد.

2.از اجزای بدنی دارای منشأ انسانی باید تنها در پژوهش‌هایی استفاده شود که اهداف ارزشمندی را در راستای مبارزه با بیماری‌ها و ارتقای سلامت انسان‌ها دنبال می‌کنند.

3.تمامی پژوهش‌ها بر روی عضو و بافت انسانی، پیش از اجرا، باید مورد تأیید کمیته‌ی اخلاق در پژوهش مرتبط قرار گیرد. کمیته‌ی اخلاق در پژوهش حق دارد که در تمامی مراحل پژوهش بر آن نظارت داشته باشد. پژوهشگران باید در این زمینه با کمیته‌ی اخلاق در پژوهش همکاری کنند.

* عدم همکاری بیماران و خانواده هایشان در روند نمونه گیری،که با توضیح اهمیت پژوهش و آموزش صحیح میتوان آنرا تسهیل نمود

                * مطالعه بیماران دارای عارضه غیر سندرمیک می تواند در تعداد نمونه ها محدودیت ایجاد کند که با افزایش زمان اختصاص یافته جهت نمونه گیری می توان به تعداد نمونه واجد شرایط دست یافت

                مشکل تهیه مواد وامکان طولانی شدن زمان دریافت آنها

• آنتاگونیست: نوعی لیگاند و ماده شیمیایی قابل پیوند با گیرندهٔ سلولی
• Angiogenesis :تشکیل عروق خونی یا فرایند رگ زایی در دوره جنینی
• AER:ستیغ اکتودرمی رأسی در محورهای جنینی
• Morphogenesis: شکل‌گیری و تکامل ساختاری
• Organogenetic:تشکیل اندام‌ها در دوره جنینی
• مجرای نازولاکریمال:مجرای بینی اشکی
• کرانیوفاسیال:استخوان‌های سروصورت
• Osteogenesis:استخوان‌سازی

1.            Carinci F, Scapoli L, Palmieri A, Zollino I, Pezzetti F. Human genetic factors in nonsyndromic cleft lip and palate: an update. International journal of pediatric otorhinolaryngology. 2007;71(10):1509-19.

2.            Yao T, Yang L, Li P-q, Wu H, Xie H-b, Shen X, et al. Association of Wnt3A gene variants with non-syndromic cleft lip with or without cleft palate in Chinese population. Archives of oral biology. 2011;56(1):73-8.

3.            Letra A, Menezes R, Granjeiro JM, Vieira AR. AXIN2 and CDH1 polymorphisms, tooth agenesis, and oral clefts. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 2009;85(2):169-73.

4.            Yassaei S, Mehrgerdy Z, Zareshahi G. Prevalence of cleft lip and palate in births from 2003-2006 in Iran. Community dental health. 2010;27(2):118-21.

5.            Menezes R, Letra A, Kim AH, Küchler EC, Day A, Tannure PN, et al. Studies with Wnt genes and nonsyndromic cleft lip and palate. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 2010;88(11):995-1000.

6.            Švejda J. A case of fœtus pseudo‐amorphus. The Journal of Pathology. 1947;59(4):647-55.

7.            TW S. Longmans medical embryology, Head & Neck , Congenital anomalies Teimourzadeh Company. 2006;8 th p 273-8.

8.            Li Q, Kim Y, Suktitipat B, Hetmanski JB, Marazita ML, Duggal P, et al. Gene‐Gene Interaction Among WNT Genes for Oral Cleft in Trios. Genetic epidemiology. 2015;39(5):385-94.

9.            Sadler TW. Langman's medical embryology: Lippincott Williams & Wilkins; 2011.

10.          COLEMAN Jr CC, Hoopes JE. Congenital arteriovenous anomalies of the head and neck. Plastic and reconstructive surgery. 1971;47(4):354-64.

11.          Wang X, Song H, Jiao X, Hao Y, Zhang W, Gao Y, et al. Association between a single‐nucleotide polymorphism in the GREM1 gene and non‐syndromic orofacial cleft in the Chinese population. Journal of Oral Pathology & Medicine. 2017.

12.          Xiang Q, Hong D, Liao Y, Cao Y, Liu M, Pang J, et al. Overexpression of Gremlin1 in mesenchymal stem cells improves hindlimb ischemia in mice by enhancing cell survival. Journal of cellular physiology. 2017;232(5):996-1007.

13.          Noden DM. The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues. Developmental biology. 1983;96(1):144-65.

14.          Dalcq A. Introduction to general embryology. Introduction to general embryology. 1952.

15.          Wan M, Cao X. BMP signaling in skeletal development. Biochemical and biophysical research communications. 2005;328(3):651-7.

16.          Hu K, Sun H, Gui B, Sui C. Gremlin-1 suppression increases BMP-2-induced osteogenesis of human mesenchymal stem cells. Molecular medicine reports. 2017;15(4):2186-94.

17.          Frank NY, Kho AT, Schatton T, Murphy GF, Molloy MJ, Zhan Q, et al. Regulation of myogenic progenitor proliferation in human fetal skeletal muscle by BMP4 and its antagonist Gremlin. The Journal of cell biology. 2006;175(1):99-110.

18.          Hsu DR, Economides AN, Wang X, Eimon PM, Harland RM. The Xenopus dorsalizing factor Gremlin identifies a novel family of secreted proteins that antagonize BMP activities. Molecular cell. 1998;1(5):673-83.

19.          Michos O, Panman L, Vintersten K, Beier K, Zeller R, Zuniga A. Gremlin-mediated BMP antagonism induces the epithelial-mesenchymal feedback signaling controlling metanephric kidney and limb organogenesis. Development. 2004;131(14):3401-10.

20.          Lettice LA, Heaney SJ, Purdie LA, Li L, de Beer P, Oostra BA, et al. A long-range Shh enhancer regulates expression in the developing limb and fin and is associated with preaxial polydactyly. Human molecular genetics. 2003;12(14):1725-35.

21.          Odent S, Attié-Bitach T, Blayau M, Mathieu M, Augé J, Delezoïde A, et al. Expression of the Sonic hedgehog (SHH) gene during early human development and phenotypic expression of new mutations causing holoprosencephaly. Human molecular genetics. 1999;8(9):1683-9.

22.          Canalis E, Parker K, Zanotti S. Gremlin1 is required for skeletal development and postnatal skeletal homeostasis. Journal of cellular physiology. 2012;227(1):269-77.

23.          Church RH, Ali I, Tate M, Lavin D, Krishnakumar A, Kok HM, et al. Gremlin1 plays a key role in kidney development and renal fibrosis. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 2017;312(6):F1141-F57.

24.          Xiaotong Wang1 HS, Xiaohui Jiao1, Yanru Hao3, Wei Zhang2, Yuwei Gao1, Yong Li1, Na Mi1,, Yan4. J. Association between a single-nucleotide polymorphism in the GREM1 gene and

nonsyndromic orofacial cleft in the Chinese population. Original Article. 2017;123:345.

25.          Mostowska A, Hozyasz KK, Wójcicki P, Żukowski K, Dąbrowska A, Lasota A, et al. Association between polymorphisms at the GREM1 locus and the risk of nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate in the Polish population. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 2015;103(10):847-56.

26.          Małgorzata Kot JK-J. Analysis of family incidence of cleft lip and/or palate. Med Sci Monit  2007;13(5(CR231-4.

27.          Stein J, Mulliken JB, Stal S, Gasser DL, Malcolm S, Winter R, et al. Nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate: evidence of linkage to BCL3 in 17 multigenerational families. American journal of human genetics. 1995;57(2):257.

28.          Hooshang Rafighdoost PD, Mohammad Hashemi, Ph.D., Abdolreza Narouei, M.Sc., Ebrahim Eskanadri-Nasab,, M.Sc. GD-K, M.D., Mohsen Taheri, Ph.D. Association Between CDH1 and MSX1 Gene Polymorphisms and the Risk of Nonsyndromic Cleft Lip and/or Cleft Palate in a Southeast Iranian Population. The Cleft Palate-Craniofacial Journal. 2013;50(5):e98–e104.

29.          Sajjaddi HRDMHHA. Evaluation of  WNT3 (rs3809857 G/T) and  Wnt3A (rs752107 C/T and rs3121310 A/G) and Wnt10a (C392T) and Wnt9A (rs15865526 A/G) Polymorphisms in Non Syndromic Cleft lip and/or palate in Sistan & Baloochestan Population The Cleft Palate-Craniofacial Journal. 2017;50(5) pp:e98–e104.

بررسی پلی مورفیسم های ژن GREM1 (rs1129456 A>T,rs10318 C>T,rs12915554 C>A,rs3743105 G>A,rs7162202 T>G) در مبتلایان به شکاف لب و یا شکاف کام غیر سندرمی در جمعیت استان سیستان و بلوچستان.

شکاف لب آسیبی است مادرزادی که به‌صورت شکافی در لب فوقانی ظاهر می‌شود. این شکاف ممکن است تمام یا بخشی از لب را در برگرفته و گاهی یک‌طرفه و در حالت دیگر به‌صورت دوطرفه می‌باشد. در مواردی دیگر نیز نوزادی متولد می‌شود که شکافی در سقف دهان آن وجود دارد. این شکاف ممکن است سرتاسر کام و یا بخشی از آن را در برگیرد که در برخی مواقع یک‌طرفه و گاهی نیز دوطرفه می‌باشد. این ناهنجاری نیز مادرزادی بوده و گاهی به‌تنهایی مشاهده می‌شود و در مواردی هم به همراه شکاف لب ظاهر می‌گردد.ازنظر تکامل جنینی در پایان هفته چهارم برجستگی‌های صورتی ظاهر می‌شوند؛ و در طی هفته پنجم، پلاکودهای (ضخیم شدگی‌های) بینی به سمت داخل حرکت کرده و گوده‌های بینی را به وجود می‌آورند که در ادامه تکامل یک تیغه بافتی در اطراف هر گوده تشکیل می‌شود و به‌این‌ترتیب برجستگی‌های بینی ایجاد می‌شود. سپس در طی دو هفته‌ی بعدی، برجستگی‌های ماگزیلاری (فک بالایی) بزرگ می‌شوند و در همین هنگام به سمت داخل رشد می‌کنند و برجستگی‌های داخلی بینی را به‌طرف خط وسط می‌فشارند و شکاف بین برجستگی داخلی بینی و برجستگی ماگزیلاری از بین رفته و این دو به هم جوش می‌خورند؛ بنابراین لب بالایی توسط دو برجستگی داخلی و دو برجستگی ماگزیلاری تشکیل می‌شوند. ساختاری که از ادغام دو برجستگی ماگزیلاری تشکیل می‌شود، قطعه بین ماگزیلاری (Inter maxillary segment) نام دارد. اگرچه کام اولیه از قطعه بین دو ماگزیلا مشتق می‌شود، اما قسمت عمده یا بخش اصلی کام نهایی توسط دو بیرون‌زدگی طاقچه مانند از برجستگی‌های ماگزیلاری ساخته می‌شود. سپس در طی روند تکاملی در هفته هفتم این زوائد بالا می‌روند تا در بالای زبان به‌صورت افقی درآیند و به یکدیگر متصل شوند و کام ثانویه را ایجاد می‌کنند. این اتصال در هفته هشتم شروع و در هفته دوازدهم کامل می‌شود.به علت عدم اتصال یا اتصال ناقص برجستگی ماگزیلاری به برجستگی داخلی بینی در یک سمت یا هر دو سمت نقصی به نام لب‌ شکری نیز ایجاد می‌شود.

ژن GREM1  آنتاگونیست پروتئین مورفوژنیک استخوان BMPs   می باشد این ژن بر روی بازوی بلند کروموزوم   15q13.q15 قرار دارد  و در سلول های ستیغ عصبی بیان می شود و یک گلیکوپروتیین را رمز گذاری می کند GREM1  یک گلیکوپروتیین به شدت حفاظت شده با 20.7 کیلودالتون  و یک عضو از خانواده DNA  سربروس است و دارای 184 اسید امینه می باشد GREM1  مانع BMPs  از اتصال گیرنده به لیگاند شده و در شیوع  CLP نقش دارند که سیگنال های BMPS برای  تکامل ناحیه  کرانیوفاشیال در دوره جنینی ضروری  می باشد GREM1  در دوره  جنینی یک تنظیم کننده برای رشد و تمایز و توسعه و به عنوان یک عامل برای پیشرفت فرایند آنژیوژنز شناخته شده است .سرکوب GREM1  سبب افزایش BMPS 2  و افزایش استخوان سازی سلول های بنیادی مزانشیمی انسان می شود و همچنین عملکرد GREM1  در تمایز فرایند استئوژنیک به اثبات رسیده در طول تکامل جنینی GREM1  برای ایجاد ستیغ اکتودرمی راسی ضروری می باشد و انواع مختلفی از سیگنال ها را بیان می کند که برای بیان SHH  و پیشرفت مورفوژنز ناحیه فاشیال  و جوانه اندام را کنترل می کند .

پس از مشخص شدن افراد مورد نظر و کسب رضایت آگاهانه از افراد،اقدام به تهیه 2سی سی نمونه خون کرده و نمونه ها را درشرایط مناسب محیطی قرار می دهیم .

بررسی پلی مورفیسم های ژن GREM1 (rs1129456 A>T,rs10318 C>T,rs12915554 C>A,rs3743105 G>A,rs7162202 T>G) در مبتلایان به شکاف لب و یا شکاف کام غیر سندرمی در جمعیت استان سیستان وبلوچستان.و هدف اصلی برای اثبات این است که این ژن در ایجاد ناهنجاری شکاف کام و لب غیر سندرومیک نقش دارد.

ندارد

ندارد

هیچ هزینه ایی برای بیمار ندارد.

ندارد

اطلاعات مربوط به بیمار به طور محرمانه می ماند.نتایج و روش های به کار رفته به اطلاع بیمار خواهد رسیدو این نتایج  به صورت کاملا محرمانه  و صرفا جهت مقاصد پژوهش به کار خواهد رفت و هویت بیمار در چهارچوب قانون محرمانه خواهد ماند.

به تمام سوالات آزمودنی ها پاسخ داده می شود.

شرکت کردن یا نکردن در طرح اگاهانه و بدون هیچ اجباری می باشد و فرد هر زمان قبل از انجام طرح مختار است در مورد رضایت یا  عدم رضایت شرکت در ان تجدید نظر نماید.

با رضایت بیمار و گرفتن رضایت نامه از بیمار صورت گرفته.

ندارد.