بررسی دو روش آزمایشگاهی رنگ آمیزی تریکروم اصلاح شده وNested - PCR /Multiplex در میزان آلودگی به میکروسپوریدیاهای شایع روده ای در افراد مبتلا به HIV درشهرستان زاهدان

میکروسپوریدیا (Microsporidia) از جمله  انگلهای یوکاریوتیک داخل سلولی اجباری است که قادر به تولید اسپور بوده و طیف وسیعی از  مهره داران و  بی مهره ها را آلوده  می سازد. بر اساس توالی زیرواحد کوچک و بزرگ rRNA و توالی DNA کدکننده پروتئین در این شاخه بیش از ۱۴۰ جنس و ۱۲۰۰ گونه وجود دارد که از این تعداد تنها 7 جنس در  انسانها بیماری زا  می باشند(1).  برای اولین بار در سال ۱۸۵۷ Nageli انگل را در کرم ابرایشم شناسایی کرد و اسم آن را نوزوما بومبی سیس نام نهاد (1).  اولین مورد میکروسپوردیازیس انسانی در سال ۱۹۵۹ گزارش شد و تا سال 1985 تنها 10 موررد عفونت انسانی میکروسپوردیازیس گزارش گردید(1،3). میکروسپوردیا ها دارای هر دو چرخه غیر جنسی و جنسی بوده و نتیجه تکثیر آن ها تشکیل هاگ یا اسپور است (2، 3). بسیاری از  عفونتهای میکروسپوریدیازیس انسانی منشا زئونوز داشته و از طریق آب آلوده به فضولات حیوانی منتقل  می شوند، با این وجود انتقال انسان به انسان نیز مطرح شده است(2). این عوامل اگر چه در میزبانان با ایمنی سالم به صورت خود محدود شونده  می باشند ولی در افراد مبتلا به سندرم نقص سیستم ایمنی به خصوص بیماران مبتلا به ایدز  می تواند تهدید کننده حیات باشد(2, 3). از بین عفونت های ایجاد شده توسط میکروسپوریدیاها بیشترین میــــــزان بروز مربوط به نوع روده ای است که در طی آن اسهال آبکی شدید و مداوم ایجاد گردیده و می تواند کشنده باشد(4،1). جنس  های از میکروسپوردیاها که قادر به ایجاد بیماری در انسان هستند شامل انسفالیتوزون، براکیولا، ویتافورما، انتروسیتوزون، نوزوما و تراکی پلیستوفورا می باشند که عوامل شایع ایجاد کننده عفونت هـــــای روده ای: انتــــــروسیتوزون بینئوزی و انسفالیتوزون اینتستینالیس را می توان نام برد که هر دو ارگانیسم در دستگاه صفراوی بیماران مبتــــــــلا بــه کوله سیستیت نیز مشاهده شده اند (6 ،7). میکروسپوردیا گه گاهی از سلول های لامیناپروپریا، مجاری صفراوی، مثانه، سلول های کبدی و مجاری پانکراتیک برونش و گهگاهی اپیتلیوم بینی نیز جدا شده است (5، 7). گرچه بعضی انواع میکروسپوریدیا احتمالا“ جزء عوامــل شایــع عفونت های بدون علامت و یا خودمحدود شونده در نزد بیماران دارای سیستم ایمنی طبیعی معرفی شده اند ولی ابهامات فــراوانی در مورد بیماری زایی آنها وجود دارد(5). این انگل ها باعث آلودگی بسیاری از حیوانات شده و امروزه به عنوان عامل بیماری در انسان به خصوص به عنوان عفونت های فرصت طلب در مبتلایان به ایدز شناسایی شده اند که شیوع این عفونت بین ۰ تا ۵۰ درصد در سراسر جهان است(6). این انگل به عنوان عوامل اصلی در ۱۰ تا ۴۰ درصد از بیماران ایدزی مبتلا به اسهال مزمن شناسایی شده اند(7). از نظر بالینی میکروسپوریدیا در افراد سالم مشکل چندانی ایجاد نمی کند و فقط منجر به اسهال خودبه خود محدود شونده می شود ولی در بیماران مبتلا به نقص سیستم ایمنی قادر به ایجاد اسهال بدون خون وتب که با از دست دادن آب بدن منجر به  کاهش وزن می گردد همچنین ممکن است پنومونی، سینوزیت، میوزیت، انسفالیت و عوارض چشمی ایجاد کند (4).  این عفونتها بیشتر در بیماران با ضعف سیستم ایمنی شدید و افرادی که شمارش CD₄ آنها کمتر از ۱۰۰ عدد در هر میکرولیتر باشد معمول است. اسهال ناشی از این انگل شدید، غیر خونی و غیر موکوئیدی بوده و با دفع روزانه به میزان ۱۰ بار یا بیشتر می باشد (1, 8). میکروسپوریدیا یک بیماری منتقله از آب است اما برخی محققان اعتقاد دارندکه انتقال به صورت مستقیم به وسیله اسپورهایی که از طریق مدفوع یا ادرار پراکنده شده اند، از طریق مدفوعی –دهانی یا ادراری-دهانی یا در اثر ایجاد آسیب و استنشاق نیز می تواند صورت گیرد(1, 9). روش طلایی جهت تشخیص قطعی این انگل مشاهده با میکروسکوپ الکترونی می باشد و از بین بقیه روشها، رنگ آمیزی تریکروم از اختصاصیت بیشتری برخوردار است و روش واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) یک روش مطلوب برای تشخیص سریع و دقیق بیماری می باشد (10). انگل های گوارشی مرگ و میر بسیار بالایی را در افراد مبتلا به ایدز ایجاد می کند(11). با اینکه آلودگی به HIVدر خاور میانه شیوع بالایی ندارد اما عفونت دراین منطقه به سرعت در حال انتشار و افزایش می باشد(12). درسال ۲۰۰۲ حدود ۳۰۰۰ مورد HIVمثبت در ایران گزارش شده است در حالی که در سال  ۲۰۰۴  تعداد۵۷۸۰ بیمار مبتلا به ایدز در ایران شناسایی شدند هر چند کارشناسان معتقدند که تعداد واقعی بیماران بین ۳۰۰۰۰ تا   ۴۰۰۰۰ مورد بوده است (13). ابتلا به ویروسHIV باعث ضعف سیستم ایمنی میزبان شده و لذا انواع پاتوژن های فرصت طلب مانند انگلها می توانند در فرد ایجاد بیماری کنند که در صورت عدم تشخیص و درمان به موقع صدمات جدی متوجه میزبان شده که حتی می تواند منجر به مرگ بیمار شود. از جمله این پاتوژنهای فرصت طلب می توان به میکروسپوردیاها، توکسوپلاسما، کریپتوسپوریدیوم پارووم، ایزوسپورابلی، استرونژیلوئیدس استرکورالیس و... اشاره کرد (17).

بنابراین با توجه اهمیت بیماری زائی میکروسپوریدیا در بیماران مبتلا به ایدز و نتایج به دست آمده که نماینگر بالا بودن شیوع انگلهای گوارشی در بیماران  HIVمثبت می باشد تشخیص سریع و دقیق آلودگی در افراد مذکور در پیشگیری از وخامت بیماری و صدمات جبران ناپذیر آن بسیار موثر خواهد بود

مطالعه حاضر با هدف بررسی میزان آلودگی میکروسپوریدیاهای روده ای در افراد  مبتلا به HIV با روش های رنگ آمیزی آمیزی تریکروم  و Nested-PCR   Multiplex/درشهرستان زاهدان در سال 1397طراحی گردید.

در مطالعاتی که توسط زهرا غریبی و همکاران در شهرستان همدان در سال ۱۳۹۱ انجام گرفت مشخص گردید که از۷۱ نمونه بیمار HIV مثبت که اسهال مزمن داشتند 18.30% از نمونه ها با روش رنگ آمیزی اختصاصی تریکروم به میکروسپوریدیا مبتلا بودند(14).

طباطبایی و همکاران در مطالعه ای که در سال۱۳۸۹ در شهرستان تهران انجام دادند دریافتند از۵۱  نمونه مدفوع افراد مبتلا به نقص ایمنی21.6% به روش PCR و13.7% به روش رنگ آمیزی تریکروم به عفونت میکروسپوریدیا مبتلا بودند (15).

در بررسی 199 نمونه مدفوع بیماران  (۷۲ نفر  ایدز، ۵۹ نفر سرطان سینه، ۶۸ نفر گروه ایمن) دارای اسهال مزمن که توسط Nooshadokht  و همکارانش در سال 2107 انجام گردید 5% از بیماران مبتلا به ایدز و 4.7% از بیماران سرطانی و 0.5% از گروه ایمن به  میکروسپوریدیا آلوده بودند (16).

درمطالعه ای که توسط تولایی و همکارانش در سال 2017 در جنوب غرب ایران انجام گرفت مشخص شد از تعداد 816  نمونه بیمار 17% با روش رنگ آمیزی تریکروم و 22.2% با روش PCR  آلودگی به گونه های میرکوسپوردیا بودند (17).

در مطالعه ای که در سال  ۲۰۱۵ توسط  Ghoyounchو همکاران جهت بررسی شیوع میکروسپوردیا در ایران انجام گرفت از تعداد ۱۱۵۲ نمونه از بیماران گروه های مختلف:( سرطان سینه ،پیوند کلیه، ایدز) مشخص گردید که شیوع عفونت میکروسپوریدیا در افراد ایدزی با اسهال مزمن خیلی بالا بود به طوری که 15% افرادی که CD4 آنها کمتر از۲۰۰ عدد در میلی لیتر بوده آلوده به میکروسپوریدیا بودند (1).

حامد میرجلیلی و همکاران در مطالعات انجام شده در سال ۲۰۱۳ دریافتند که از ۸۱ نمونه بیمار  HIV مثبت به اسهال مزمن 30.9% با روش  Nest-PCRو 19.8% نمونه با روش رنگ آمیزی اختصاصی تریکروم آلوده به  میکروسپوریدیا ‍‍بودند (13).

در مطالعه ی انجام گرفته توسط کاظمی و همکاران در سال 1393 در شهر های آبادان وخرمشهر بر روی 186 نمونه بیمار مبتلا به  اسهال مزمن با روش PCR فراوانی گونه انتروسیتوزون بینئوزی  ۷.۶۶% و انسفالیتوزون اینتستینالیس  ۸.۲۳% گزارش گردید همچنین در مطالعه ای در هند، E. intestinalis  شایعترین علت میکروسپوریدیوزیس در بیماران مبتلا به اسهال گزارش شد(18).

در مطالعه ای که در سال 2003 در کشور کلمبیا توسط Flórez AC و همکاران انجام گرفت مشخص گردید که از بین 115 بیمار مبتلا به HIV 29 %  با روش رنگ آمیزی اختصاصی تریکروم آلوده به  میکروسپوریدیا ‍‍بودند(19).

در بررسی دیگری که در سال 2016 در کشور لهستان توسط Wesołowska و همکاران انجام گرفت مشخص گردید که از 110 بیمار مبتلا به HIV 30% با روش Nested-PCR آلوده به عفونت میکروسپوریدیا بودند (20).

در متاآنالیزی که توسط Ze-Dong Wang و همکاران در سال 2018 برروی 131 مطالعه در رابطه با شیوع میکروسپوریدیا در بیماران HIV مثبت انجام گرفت مشخص گردید که از 788 بیمار تعداد 105 بیمار(13%) الوده به عفونت میکروسپوریدیا بودند(21).

در بررسی که توسط Assia و همکاران در سال 2017 در کشور تونس انجام گرفت مشخص شد که از تعداد 77 بیمار ایدزی 11% با روش Nested-PCR الوده به عفونت میکروسپوریدیا بودند(22).

در مطالعه ای که توسط Hua و همکاران در کشور چین در سال 2017 انجام گرفت نتایج نشان داد که از 285 بیمار HIV مثبت 11% توسط روش Nested-PCR به عفونت میکروسپوردیا آلوده بودند (23).

1. فراوانی آلودگی به میکروسپوردیا شایع روده ای با روش Nested – PCR / Multiplex  چقدر است؟
2. فراوانی آلودگی به میکروسپوردیا شایع روده ای با رنگ آمیزی اختصاصی تریکورم اصلاح شده چقدر است؟
3. فراوانی آلودگی به میکروسپوردیا شایع روده ای با دو روش Nested - PCR / Multiplex و رنگ آمیزی اختصاصی تریکروم اصلاح شده متفاوت است؟

      تعیین دو روش رنگ آمیزی آمیزی تریکروم اصلاح شده و/Nested – PCR / Multiplex  جهت بررسی میزان آلودگی به میکروسپوریدیاهای شایع  روده ای در افراد  مبتلا به HIV درشهرستان زاهدان

1. تعیین فراوانی آلودگی به  میکروسپوردیا شایع روده ای  با روش Nested – PCR/Multiplex
2. تعیین فراوانی آلودگی به میکروسپوردیا  شایع روده ای با روش رنگ آمیزی اختصاصی تریکورم.
3. مقایسه فراوانی آلودگی به میکروسپوردیا  شایع روده ای با دو روش Nested – PCR / Multiplex  و رنگ آمیزی اختصاصی تریکروم

1- استفاده از نتایج طرح در برنامه ریزی و کنترل بیمارهای روده ای ومنتقله از راه آب وغذا دراستان سیستان وبلوچستان

2- استفاده از روش های تشخیص مورد استفاده در سایر مراکز دانشگاهی ،تحقیقاتی وآزمایشگاها ومراکز بهداشتی درمانی کشور

‍‍Nested/Multiplex PCR:

در این روش که ترکیبی از دو روش Nested و multiplex هست

ابتدا توسط پرایمر های اولیه جهت سنتز 16S rRNA و شناسایی انگل میکروسپوردیا استفاده خواهد شد در مرحله دوم از پرایمر های ثانویه جهت تشخیص گونه های میکروسپوردیا شایع روده ایی (Enterocytozoon  و Encephalitozoon) استفاده خواهد شد.

رنگ آمیزی تریکروم :

یک روش ساده و سریع است که به طور یکنواخت انگلها، سلولها، قارچها و دیگر عناصر را رنگ می کند، به نحوی که به توان کروماتین و سیتوپلاسم انگل را از هم افتراق داد. .سیتوپلاسم تروفوزوئیت به رنگ سبز-آبی و بعضی مواقع مایل به بنفش، کیستها به رنگ بنفش، هسته وعناصری ماننداجسام کروماتوئید، گلبـــولهای قرمز و باکتریها و نیزکریستـــالهای شارکوت لیدن به رنگ قرمز و بعضی مواقع مایــل به بنفش مشاهده می گردد

هاگ یا اسپور (spore)

درزیست شناسی و باکتریولوژی ساختاری تولید مثلی است که برای پراکنش نسل آن موجود و بقا در شرایط سخت برای مدت‌های مدید سازگار شده‌است.

مقطعی (توصیفی-تحلیلی)

بیماران HIV مثبت که برونده بیماری در مرکز مبارزه با ایدز معاونت بهداشتی دانشگاه علوم پزشکی زاهدان دارند و یا موارد جدید که تا پایان  سال ۹۷ به آنجا مراجعه می کنند و تشخیص قطعی HIV برای آن ها داده شده است.

وجود هر گونه بیماری بجزء HIV از قبیل سل و سایر بیمار های عفونی منجر به خروج فرد از مطالعه می شود.

با توجه به برآورد های اولیه صورت گرفته بیمارانی که دارای پرونده ی  درمانی هستند وارد این مطالعه خواهند شد.

غیر احتمالی نمونه ها در دسترس

برای ثبت نتایج مشاهدات از یک فرم جمع آوری اطلاعات استفاده می  شود . این فرم شامل نتایج  رنگ آمیزی، نتیجه آزمون Nested - PCR / Multiplex واطلاعات فردی بیمار می باشدکه ضمیمه شده است.

پس از تائید طرح توسط معاونت تحقیقات و فناوری دانشگاه علوم پزشکی زاهدان جهت نمونه گیری ازبیماران HIVمثبت به مرکزمبارزه با ایدز معاونت بهداشتی دانشگاه علوم پزشکی زاهدان مراجعه نموده و پس از کسب رضایت از بیماران جهت نمونه گیری، نمونه های مدفوع از بیماران جمع آوری می گردد.

از هر نمونه مدفوع مقداری در فریز 20- جهت انجام آزمایشات مولکولی نگهداری واستفاده خواهد شد. ومقداری از نمونه به صورت مستقیم با روش رنگ آمیزی مورد بررسی میکروسکوپی قرار می گیرد

رنگ آمیزی تریکروم:

 روش معمول تشخیص میکروسپوریدیا روش  بررسی مستقیم با میکروسکوپ الکترونی و رنگ آمیزی اختصاصی  می باشد که بعلت عدم دسترسی به میکروسکوپ الکترونی و هزینه بالای آن متداول ترین آنها روش رنگ آمیزی تریکروم اصلاح شده (گرم-کرموتروپ) است که به منظور بررسی وجود اسپور های میکروسپوریدیایی در نمونه مدفوع از این رنگ آمیزی استفاده می شود که مراحل آن به شرح زیر انجام خواهد گرفت فیکس کردن لام در متانول به مدت 10 دقیقه، پوشاندن لام با رنگ تری کروم به مدت 90 دقیقه ، غوطه ور کردن لام به مدت 20ثانیه در اسید-الکل، فرو بردن متوالی لام درالکل 95 درصد در کمتر از10ثانیه ، قرار دادن لام در الکل 95 درصد ، 2 بار به مدت 5 دقیقه ،قرار دادن لام درالکل100درصد ، به مدت 10دقیقه، قرار دادن لام در گزیلول، به مدت 10 دقیقه و در نهایت مونته کردن لام با کانادا بالزام است در این رنگ آمیزی اسپورهای میکروسپوریدیا به رنگ قرمز-قهوه ای دیده می شود و دارای وجه تشخیصی واکوئل انتهای و کمربند میانی هستند.

Nested - PCR / Multiplex

استخراج  و تلخیص DNA از نمونه های مدفوع با استفاده از کیت(DNA extraction kits for stool (Bioneer)) انجام خواهد گرفت و از پرایمر اختصاصی که در مطالعه ی تولایی و همکاران استفاده شده و توالی آن ها در جدول شماره یک آمده است استفاده خواهد گردید (17)، مراحل انجام به ترتیب عبارتند از:

در مرحله ی اول وتاکنش با استفاده از پرایمر های MSP1 و MSP3 که در جدول زیر آورده شده است ژن 16srRNA انگل میکروسپوردیا تکثیر خواهد گردید.

در مرحله ی دوم واکنش به ترتیب با استفاده از جفت پرایمر های MSP2A و MSP4A ، Enterocytozoon bieneusi و جفت پرایمر های MSP2B و MSP4B، Encephalitozoon شناسایی خواهند شد.

جدل شماره (1) پرایمر های مورد استفاده در تست Multiplex/Nested PCR

با استفاده از روش های آمار توصیفی ( تنظیم جداول توزیع فراوانی ، رسم نمودار ) و روش های آمار تحلیلی (ضریب توافق کاپاا) در سطح اطمینان 95 % وتوسط نرم افزار spss  داده ها تجزیه و تحلیل خواهند شد .        

راهنمای عمومی اخلاق در پژوهشهای علوم پزشکی دارای آزمودنی انسانی  در جمهوری اسلامی ایران

1. هدف اصلی هر پژوهش‌باید ارتقای سلامت انسان‌ها توأم با رعایت کرامت و حقوق ایشان باشد.
2. در پژوهش بر آزمودنی انسانی، سلامت و ایمنی فرد فرد آزمودنی‎ها در طول و بعد از اجرای پژوهش، بر تمامی مصالح دیگر اولویت دارد. هر پژوهشی که بر روی آزمودنی انسانی انجام می‌گیرد، باید توسط افرادی طراحی و اجرا شود که تخصص و مهارت بالینی لازم و مرتبط را داشته باشند. در کارآزمایی‌های بالینی  بر روی بیماران یا داوطلب‌های سالم نظارت پزشک دارای مهارت و دانش متناسب الزامی است.
3. پژوهش بر انسان فقط در صورتی توجیه‌پذیر است که منافع بالقوه‌ی آن برای هر فرد آزمودنی بیش‌تر از خطرهای  آن باشد. در پژوهش‌های دارای ماهیت غیر درمانی، سطح آسیبی که آزمودنی در معرض آن قرار می‌گیرد نباید بیش‌تر از آن‌چه باشد که مردم عادی در زندگی روزمره‌ی خود با آن مواجه می‌شوند. حصول اطمینان از این امر برعهده‌ی طراحان، مجریان و همکاران پژوهش و تمامی شوراهای بررسی یا پایش‌کننده‌ی پژوهش از جمله کمیته‌ی اخلاق در پژوهش‌ است.
4. مواردی از قبیل سرعت، سهولت کار، راحتی پژوهشگر، هزینه‌ی پایین‌تر و/ یا صرفاً عملی بودن آن به هیچ وجه نباید موجب قرار دادن آزمودنی در معرض خطر یا زیان افزوده یا تحمیل هر گونه محدودیت اختیار اضافی به وی شود.
5. قبل از آغاز هر پژوهش پزشکی ، باید اقدامات  اولیه جهت به حداقل رساندن زیان احتمالی وارده به آزمودنی‌ها و تامین سلامت آن‌ها انجام گیرد.
6. اگر در حین اجرای پژوهش مشخص شود که خطرات شرکت در این پژوهش برای آزمودنی‌ها بیش از فواید بالقوه‌ی آن است، باید آن پژوهش بلافاصله متوقف شود.
7. طراحی و اجرای پژوهش‌هایی که بر روی آزمودنی انسانی انجام می‌گیرند، باید منطبق با اصول علمی پذیرفته شده بر اساس دانش روز و مبتنی بر مرور کامل منابع علمی موجود و پژوهش‌های قبلی آزمایشگاهی، و  در صورت لزوم،  حیوانی مناسب باشد. مطالعات حیوانی باید با رعایت کامل اصول اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی انجام شوند.
8. هر پژوهشی باید بر اساس و منطبق بر یک طرح‌نامه (پروپوزال) به انجام برسد.  از جمله بخش ملاحظات اخلاقی، اطلاعات مربوط به بودجه، حمایت کننده‌ها، وابستگی‌های سازمانی، موارد تعارض منافع بالقوه‌ی دیگر، مشوق‌های شرکت کنندگان، پیش بینی درمان و یا جبران خسارت افراد آسیب دیده در پژوهش .در مواردی که لازم است رضایت‌نامه‌ی آگاهانه به‌صورت کتبی اخذ شود، فرم رضایت‌نامه باید تدوین و به طرح‌نامه پیوست شده باشد. پیش از تصویب یا تأیید طرح‌نامه از سوی کمیته‌ی مستقل اخلاق در پژوهش، نباید اجرای پژوهش شروع شود.
9. کمیته‌ی اخلاق در پژوهش علاوه بر بررسی و تصویب طرح‌نامه و دستورالعمل، این حق را دارد که طرح‌‌ها را در حین و بعد از اجرا را از نظر رعایت ملاحظات اخلاقی مورد پایش قرار دهد. اطلاعات و مدارکی که برای پایش از سوی کمیته‌ی اخلاق درخواست می‌شود، باید از سوی پژوهشگران در اختیار این کمیته گذاشته شود.   
10. انتخاب آزمودنی‌های بالقوه از میان جمعیت بیماران یا هر گروه جمعیتی دیگر، باید منصفانه باشد، به‌نحوی که توزیع بارها (خطرات یا هزینه‌ها) و منافع شرکت در پژوهش، در آن جمعیت و کل جامعه، تبعیض‌آمیز نباشد.
11. کسب رضایت آگاهانه و آزادانه در هر پژوهشی که بر روی آزمودنی انسانی اجرا می‌شود، الزامی است. این رضایت باید به شکل کتبی باشد. در مواردی که اخذ رضایت آگاهانه‌ی کتبی غیر ممکن یا قابل صرف‌نظر باشد، باید موضوع با ذکر دلایل به کمیته‌ی اخلاق منتقل شود. در صورت تأیید کمیته‌ی اخلاق، اخذ رضایت کتبی قابل تعویق یا تبدیل به رضایت شفاهی یا ضمنی خواهد بود.
12. اگر در طول اجرای پژوهش تغییری در نحوه اجرای پژوهش داده شود یا اطلاعات جدیدی به دست آید که احتمال داشته باشد که بر تصمیم آزمودنی مبنی بر ادامه‌ی شرکت در پژوهش تاثیر گذار باشد، باید موضوع به اطلاع کمیته‌ی اخلاق رسانده شود و در صورت موافقت کمیته با ادامه‌ی پژوهش، مراتب به اطلاع آزمودنی رسانده شود و رضایت آگاهانه مجددا اخذ گردد.
13.  پژوهشگر باید از آگاهانه بودن رضایت اخذشده اطمینان حاصل کند. برای این منظور، در تمامی پژوهش‌های پزشکی، اعم از درمانی و غیردرمانی، پژوهشگر موظف است فرد در نظر گرفته شده به‌عنوان آزمودنی را از تمامی اطلاعاتی که می‌توانند در تصمیم‌گیری او مؤثر باشند، به‌نحو مناسبی آگاه سازد. این اطلاعات مشتملند بر: عنوان و اهداف پژوهش، طول مدت پژوهش، روشی که قرار است به‌کار گرفته شود (شامل احتمال تخصیص تصادفی به گروه‌مورد یا شاهد)، منابع تأمین بودجه، هر گونه تعارض منافع احتمالی، وابستگی  سازمانی پژوهشگر، و فواید و زیان‌هایی که انتظار می‌رود مطالعه در بر داشته باشد. هم‌چنین، هر آزمودنی باید بداند که می‌تواند هر لحظه که بخواهد از مطالعه خارج شود و باید درباره‌ی خطرات و زیان‌های بالقوه‌ی ناشی از ترک زودرس پژوهش آگاه و پشتیبانی شود. پژوهشگر هم‌چنین باید به تمامی سؤالات و دغدغه‌های این افراد، با حوصله و دقت پاسخ بدهد. این موارد باید در رضایت‌نامه‌ی آگاهانه منعکس شود.
14. پژوهشگر باید از آزادانه بودن رضایت اخذ شده اطمینان حاصل کند. رفتارهایی که به هر نحوی متضمن تهدید، اغوا، فریب و یا اجبار باشد موجب ابطال رضایت آزمودنی می‌شود. به فرد باید فرصت کافی برای مشاوره با افرادی که مایل باشد – نظیر اعضای فامیل یا پزشک خانواده - داده شود. هم‌چنین، در پژوهش‌هایی که پژوهشگر مقام سازمانی بالاتری نسبت به آزمودنی  داشته باشد، دلایل این شیوه‌ی جذب آزمودنی، باید توسط کمیته‌ی اخلاق  تأیید شود، در این موارد شخص ثالث و معتمدی باید رضایت را دریافت کند.
15. پژوهشگر ارشد مسؤول مستقیم ارائه‌ی اطلاعات کافی و به زبان قابل فهم برای آزمودنی ، اطمینان از درک اطلاعات ارائه شده، و اخذ رضایت آگاهانه است. در مواردی که بنا به‌دلیلی، نظیر زیاد بودن تعداد آزمودنی‌ها، این اطلاع‌رسانی از طریق شخص دیگری انجام می‌گیرد، این پژوهشگر ارشد است که مسؤول انتخاب فردی آگاه و مناسب برای این کار و حصول اطمینان از تأمین شرایط مذکور در این بند است.
16. در پژوهش‌هایی که از مواد بدنی (شامل بافت‌ها و مایعات بدن انسان)  یا داده‌هایی استفاده می‌شود که هویت صاحبان آن‌ها معلوم یا قابل کشف و ردیابی است، باید برای جمع‌آوری، تحلیل، ذخیره‎سازی و /یا استفاده‌ی مجدد از آن‌ها رضایت آگاهانه گرفته شود. در مواردی که اخذ رضایت غیرممکن باشد یا اعتبار پژوهش را خدشه‌دار کند، می‌توان در صورت بررسی مورد و تصویب کمیته‌ی اخلاق ، از داده‌ها یا مواد بدنی ذخیره شده، بدون اخذ رضایت آگاهانه استفاده کرد.
17. عدم قبول شرکت در پژوهش، یا ادامه ندادن به همکاری، نباید هیچ‌گونه تأثیری بر خدمات درمانی که در همان مؤسسه – نظیر بیمارستان – به فرد ارائه می‌شود، داشته باشد. این موضوع باید در فرایند اخذ رضایت آگاهانه، به آزمودنی اطلاع داده شود.
18. در مواردی که آگاه کردن آزمودنی درباره‌ی جنبه‌ای از پژوهش باعث کاهش اعتبار پژوهش می شود، ضرورت اطلاع‌رسانی ناکامل از طرف پژوهشگر باید توسط کمیته‌ی اخلاق تأیید شود. بعد از رفع عامل این محدودیت، باید اطلاع‌رسانی کامل به آزمودنی انجام گیرد.
19. اگر در حین اجرای پژوهش، آزمودنی دارای ظرفیت، ظرفیت خود را از دست بدهد یا آزمودنی فاقد ظرفیت، واجد ظرفیت شود، باید با توجه به تغییر حاصله، رضایت آگاهانه برای ادامه‌ی پژوهش از سرپرست قانونی یا خود فرد اخذ شود. 
20. پژوهشگر مسؤول رعایت اصل رازداری و حفظ اسرار آزمودنی‌ها و اتخاذ تدابیر مناسب برای جلوگیری از انتشار آن است. هم‌چنین، پژوهشگر موظف است که از رعایت حریم خصوصی آزمودنی‌ها در طول پژوهش اطمینان حاصل کند. هرگونه انتشار داده‌ها یا اطلاعات به‌دست آمده از بیماران باید بر اساس رضایت آگاهانه انجام گیرد.
21. هر نوع آسیب یا خسارت ناشی از شرکت در پژوهش باید بر طبق قوانین مصوب جبران خسارت شود. این امر باید در هنگام طراحی پژوهش لحاظ شده باشد. نحوه‌ی تحقق این امر ترجیحاً به‌صورت پوشش بیمه‌ای نامشروط باشد.
22. در پایان پژوهش، هر فردی که به‌عنوان آزمودنی به آن مطالعه وارد شده است، این حق را دارد که درباره‌ی نتایج مطالعه آگاه شود و از مداخلات یا روش‌هایی که سودمندی‌شان در آن مطالعه نشان داده شده است، بهره‌مند شود.
23. پژوهشگران موظفند که نتایج پژوهش‌های خود را صادقانه ، دقیق، و کامل منتشر کنند. نتایج، اعم از منفی یا مثبت، و نیز منابع تأمین بودجه، وابستگی  سازمانی، و تعارض منافع – در صورت وجود – باید کاملاً آشکارسازی شوند. پژوهشگران نباید در هنگام عقد قرارداد انجام پژوهش، هیچ  گونه شرطی را مبنی بر حذف یا عدم انتشار یافته‌هایی که از نظر حمایت کننده‌ی پژوهش  مطلوب نیست، بپذیرند.
24. نحوه‌ی گزارش نتایج پژوهش باید ضامن حقوق مادی و معنوی تمامی اشخاص مرتبط با پژوهش، از جمله خود پژوهشگر یا پژوهشگران، آزمودنی‌ها و مؤسسه‌ی حمایت کننده‌ی  پژوهش باشد.
25. گزارش‌ها و مقالات حاصل از پژوهش‌هایی که مفاد این راهنما را نقض کرده‌اند، نباید برای انتشار پذیرفته شوند.
26. روش پژوهش نباید با ارزش‌های احتماعی، فرهنگی و دینی  جامعه در تناقض باشد. راهنمای اخلاقی پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی در جمهوری اسلامی ایران

27. راهنمای عمومی

    1- پژوهشگر باید به این امر مهم توجه داشته باشد که بافت‌ها و اعضای مورد استفاده، دارای منشأ انسانی‌اند و کرامت انسانی اقتضا می‌کند که جمع‌آوری، نگه‌داری، استفاده و نابودسازی آن‌ها توأم با رعایت ملاحظات و شؤون مرتبط باشد.

    2- از اجزای بدنی دارای منشأ انسانی باید تنها در پژوهش‌هایی استفاده شود که اهداف ارزشمندی را در راستای مبارزه با بیماری‌ها و ارتقای سلامت انسان‌ها دنبال می‌کنند.

    3- تمامی پژوهش‌ها بر روی عضو و بافت انسانی، پیش از اجرا، باید مورد تأیید کمیته‌ی اخلاق در پژوهش مرتبط قرار گیرد. کمیته‌ی اخلاق در پژوهش حق دارد که در تمامی مراحل پژوهش بر آن نظارت داشته باشد. پژوهشگران باید در این زمینه با کمیته‌ی اخلاق در پژوهش همکاری کنند.

    4- رضایت آگاهانه‌ی فرد دهنده‌ی عضو یا بافت، یا جانشین قانونی او، شرط اساسی در تأیید اخلاقی هر پژوهش بر روی عضو و بافت انسانی است. رضایت‌نامه باید با رعایت تمامی اصول مرتبط تهیه و هنگام ارسال طرح‌نامه برای تصویب، به آن پیوست شده باشد.

    5- در مواردی که اخذ رضایت آگاهانه از دهنده‌ی نمونه‌ی ذخیره‌شده یا جانشین قانونی او امکان‌پذیر نباشد، به‌شرط وجود رضایت کلی اولیه بر استفاده‌ی پژوهشی، در صورت تأیید کمیته‌ی اخلاق در پژوهش می‌توان از آن نمونه برای پژوهش استفاده کرد. در چنین مواردی باید از نمونه‌هایی استفاده شود که به ‌نحو برگشت‌ناپذیر بی‌نام ‌شده باشد. ‌

    6- تمامی اطلاعاتی که از صاحبان عضو یا بافت مورد پژوهش، جمع‌آوری و ثبت می‌شود، راز حرفه‌ای تلقی می‌‌شود؛ از این ‌رو، تمامی اصول و ملاحظات مربوط به رازداری و حفظ حریم شخصی، باید در مورد آن‌ها مراعات شود.

    7- مرکز انجام دهنده‌ی پژوهش بر روی عضو و بافت باید مهارت و امکانات لازم برای حفظ رازداری را داشته باشد؛ در غیر این صورت، اطلاعات باید به شکل بی‌نام و غیرقابل ردیابی ثبت و ذخیره شود.

    8- پژوهشگر باید از اعضاء و بافت‌هایی که به منظور پژوهش در اختیار او قرار می‌گیرد استفاده‌ی بهینه کرده، از هدر رفتن آن‌ها جلوگیری کند

    9- پژوهشگر موظف است که تمهیدات لازم ایمنی، از جمله آزمون‌های غربالگری و وسایل محافظت‌کننده را برای جلوگیری از انتقال آلودگی از اجزای بدنی مورد استفاده به هر فرد دیگر، اعم از پژوهشگران، آزمودنی‌ها یا سایر افرادی که در فرایند پژوهش با این مواد سروکار خواهند داشت، پیش‌بینی و تأمین کند.

    10- پژوهش بر روی عضو و بافت ممکن است به ایجاد روش‌ها و محصولاتی منجر شود که به استفاده‌ی تجاری از آن‌ها بینجامد. حقوق مالکیت معنوی نتایج حاصل از این‌گونه پژوهش‌ها باید مورد تأیید و حمایت قرار گیرد. احتمال استفاده‌ی تجاری از نتایج پژوهش و اشخاصی که احتمالاً از آن منتفع خواهند شد باید در رضایت‌نامه‌آورده شود.

    11- زمان، نحوه و میزان اطلاع آزمودنی‌ها از نتایج پژوهش باید در رضایت‌نامه آورده شود. در هر حال، آزمودنی یا نماینده‌ی قانونی او باید به تمامی اطلاعاتی که در طول پژوهش درباره‌ی او به‌دست می‌آید، دسترسی داشته باشد.

    12- در صورت کمبود بافت یا عضو، باید استفاده‌های درمانی بر استفاده‌های پژوهشی اولویت داده شود. 

     

28.  

1. عدم همکاری بیماران که با توضیح بی خطر بودن، مشکل قابل حل است.
2. جمع آوری تعداد مورد نیاز نمونه زمان زیادی را می طلبد .که نیاز به صرف زمان زیادی دارد.

1.            Ghoyounchi R, Ahmadpour E, Spotin A, Mahami-Oskouei M, Rezamand A, Aminisani N, et al. Microsporidiosis in Iran: a systematic review and meta-analysis. Asian Pacific journal of tropical medicine. 2017;10(4):341-50.

2.            Weber R, Bryan RT, Owen RL, Wilcox CM, Gorelkin L, Visvesvara GS, et al. Improved light-microscopical detection of microsporidia spores in stool and duodenal aspirates. New England Journal of Medicine. 1992;326(3):161-6.

3.            Aldras AM, Orenstein JM, Kotler DP, Shadduck JA, Didier ES. Detection of microsporidia by indirect immunofluorescence antibody test using polyclonal and monoclonal antibodies. Journal of clinical microbiology. 1994;32(3):608-12.

4.            Bryan RT, Cali A, Owen RL, Spencer HC. Microsporidia: opportunistic pathogens in patients with AIDS. Progress in clinical parasitology. 1991;2:1.

5.            Dowd SE, Gerba CP, Pepper IL. Confirmation of the human-pathogenic microsporidia Enterocytozoon bieneusi, Encephalitozoon intestinalis, and Vittaforma corneae in water. Applied and environmental microbiology. 1998;64(9):3332-5.

6.            Rabeneck L, Gyorkey F, Genta RM, Gyorkey P, Foote LW, Risser JM. The role of microsporidia in the pathogenesis of HIV-related chronic diarrhea. Annals of Internal Medicine. 1993;119(9):895-9.

7.            Ghorbanzadeh B, Sadraei J, Emadi H. Diagnosis of Cryptosporidium and intestinal Microsporidia in HIV/AIDS patients with staining and PCR methods on 16srRNA gen. 2012.

8.            Assefa S, Erko B, Medhin G, Assefa Z, Shimelis T. Intestinal parasitic infections in relation to HIV/AIDS status, diarrhea and CD4 T-cell count. BMC infectious diseases. 2009;9(1):155.

9.            Slodkowicz-Kowalska A, Graczyk TK, Tamang L, Jedrzejewski S, Nowosad A, Zduniak P, et al. Microsporidian species known to infect humans are present in aquatic birds: implications for transmission via water? Applied and environmental microbiology. 2006;72(7):4540-4.

10.          da Silva AJ, Schwartz DA, Visvesvara GS, De Moura H, Slemenda SB, Pieniazek NJ. Sensitive PCR diagnosis of Infections by Enterocytozoon bieneusi (microsporidia) using primers based on the region coding for small-subunit rRNA. Journal of clinical microbiology. 1996;34(4):986-7.

11.          Wiwanitkit V. Intestinal parasitic infections in Thai HIV-infected patients with different immunity status. BMC gastroenterology. 2001;1(1):3.

12.          Obermeyer CM. HIV in the Middle East. Bmj. 2006;333(7573):851-4.

13.          Mirjalali H, Mohebali M, Mirhendi H, Gholami R, Keshavarz H, Meamar AR, et al. Emerging intestinal microsporidia infection in HIV+/AIDS patients in Iran: microscopic and molecular detection. Iranian journal of parasitology. 2014;9(2):149.

14.          Gharibi Z, Daadras F, Maghsood M, Fallah M, Saeedijam M. Identification of Intestinal Microsporidia by Trichrome Staining and Calcofluor White Methods among Kidney-Transplanted Patients in Hamadan. Medical Laboratory Journal. 2014;7(4):47-52.

15.          Tabatabaie.F MF. Comparison of microsporidiosis distribution in clinical samples of immunocompromised patients and healthy persons in Tehran (2010-2011). Quarterly Journal of Sabzevar University of Medical Sciences,. 2014;21(5):885-93.

16.          Nooshadokht M, Sharifi I, Mohammadi MA, Pirestani M, Afgar A, Mahootchi A, et al. Intestinal microsporidiosis in Iran: infection in immune-compromised and immunocompetent patients. Current medical mycology. 2017;3(1):30.

17.          Tavalla M, Mardani-Kateki M, Abdizadeh R, Soltani S, Saki J. Molecular diagnosis of potentially human pathogenic Enterocytozoon bieneusi and Encephalitozoon species in exotic birds in Southwestern Iran. Journal of infection and public health. 2017.

18.          Kazemi E, Tavalla M, Maraghi S, Yad MJ, Latifi M. Frequency of microsporidial infection in immunocompromised patients with staining and molecular methods based on internal transcribed spacer region gene in two cities of southwest Iran during 2013-2014. Asian Journal of Pharmaceutical Research and Health Care. 2016;9(1):7-16.

19.          Florez A, Garcia D, Moncada L, Beltran M. Prevalence of microsporidia and other intestinal parasites in patients with HIV infection, Bogota, 2001. Biomedica: revista del Instituto Nacional de Salud. 2003;23(3):274-82.

20.          Wesolowska M, Szetela B, Kicia M, Kopacz Z, Szymczak A, Sak B, et al. Microsporidia prevalence among HIV/AIDS patients in Lower Silesia, Poland. Annals of Parasitology. 2016;62(Suppl.).

21.          Wang Z-D, Liu Q, Liu H-H, Li S, Zhang L, Zhao Y-K, et al. Prevalence of Cryptosporidium, microsporidia and Isospora infection in HIV-infected people: a global systematic review and meta-analysis. Parasites & vectors. 2018;11(1):28.

22.          Aissa S, Chabchoub N, Abdelmalek R, Kanoun F, Goubantini A, Ammari L, et al. Asymptomatic intestinal carriage of microsporidia in HIV-positive patients in Tunisia: prevalence, species, and pathogenesis. Medecine et sante tropicales. 2017;27(3):281-5.

23.          Liu H, Jiang Z, Yuan Z, Yin J, Wang Z, Yu B, et al. Infection by and genotype characteristics of Enterocytozoon bieneusi in HIV/AIDS patients from Guangxi Zhuang autonomous region, China. BMC infectious diseases. 2017;17(1):684.

بررسی بیماری 

خونگیری ندارد

توجیه بیماران در انجام نمونه گیری

ندارد

ندارد

چنانچه در طرح تحقیقاتی اقدام تشخیصی یا درمانی انجام شود، هزینه به عهده مجری یا مجریان طرح خواهد بود و بیمار هزینه ای را پرداخت نخواهد کرد

در صورت عدم پذیرش روش انتخابی پژوهشگر، بیمار از چه روشهای درمانی یا تشخیصی دیگرتوسط پژوهشگر می تواند استفاده نماید.

تایج آزمایشها و روشهای به کار رفته به اطلاع بیمار خواهد رسید و این نتایج بصورت کاملاً محرمانه و صرفاً جهت مقاصد پژوهش به کار خواهد رفت و هویت بیماری وی در چارچوب قانون و جامعه و خانواده محرمانه خواهد ماند.

آدرس و شماره تلفن تماس مجری یا مجریان طرح در اختیار بیمارقرار داده شود تا وی در هر زمانی که مایل بود بتواند پرسشهای خود را در مورد روشهای به کار رفته جهت تشخیص یا درمان وی یا بروز عوارض احتمالی آن روشها مطرح و مشاوره دریافت نماید.

شرکت من در مطالعه کاملاً اختیاری است و آزاد خواهم بود که از شرکت در مطالعه امتناع نموده یا هر زمان  که مایل بودم بدون آنکه تغییری در نحوه رفتار پزشک درمانگر یا نحوه درمان و مراقبت از بیماری اینجانب ایجاد شود از پژوهش مذکور خارج شوم.

رضایت از بیمارن برابر برگه رضایت گرفته خواهد شد

مشخصات فردی:                                                                              تاریخ:

کد بیمار:

1. نام و نام خانوادگی: .........

2. جنسیت: زن            مرد

3. سن بر حسب سال؟  .........

4. آیا مایلید از شما نمونهگرفته شود؟ بلی             خیر

5. نوع آب مصرفی شما 

لوله کشی                 چاه             و یا ........ ................. می باشد .

6. نتیجه رنگ آمیزی  :          مثبت منفی 

7. نتیجه Nested-PCR : مثبت                         منفی