بررسی اثر عصاره هیدرو الکلی پونه کوهی بر رشد برخی از باکتری های بیماری زای مواد غذایی

برخلاف پیشرفت های محسوس در زمینه رعایت بهداشت در فرآیند تولید مواد غذایی و اصلاح تکنیک های تولید مواد غذایی، بحث امنیت غذایی به طرز فزاینده ای یکی از مباحث بسیار مهم در بهداشت عمومی تبدیل شده است. تخمین زده می شود 30 د مردم در کشورهای صنعتی از بیماری های با منشاء غذایی رنج می برند. در سال 2000 حدود دو میلیون نفر در سراسر جهان از بیماری های منتج به اسهال تلف شده اند. (1)

بنابراین هنوز هم به روش های جدید برای کاهش یا حذف باکتری های بیماری زا و عامل فساد در حد امکان ترکیب روش های جدید با روش های موجود مورد نیاز است. (2)

با توجه به اثرات سوء استفاده از مواد شیمیایی صنعتی و بحث های قابل قبولی که در خصوص سرطا نزایی و سمیت آن ها برای انسان صورت گرفته است به نظر می رسد دنیا یک روند مصرف گرایی سبز را تجربه می کند و علاقه روز افزونی به استفاده از مواد نگهدارنده طبیعی وجود دارد. (3)

اما در بحث نگهداری مواد مواد غذایی حذف میکروب ها شامل باکتری ها قارچ ها به خصوص فرم مقاوم آنها از اهمیت خاصی برخوردار است. (4) با توجه به محدودیت های روز افزون استفاده از مواد شیمیایی ضد میکروبی  مانند عوارض جانبی و ایجاد مقاومت و نیاز به جایگزینی مواد طبیعی با منابع غنی موجود در داخل کشور امید می‌رود اسانس ها و عصاره‌های گیاهی زمینه‌ساز مناسبی برای مطالعه به عنوان جایگزینی بهتر مواد شیمیایی در نگهداری مواد خوراکی و کنترل بیماری های انسان و دام می باشد. (5) میکروارگانیسم ها به تعداد زیاد، در اغلب محیط های زیستی و غیر زیستی یافت می شوند وجود سطوحی که توانایی حفظ ونگهداری باکتری ها را دارا باشند و حضور یک عامل انتقال دهنده ی باکتریها از این سطوح از جمله شاخص های ایجاد عفونت های بیمارستانی هستند .این باکتریها انواع مختلفی توکسین تولید می کنند که با دو سندرم اسهال زا و استفراغ آور همراه است. (6) اسانس های گیاهی از جمله ترکیبات طبیعی می باشند که امروزه هم بعنوان طعم دهنده مواد غذایی و هم بعلت تأثیر ضدمیکروبی شان کاربرد فراوانی پیدا کرده اند. (7) مطالعات متعددی در ارتباط با بررسی فعالیت ضد میکروبی اسانس های گیاهی در مواد غذایی مختلف صورت گرفته است. (8) گیاه پونه کوهی بانام علمی Menta longifolia  در خانواده‌ی Laminaceae قرار دارد. اساساً به‌صورت وحشی در مکان‌های مرطوب مانند حاشیه رودخانه ها روییده و در سراسر مناطق معتدله نواحی مرکزی و جنوب اروپا، جنوب غربی آسیا و استرالیا رشد می کند .برگ، گل و ساقه گونه های پونه در چای های گیاهی یا به عنوان افزودنی در مخلوط های ادویه های تجارتی برای طعم دادن به غذا ها استفاده می شود. این گیاه در طب سنتی برای درمان تهوع، برونشیت، نفخ و بی اشتهایی بکار گرفته می شود. (9) امروزه به علت بروز مقاومت های میکروبی به آنتی بیوتیک ها،استفاده از گیاهان و ترکیبات آن ها به عنوان جایگزین آنتی بیوتیک های رایج مطرح شده است. نتایج بسیاری از مطالعات نشان می دهد که عصاره های برخی از گیاهان توانایی مهار رشد میکروارگانیسم ها را دارا می باشند و به این لحاظ ، گیاهان دارویی به عنوان عوامل ضد میکروبی جدید کاربرد های زیادی از جمله در پزشکی ،صنایع غذایی و غیره پیدا نموده اند. (10) هم چنین از برگ، گل وساقه گونه های پونه کوهی به عنوان افزودنی اضافه می گردد این گیاه در طب سنتی برای در مان تهوع ، برونشیت ، نفخ و بی اشتهایی به کار گرفته می شود. (9) کاروا کرول و تیمول از جمله ترکیبات اصلی پونه کوهی بوده که دارای خاصیت ضد میکروبی هستند و روند بهبودی زخم را تسریع می کنند. (11) ترکیبات ضد میکروبی گیاهان دارویی یکی از منابع با ارزش در پزشکی به شمار می آیند و در نتیجه گسترش بیماری های عفونی ، شناسایی تعداد بیش تری از این گیاهان و خالص سازی ترکیبات موثره آن هادر درمان بیماری ها می تواند مفید باشد. ترکیبات ضد میکروبی با منابع گیاهان دارویی قابلیت درمانی بی شماری دارند. آن ها نه تنها در درمان بیماری های عفونی نقش دارند، بلکه به طور هم زمان تعداد زیادی از اثرات جانبی را که اغلب با مصرف آنتی بیوتیک ها همراه هستند کاهش می دهند. (12)

در مطالعه‌ی فرهمند فر و همکاران که در سال 1396 باهدف بررسی خصوصیات ضد اکسایشی و ضدمیکروبی اسانس پونه کوهی و تأثیر آن بر پایداری اکسایشی روغن ماهی فیتوفاگ در آب انجام شد سپس از اسانس پونه کوهی به‌عنوان ضداکساینده طبیعی و جایگزین انواع سنتزی آن، در پایداری امولسیون روغن ماهی فیتوفاگ در آب استفاده شد، به‌طوری‌که پس از تعیین ساختار اسید چرب روغن، غلظت‌های مختلف اسانس پونه کوهی به امولسیون اضافه و در دمای و 24 و 25 درجه سانتی‌گراد ازنظر تولید هیدروپراکسیدها، دیان مزدوج، تریان مزدوج و اسید تیوباربیتوریک مورد پایش قرار گرفت نتایج نشان داد که اسانس طبیعی پونه کوهی به دلیل خاصیت ضد اکسایشی و ضدمیکروبی، می‌تواند به‌عنوان جایگزین انواع ضداکساینده های سنتزی در سیستم‌های غذایی مختلف مورد استفاده قرار گیرد. (13)

در مطالعه‌ی عزیز خانی و همکاران که در سال 1393 باهدف بررسی توانایی اسانسهای پونه کوهی، میخک و آویشن شیرازی در کنترل رشد پاتوژنهای واردشده از طریق آلودگی متقابل و میکروبیوتای درونی سالاد تجاری محصول یک شرکت تولیدی انجام شد پس از مرحله شستشو،25 گرم از سبزیجات در پوشش‌های پلی‌اتیلنی استریل قرارگرفته و تحت شرایط استریل به‌طور جداگانه با غلظت‌های مختلف از امولسیون اسانسها توسط اسپری تیمار شدند. نتایج نشان داد که اسانس‌ها، به‌خصوص آویشن شیرازی، واجد توانایی کاهش خطرات مربوط به آلودگی‌های میکروبی در سالاد سبزیجات برگی می‌باشند. (14)

در مطالعه‌ی کرمانشاه و همکاران که در سال 1389 باهدف بررسی اثر آنتی باکتریال عصاره دو گیاه مریم گلی و پونه که در متون طب سنتی از موارد پرکاربرد در درمان بیمار یهای دهان و دندان هستند، بر باکتر یهای عامل پوسیدگی دندان به صورت in vitro صورت پذیرفت. که از دو گیاه مریم گلی و پونه به روش maceration عصاره هیدروالکلی تهیه و اثر آنت یباکتریال آنها به روش broth macrodilution بر روی باکتر یهای استرپتوکوک موتان، لاکتوباسیل رامنوز و اکتینومیسس ویسکوز ارزیابی شد نتایج توسط آزمون Mann whitney آنالیز و مقایسه شدند. نتایج نشان داد هر دو عصاره مریم گلی و پونه بر هر سه گونه باکتری اثر بازدارندگی رشد داشتند که این اثر برای مریم گلی به طرز معنی داری از پونه بیشتر بود و در محدودة غلظت مورد بررسی هر دو عصاره بر هر سه باکتری اثر باکتریسیدال نیز داشتند. (15)

در مطالعه‌ی نوظهور و همکاران که در سال 1395 باهدف ارزیابی خواص ضد باکتریایی اسانس پونه کوهی بر روی باکتری‌های جداشده از عفونت بیمارستانی صورت گرفت. که اسانس پونه کوهی با استفاده از دستگاه کلونجر تهیه گردید و سپس فعالیت ضد باکتریایی به دو روش انتشار در آگار جهت انجام آزمایش حساسیت میکروبی و از روش رقت لوله‌ای جهت تعیین حداقل غلظت ممانعت از رشد و حداقل غلظت باکتری کشی به‌طور جداگانه استفاده قرار گرفت. آزمایش حساسیت میکروبی در موردآنتی بیوتیک های استاندارد تترا سایکلین و آمیکاسین و نیز دیسک آغشته به عطرمایه پونه کوهی نشان داد که قطر منطقه عدم رشد ایجادشده توسط این ترکیب در مورد 4 جدایه ای مورد آزمایش بزرگ‌تر و در مورد اشریشیا کلی وکلبسیلا نومونیا این اختلاف اندازه معنی‌داری بود. هم‌چنین نتایج حاصل  نشان داد که اسانس پونه کوهی دارای خاصیت ضد باکتریایی هست و می‌تواند به‌عنوان یک منبع ارزان و در دسترس برای استفاده درمانی در برخی از عفونت‌های باکتریایی مورداستفاده قرار گیرد. به عبارتی می‌توان از پونه کوهی به‌عنوان جایگزین مناسب برای انتی بیوتیک های صناعی جهت مقابله با جدایه های مورد آزمایش در نظر گرفته شود. (16)

حداقل غلظت مهار کنندگی ( MIC )  عصاره هیدرو الکلی پونه علیه رشد اشریشیا کلی چقدر است؟

حداقل غلظت مهار کنندگی ( MIC ) عصاره هیدرو الکلی پونه علیه رشد سودوموناس آئروژینوزا  چقدر است؟

حداقل غلظت مهار کنندگی ( MIC ) عصاره هیدرو الکلی پونه علیه رشد کلبسیلا نومونیا چقدر است؟

حداقل غلظت مهار کنندگی ( MIC ) عصاره هیدرو الکلی پونه علیه رشد استافیلوکوک اوروس چقدر است؟

بررسی اثر عصاره هیدرو الکلی پونه بر رشد برخی از باکتری‌های بیماری‌زای مواد غذایی

تعیین حداقل غلظت مهار کنندگی ( MIC ) عصاره هیدرو الکلی پونه علیه رشد اشریشیا کلی در مواد غذایی

تعیین حداقل غلظت مهار کنندگی ( MIC ) عصاره هیدرو الکلی پونه علیه رشد سودوموناس آئروژینوزا  در مواد غذایی

تعیین حداقل غلظت مهار کنندگی ( MIC ) عصاره هیدرو الکلی پونه علیه رشد کلبسیلا نومونیا در مواد غذایی

تعیین حداقل غلظت مهار کنندگی ( MIC ) عصاره هیدرو الکلی پونه علیه رشد استافیلوکوک اوروس در مواد غذایی

دانشکاه علوم پزشکی زاهدان

حداقل غلظت مهارکنندگی MIC  (minimal Inhibitory Concentration): حداقل غلظت ضدمیکروبی است که باعث مهار رشد قابل مشاهده میکروارگانیسم به میزان 90% پس از  یک دوره  48 ساعته انکوباسیون شود.  از MIC در  تعیین مقاومت میکروارگانیسم  به مواد ضد میکروبی و تعیین توان مواد ضدمیکروبی جدید کاربرد دارد⁽¹⁷⁾

توصیفی

برخی از میکروبهای مواد غذایی شامل اشریشیا کلی، سودوموناس آئروژینوزا، کلبسیلا نومونیا ، استافیلوکوک اوروس 

غلظت های مختلف از عصاره هیدرو الکلی از پونه کوهی که مقدار اولیه آن از مقالات مشابه بر علیه میکروبهای مورد نظر انجام خواهد شد و هر نمونه سه تکرار خواهد داشت که در نهایت چهار میکروب با سه تکرار دوازده نمونه خواهد بود

آسان و در دسترس

نتایج پاراکلینیکی

استخراج عصاره اتانولی وآبی

گیاه پونه کوهی پس از تهیه از عطاری های زاهدان و تایید آن توسط دانشکده کشاورزی دانشگاه سیستان و بلوچستان به آزمایشگاه شیمی و میکروبی مواد غذایی دانشکده پزشکی انتقال داده خواهد شد. برای این تحقیق از اندام های هوایی گیاه استفاده می شود وپس از شستشو در انکوباتور 60 درجه خشک می گردند. سپس نمونه ها آسیاب شده و50گرم از گیاه در 500 میلی لیتر اتانول  80%  و500 میلی لیتر آب به مدّت 48 ساعت روی دستگاه شیکر ارلن  در دمای 40-37 درجه سانتیگراد با دور 200 دور در دقیقه به روش ماسراسیون، عصاره گیری خواهند شد. عصاره های حاصل با کاغذ واتمن 4/0 میکرونی صاف می گردند.. عصاره اتانولی  تحت شرایط خلاء در دمای 70 درجه سانتیگراد با دور 8 دور در دقیقه توسط دستگاه روتاری تغلیظ و در پتری دیشهای استریل ریخته و در دمای 60 درجه سانتیگراد آون خشک میگردند.

احیاء باکتری

قبل از هر آزمون میکروبی، زیر هود لامینار قسمتهای سطحی هود با پنبه آغشته به الکل 70% استریل و به مدت 20 دقیقه تحت اشعه UV قرار خواهد گرفت. آمپول لیوفیلیزه حاوی میکروارگانیسمهای مورد مطالعه  تهیه شده از مرکز ملی پژوهش های علمی وصنعتی  در شرایط استریل باز شده  و با حدود 2-1 میلی لیتر محیط کشت نوترینت براث به صورت سوسپانسیون درمی آید. چند قطره از این سوسپانسیون توسط سرنگ استریل به محیط کشت جامد TSIشیب دار منتقل تا بعد از گذشت مدت زمان  24-18 ساعت در گرمخانه  37 درجه،  به عنوان کشت ذخیره از آن استفاده گردد.

تهیه استاندارد محلول نیم مکفارلند

9 میلی لیتر از محلول سرم فیزیولوژی یا محلول نمکی( NaCl 8.5 g/ l)  استریل تهیه شده را به لوله آزمایش منتقل کرده وبه وسیله لوپ از کلنی هرکدام از باکتریها برداشته وبا شیکر ارلن کاملا مخلوط کرده به طوری که سوسپانسیون کاملا یکنواختی از باکتری مورد آزمایش به دست آید. سپس جذب نوری این سوسپانسیون در طول موج 625 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر، در مقابل شاهد آب  خوانده می شود تا کدورتی معادل استاندارد 5/0 مک فارلند معادلcfu 10⁸ ×5/1 داشته باشد.

تعیین MIC

برای تعیین MIC با روش رقت لوله ای از میکروپلیت 96 خانه سلولی استفاده  می شود.  یک خانه  به عنوان کنترل مثبت (حاوی سوسپانسیون میکروبی و DMSO فاقد عصاره)، یک خانه  به عنوان کنترل مثبت مثبت (حاوی سوسپانسیون میکروبی فاقد عصاره) و یک لوله به عنوان کنترل منفی (دارای محیط کشت و عصاره بدون سوسپانسیون میکروبی) در نظر گرفته خواهد شد.

به هر کدام از خانه ها  100 ماکرولیتر محیط کشت نوترینت  براث اضافه و به خانه  اول 100 ماکرولیترعصاره استوک با غلظت 500 میلی گرم بر میلی لیتر اضافه می شود. پس از مخلوط کردن، 100 ماکرولیتر از خانه اول به خانه  دوم و سپس 100ماکرولیتراز خانه دوم به خانه سوم، به همین ترتیب تا آخر انجام خواهد شد و سرانجام 100 ماکرولیتر از آن به بیرون ریخته می شود. به تمامی خانه ها50 میکرولیتر از هر سوسپانسیون میکروبی اضافه می شود . به این ترتیب غلظت عصاره درخانه ها500، 250، 125، 5/62، 25/31، میلی گرم بر میلی لیتر خواهد بود. تمامی لوله ها به مدّت 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد قرار می گیرند. پس از گذشت مدت زمان لازم پلیتها از گرمخانه خارج و جهت تعیین MIC مورد بررسی قرار خواهندگرفت.

سپس توسط دستگاه الایزا ریدر میزان غلظت عصاره ها بررسی شده و کمترین میزان عدد خوانده شده توسط دستگاه به عنوان MICگزارش می گردد.

پس از جمع آوری دادها، با استفاده ار نرم افزار SPSS20 و آمار های توصیفی انجام خواهد شد

 بر اساس  دفترچه راهنمای عمومی اخلاق در پژوهشهای علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی  در جمهوری اسلامی ایران

و بندهای 1-  9- 10- 11- -25 – 28- 29 – 30 –و 31

1- هدف اصلی هر پژوهش‌باید ارتقای سلامت انسان‌ها توأم با رعایت کرامت و حقوق ایشان باشد.

9-در پژوهش‌های پزشکی که ممکن است به محیط زیست آسیب برسانند، باید احتیاط‌های لازم در جهت حفظ و نگهداری و عدم آسیب رسانی به محیط ریست انجام گیرد.

10- هر پژوهشی باید بر اساس و منطبق بر یک طرح‌نامه (پروپوزال) به انجام برسد. در کارآزمایی‌های بالینی باید علاوه بر طرح نامه، دستورالعمل (پروتکل) نیز تهیه و ارائه شود. طرح‌نامه و دستورالعمل باید شامل تمامی اجزای ضروری باشد. از جمله بخش ملاحظات اخلاقی، اطلاعات مربوط به بودجه، حمایت کننده‌ها، وابستگی‌های سازمانی، موارد تعارض منافع بالقوه‌ی دیگر، مشوق‌های شرکت کنندگان، پیش بینی درمان و یا جبران خسارت افراد آسیب دیده در پژوهش .در مواردی که لازم است رضایت‌نامه‌ی آگاهانه به‌صورت کتبی اخذ شود، فرم رضایت‌نامه باید تدوین و به طرح‌نامه پیوست شده باشد. پیش از تصویب یا تأیید طرح‌نامه از سوی کمیته‌ی مستقل اخلاق در پژوهش، نباید اجرای پژوهش شروع شود.

11- کمیته‌ی اخلاق در پژوهش علاوه بر بررسی و تصویب طرح‌نامه و دستورالعمل، این حق را دارد که طرح‌‌ها را در حین و بعد از اجرا را از نظر رعایت ملاحظات اخلاقی مورد پایش قرار دهد. اطلاعات و مدارکی که برای پایش از سوی کمیته‌ی اخلاق درخواست می‌شود، باید از سوی پژوهشگران در اختیار این کمیته گذاشته شود.    

30 -گزارش‌ها و مقالات حاصل از پژوهش‌هایی که مفاد این راهنما را نقض کرده‌اند، نباید برای انتشار پذیرفته شوند.

31-روش پژوهش نباید با ارزش های اجتماعی، فرهنگی و دینی  جامعه در تناقض باشد.

‌

ندارد

پونه کوهی، عصاره هیدروالکلی، اشریشیا کلی، سودوموناس آئروژینوزا، کلبسیلا

1.            Wolska KI, Grudniak AM, Kraczkiewicz-Dowjat A. Genetic and physiological regulation of bacterial endospore development. Polish journal of microbiology. 2007;56(1):11.

2.            Skandamis P, Koutsoumanis K, Nychas G, Fasseas K. Inhibition of oregano essential oil and EDTA on Escherichia coli O157: H7 [food hygiene]. Italian Journal of Food Science (Italy). 2001.

3.            Schuenzel KM, Harrison MA. Microbial antagonists of foodborne pathogens on fresh, minimally processed vegetables. Journal of food protection. 2002;65(12):1909-15.

4.            Jensen G, Hansen B, Eilenberg J, Mahillon J. The hidden lifestyles of Bacillus cereus and relatives. Environmental microbiology. 2003;5(8):631-40.

5.            Hornstra L. Germination of Bacillus cereus spores: the role of germination receptors2007.

6.            A. AL-NUAIM JE, FAHMIDA BANU, NOORI CHOWDHURY L. An appraisal of the appropriateness of the indications for hysterectomy. Journal of Obstetrics and Gynaecology. 1997;17(5):461-4.

7.            Ultee A, Bennik M, Moezelaar R. The phenolic hydroxyl group of carvacrol is essential for action against the food-borne pathogen Bacillus cereus. Applied and environmental microbiology. 2002;68(4):1561-8.

8.            Moosavy M-H, Basti AA, Misaghi A, Salehi TZ, Abbasifar R, Mousavi HAE, et al. Effect of Zataria multiflora Boiss. essential oil and nisin on Salmonella typhimurium and Staphylococcus aureus in a food model system and on the bacterial cell membranes. Food Research International. 2008;41(10):1050-7.

9.            Moreno L, Bello R, Primo‐Yúfera E, Esplugues J. Pharmacological properties of the methanol extract from Mentha suaveolens Ehrh. Phytotherapy research. 2002;16(S1):10-3.

10.          İşcan G, Ki̇ri̇mer N, Kürkcüoǧlu Mn, Başer HC, DEMIrci F. Antimicrobial screening of Mentha piperita essential oils. Journal of agricultural and food chemistry. 2002;50(14):3943-6.

11.          Chitsaz M. In vitro evaluation of antibacterial effect of stachys schtschegleevii. Daneshvar Med J. 2006;67:12-9.

12.          Salehi P, Sonboli A, Eftekhar F, Nejad-Ebrahimi S, Yousefzadi M. Essential oil composition, antibacterial and antioxidant activity of the oil and various extracts of Ziziphora clinopodioides subsp. rigida (BOISS.) RECH. f. from Iran. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 2005;28(10):1892-6.

13.          فرهمندفر, کناری از, عشری ا. بررسی خصوصیات ضداکسایشی و ضدمیکروبی اسانس پونه کوهی و تأثیر آن بر پایداری اکسایشی روغن ماهی فیتوفاگ (Hypophthalmichtys molitrix) در آب. علوم و صنایع غذایی ایران. 2018;15(77):292-79.

14.          عزیزخانی, الیزاکویویل, پاتریسیا. تأثیر اسانس های گیاهی بر میکروارگانیسم های بیماری زا در سبزیجات برگی. مجله علوم پزشکی نیشابور. 2015;3(2):18-31.

15.          کرمانشاه, کمانگر ه, السادات ص, آرامی, میرصالحیان, کمالی‌نژاد, et al. بررسی اثر ضدباکتریائی عصاره هیدروالکلی مریم گلی (Saliva Officinalis) و پونه (Menta Longifolia) بر سه باکتری عامل پوسیدگی دندان در شرایط آزمایشگاهی. مجله دانشکده دندانپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی. 2011;28(4):232-7.

16.          نوظهور, یاسر, فرد حر, گرمی ق, ناهیده. ارزیابی خواص ضد باکتریایی اسانس پونه کوهی برروی باکتری های پاتوژن جدا شده ازعفونت های بیمارستانی. مجله علمی پزوهشی دانشگاه علوم پزشکی ایلام. 2018;25(5):154-60.

17.          Andrews JM. Determination of minimum inhibitory concentrations. Journal of antimicrobial Chemotherapy. 2001;48(suppl_1):5-16.

ندارد